周 軍 李立恒 張 敏

（1.張家口市第一醫(yī)院口腔科，河北 張家口 075000；2.河北北方學院附屬第一醫(yī)院口腔科，河北 張家口 075000；3.張家口學院臨床學院，河北 張家口 075000）

口腔腺樣囊性癌（adenoid cystic carcinoma，ACC）是口腔頜面部惡性腫瘤中較為常見的一種惡性腫瘤，患者預(yù)后較差[1]。微小RNA（microRNA，miRNA）表達、炎癥反應(yīng)、免疫功能等異常均與ACC發(fā)病有關(guān)[2-3]。miRNA可調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和表達，其在ACC中表達失調(diào)，與ACC疾病進展和預(yù)后相關(guān)[4]。miR-24-3p是miR-24的成員之一，可通過調(diào)節(jié)有關(guān)蛋白表達在淚腺ACC中發(fā)揮抑癌作用[5]。唾液腺ACC患者X染色體連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）表達上調(diào)，可作為唾液腺ACC預(yù)后評估的生物標志物[6]。目前，miR-24、XIAP在口腔ACC中的表達及其與患者預(yù)后的關(guān)系鮮有報道。本研究擬探討miR-24與XIAP的相關(guān)性，及其與ACC患者預(yù)后的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 一般資料

選取2010年6月-2016年2月張家口市第一醫(yī)院行切除術(shù)治療的口腔ACC患者60例（口腔ACC組），其中男24例、女36例，年齡（57.66±13.38）歲；＜60歲35例，≥60歲25例；腫瘤直徑＜4 cm 33例，≥4 cm 27例；淋巴轉(zhuǎn)移31例，無淋巴轉(zhuǎn)移29例；發(fā)生神經(jīng)侵襲30例，無侵襲30例。納入標準：1）符合《涎腺基底細胞腺瘤與腺樣囊性癌的病理診斷及鑒別診斷》[7]中有關(guān)ACC的診斷標準，經(jīng)病理學檢查確診；2）具備完整的病理學檢查資料；3）術(shù)前未進行放療、化療等抗腫瘤治療。排除標準：1）合并其他惡性腫瘤者；2）失訪者。另選取同期張家口市第一醫(yī)院體檢健康者60名作為正常對照組，其中男29名、女31名，年齡（57.92±13.74）歲?？谇籄CC組、正常對照組年齡和性別差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)張家口市第一醫(yī)院倫理委員會批準（2023110），所有研究對象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集和樣本采集

收集所有患者臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移情況、神經(jīng)侵襲情況。采集所有研究對象靜脈血4～5 mL，靜置25～30 min，4 ℃ 800×g離心10 min，分離血清，-80 ℃保存。收集術(shù)中獲取的癌組織和癌旁組織（距腫瘤組織邊緣≥5 cm），-80 ℃保存。

1.2.2 血清和組織樣本miR-24、XIAPmRNA檢測

采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測血清和組織中miR-24、XIAP表達。采用TRIzol試劑盒（批號15596-026，美國Invitrogen公司）提取總RNA，采用M-MLV First Strand cDNA Synthesis Kit（批號TQ2501-01，美國Omega公司）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用7500Fast實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）和Perfectstart SYBR Green qPCR master mix（批號TQ2300-01，美國Omega公司）進行檢測。miR-24、XIAP引物序列見表1。反應(yīng)條件：97 ℃預(yù)熱5 min；94 ℃變性30 s，64 ℃退火30 s，40個循環(huán)。miR-24、XIAP分別以U6、GAPDH為內(nèi)參。以2-ΔΔCt法計算miR-24、XIAPmRNA的相對表達量。

1.3 隨訪

對所有患者進行門診或電話隨訪，以手術(shù)次日為隨訪起點，隨訪截至2021年2月或患者死亡，隨訪時間為9～60個月。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示，2個組之間比較采用t檢驗。計數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Pearson相關(guān)分析評估m(xù)iR-24與XIAP的相關(guān)性。采用Kaplan-Meier生存曲線和Log-rankχ2檢驗分析血清miR-24、XIAP與口腔ACC患者預(yù)后的關(guān)系。采用Cox回歸分析評估影響口腔ACC患者預(yù)后的危險因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 口腔ACC組和正常對照組血清miR-24、XIAP mRNA相對表達量比較

口腔ACC組血清miR-24相對表達量為0.54±0.20，顯著低于正常對照組（1.05±0.33）（t=10.238，P＜0.05）；XIAPmRNA相對表達量為1.78±0.59，顯著高于正常對照組（1.02±0.32）（t=8.771，P＜0.05）。見圖1。

圖1 口腔ACC組和正常對照組血清miR-24、XIAP mRNA相對表達量比較

2.2 癌組織與癌旁組織miR-24、XIAP mRNA相對表達量比較

癌組織相對表達量為0.63±0.17，顯著低于癌旁組織（1.01±0.29）（t=8.756，P＜0.05）；XIAPmRNA相對表達量為1.59±0.48，顯著高于癌旁組織（1.00±0.30）（t=8.074，P＜0.05）。見圖2。

圖2 口腔ACC患者癌組織和癌旁組織miR-24、XIAP mRNA相對表達量比較

2.3 不同血清miR-24表達水平口腔ACC患者臨床病理特征比較

以口腔ACC患者血清miR-24相對表達量均值（0.54）為臨界值，分為miR-24高表達（＞0.54）組和miR-24低表達（≤0.54）組。miR-24低表達組神經(jīng)侵襲和淋巴轉(zhuǎn)移患者例數(shù)顯著多于miR-24高表達組（P＜0.05），其他指標2個組之間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同血清miR-24表達水平口腔ACC患者臨床病理特征比較 例

2.4 不同血清XIAP mRNA表達水平口腔ACC患者臨床病理特征比較

以口腔ACC患者血清XIAPmRNA相對表達量均值（1.78）為臨界值，分為XIAP高表達（＞1.78）組和XIAP低表達（≤1.78）組。XIAP高表達組神經(jīng)侵襲和淋巴轉(zhuǎn)移患者例數(shù)顯著多于XIAP低表達組（P＜0.05），其他指標2個組之間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 不同血清XIAP mRNA表達水平口腔ACC患者臨床病理特征比較 例

2.5 口腔ACC患者血清miR-24與XIAP mRNA的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，口腔ACC患者血清miR-24與XIAPmRNA呈負相關(guān)（r=-0.486，P＜0.05）。見圖3。

圖3 口腔ACC患者血清miR-24與XIAP mRNA的相關(guān)性

2.6 不同miR-24、XIAP mRNA表達各組生存情況比較

隨訪結(jié)果顯示，60例口腔ACC患者死亡28例，存活32例。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，miR-24低表達組生存時間為10～60個月，平均為46.78個月；miR-24高表達組生存時間為20～60個月，平均為56.18個月。miR-24低表達組累積生存率顯著低于miR-24高表達組（Logrankχ2=7.212，P=0.007），見圖4。XIAP低表達組生存時間為20～60個月，平均為57.00個月；XIAP高表達組生存時間為10～60個月，平均為45.71個月。XIAP低表達組累積生存率高于XIAP高表達組（Log-rankχ2=8.568，P=0.003），見圖5。

圖4 miR-24低表達組和miR-24高表達組Kaplan-Meier生存曲線

圖5 XIAP低表達組和XIAP高表達組Kaplan-Meier生存曲線

2.7 影響口腔ACC患者預(yù)后的危險因素分析

單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，淋巴轉(zhuǎn)移、有神經(jīng)侵襲、XIAPmRNA高表達是口腔ACC患者預(yù)后不良的危險因素（P＜0.05），miR-24高表達是口腔ACC患者預(yù)后的保護因素（P＜0.05）。多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，有神經(jīng)侵襲、XIAPmRNA高表達是口腔ACC患者預(yù)后不良的獨立危險因素（P＜0.05），miR-24高表達是口腔ACC患者預(yù)后的獨立保護因素（P＜0.05）。見表4。

表4 影響口腔ACC患者預(yù)后的Cox回歸分析

3 討論

口腔ACC是臨床較為常見的惡性腫瘤，以腭部小涎腺最為多見，腮腺次之，其可侵襲周圍組織，通過血源性途徑發(fā)生遠隔轉(zhuǎn)移[8]。臨床多采用以手術(shù)為主的綜合治療方法治療口腔ACC，但因其常發(fā)生局部轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)，造成患者術(shù)后生存率較低[9]。因此，尋找ACC發(fā)病相關(guān)因素，及時干預(yù)，對延長口腔ACC患者生存期有積極意義。

miRNA可調(diào)控機體生長發(fā)育、信號傳導、免疫平衡、細胞增殖、侵襲、凋亡、炎癥反應(yīng)等生物學過程，可作為鼻咽癌、食管癌、口腔癌的診治靶標[10-12]。相關(guān)研究結(jié)果顯示，miR-455-3p在唾液腺ACC組織中相對表達量明顯升高，可能在ACC的發(fā)生、發(fā)展中起重要調(diào)節(jié)作用，miR-455-3p可作為診斷唾液腺ACC的輔助指標[13]。體外研究結(jié)果顯示，miR-9可通過影響蛋白激酶B（protein kinase B，PKB；又稱Akt）信號通路調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶2和基質(zhì)金屬蛋白酶9表達，從而影響涎腺ACC的侵襲能力[14]。以上研究提示，異常表達的miRNA與各類ACC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有研究結(jié)果顯示，miR-24在口腔鱗狀細胞癌患者血漿中表達失調(diào)，具有輔助診斷口腔鱗狀細胞癌的潛在價值[15]。此外，王川寧等[16]的研究結(jié)果顯示，miR-24-3p在涎腺ACC中呈低表達，低表達的miR-24-3p可促進涎腺ACC細胞的增殖和侵襲，促進涎腺ACC的發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，口腔ACC患者血清miR-24水平低于正常對照者（P＜0.05），癌組織miR-24相對表達量低于癌旁組織（P＜0.05），提示miR-24可能在口腔ACC發(fā)展中起重要作用，低水平miR-24可能通過調(diào)控信號傳導和有關(guān)通路蛋白表達來促進口腔ACC細胞增殖、侵襲，進而促進口腔ACC的發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)，剪切和激活的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（cysteine-containing aspartate-specific protease，Caspase）是細胞凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)器，而XIAP是有效的Caspase抑制劑[17]。XIAP可通過磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/Akt和核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）途徑抑制細胞凋亡[18]。吳勝利等[19]的研究結(jié)果顯示，XIAP在口腔鱗癌中呈異常表達，與口腔鱗狀細胞癌局部淋巴轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)，XIAP可能在口腔鱗癌淋巴轉(zhuǎn)移過程中起促進作用[19]。另有研究結(jié)果顯示，XIAP在頭頸鱗狀細胞癌中表達失調(diào)，與患者預(yù)后密切相關(guān)[20]。以上研究均提示，XIAP表達失調(diào)與惡性腫瘤的發(fā)展有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，口腔ACC組血清XIAPmRNA相對表達量顯著高于正常對照組（P＜0.05），癌組織XIAP相對表達量高于癌旁組織，提示XIAP可能與口腔ACC發(fā)生有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，口腔ACC患者血清miR-24、XIAPmRNA相對表達量與淋巴轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵襲有關(guān)，提示miR-24、XIAP可能參與了口腔ACC的發(fā)展。有研究結(jié)果顯示，miR-24可通過靶向結(jié)合XIAP影響膿毒癥誘導的心肌損傷，且二者均參與了NF-κB的級聯(lián)反應(yīng)[18，21-22]。本研究結(jié)果顯示，口腔ACC患者血清miR-24與XIAP呈負相關(guān)（r=-0.486，P＜0.05），提示miR-24可能與XIAP相互作用，協(xié)同影響口腔ACC的病理過程。綜合本研究結(jié)果和文獻研究結(jié)果，推測miR-24可能是通過與XIAP結(jié)合來影響PI3K/Akt信號通路、NF-κB途徑，進而通過抑制Caspase表達來抑制癌細胞凋亡，促進口腔ACC發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，miR-24低表達組、XIAP高表達組累積生存率均低于miR-24高表達組、XIAP低表達組（P＜0.05），提示miR-24、XIAP可能與口腔ACC患者預(yù)后密切相關(guān)，或可作為評估口腔ACC患者預(yù)后的潛在指標。此外，本研究結(jié)果還顯示，有神經(jīng)侵襲，血清XIAPmRNA高表達、miR-24低表達均會增加口腔ACC患者發(fā)生不良預(yù)后的風險，因此及時監(jiān)測血清miR-24、XIAP水平，判定淋巴轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵襲情況，有助于改善口腔ACC患者的預(yù)后。

綜上所述，口腔ACC患者血清miR-24表達下調(diào)，XIAP表達上調(diào)，與患者預(yù)后密切相關(guān)，或可作為評估口腔ACC患者預(yù)后的潛在指標。后期仍需深入研究miR-24、XIAP在口腔ACC中的具體作用機制和二者相互影響的機制。