白 偉 王 斌 郭甲瑞 朱光譜 朱麗艷

（1.焦作市第二人民醫(yī)院骨科，河南 焦作 454000；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南 鄭州 450001）

骨肉瘤是骨科常見的惡性腫瘤，好發(fā)于兒童和青少年，發(fā)病率約為3/100萬，患者預(yù)后差，病死率高[1]。雖然近年來臨床診療技術(shù)有了長足的進步，延長了骨肉瘤患者的生存時間，但發(fā)生轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者5年總體生存率依然較低，侵襲和轉(zhuǎn)移仍然是導(dǎo)致患者死亡的主要因素[2]。有研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄因子異常表達與多種惡性腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、浸潤等過程密切相關(guān)[3]。前B淋巴細胞白血病轉(zhuǎn)錄因子（pre-B-cell leukemia transcription factor 1，PBX1）是同源盒基因家族成員之一，可通過發(fā)揮核轉(zhuǎn)錄因子功能參與胚胎發(fā)育和組織分化過程[4]，同時還參與了骨形成過程[5]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，PBX1還可發(fā)揮癌基因功能，參與了乳腺癌[6]、前列腺癌[7]等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。為此，本研究擬探討骨肉瘤組織PBX1基因和蛋白表達與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性和對患者預(yù)后的影響。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2013年1月-2016年1月焦作市第二人民醫(yī)院行手術(shù)治療的骨肉瘤患者85例，其中男49例、女36例，年齡（22.16±8.25）歲，術(shù)前均未行放、化療治療，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查確診。其中，股骨、脛骨腫瘤患者52例，其他部位腫瘤患者33例；成骨細胞型41例，成纖維細胞型17例，成軟骨細胞型16例，混合型11例；Enneking分期Ⅰ～ⅡA期36例，ⅡB～Ⅲ期49例；發(fā)生遠隔轉(zhuǎn)移42例。本研究經(jīng)焦作市第二人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集和臨床資料收集

術(shù)中留取骨肉瘤組織和距腫瘤邊緣＞5 cm的正常骨組織，一部分組織樣本用甲醛固定，石蠟包埋保存，另一部分于液氮中速凍，-70 ℃保存?zhèn)溆?。收集所有患者的臨床資料，包括性別、年齡、腫瘤部位、組織學(xué)類型、腫瘤大小、Enneking分期、是否有遠隔轉(zhuǎn)移。

1.2.2 免疫組化法檢測組織中PBX1蛋白表達

取石蠟包埋樣本，連續(xù)切片、烤片、脫蠟、抗原修復(fù)，采用3%過氧化氫溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶，滴加10%山羊血清，37 ℃封閉15 min。滴加一抗兔抗人PBX1抗體（美國Abcam公司，1∶800稀釋），4 ℃過夜孵育，磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）沖洗3次，加入生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃反應(yīng)20 min，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB；上海研謹(jǐn)生物科技有限公司）顯色，蘇木素（美國Sigma公司）復(fù)染，梯度乙醇脫水，透明、封片，用PBS替代一抗作為陰性對照。顯微鏡下觀察，隨機取5個高倍視野進行觀察。PBX1蛋白主要表達于細胞核中，少量存在于細胞質(zhì)。根據(jù)陽性細胞比例和染色強度進行評分[8]。陽性細胞比例：＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。染色強度：無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。最終得分為二者的乘積，0分為陰性，≥1分為陽性。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測組織PBX1 mRNA表達

取骨肉瘤組織和正常骨組織，剪碎，加入細胞裂解液，采用總RNA提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）提取總RNA，采用NanoDrop One分光光度計（北京龍躍生物科技發(fā)展有限公司）檢測其純度和濃度，以A260nm/A280nm＞1.80為合格。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海索寶生物科技有限公司）將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用LightCycler 480Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR儀（瑞士羅氏公司）和Realtime PCR定量試劑盒（上海索寶生物科技有限公司）進行PCR擴增。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PBX1上游引物為5'-GAGACGGAATTTCAACAAGCA-3'，下游引物為5'-GTTTGATACCTGGGAGACTG-3'；內(nèi)參基因GAPDH上游引物為5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3'，下游引物為5'-GCCCAATACGACCAAATCC-3'。反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，76 ℃30 s，38個循環(huán)。用2-ΔΔCt法計算PBX1 mRNA相對表達量。

1.2.4 隨訪

從術(shù)后第1天開始對所有患者進行隨訪，包括住院期間的查房和出院后的門診復(fù)查、電話隨訪和病歷追蹤。隨訪時間為5年，隨訪終點事件為患者死亡，記錄患者總生存時間和5年生存率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示，2個組之間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。計數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier生存曲線和Log-rankχ2檢驗分析骨肉瘤患者的生存情況。采用Cox比例風(fēng)險回歸分析評估影響患者預(yù)后的危險因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤組織和正常骨組織PBX1蛋白表達

骨肉瘤組織PBX1蛋白陽性比較率為74.12%（63/85），顯著高于正常骨組織[23.53%（20/85）]（χ2=43.530，P＜0.001）。見圖1。

圖1 骨肉瘤組織和正常骨組織PBX1蛋白表達（×200）

2.2 骨肉瘤組織和正常骨組織PBX1 mRNA相對表達量比較

骨肉瘤組織PBX1 mRNA相對表達量為2.61±0.24，高于正常骨組織（1.00±0.10）（t=58.044，P＜0.001）。

2.3 不同臨床病理特征骨肉瘤患者腫瘤組織PBX1表達差異

Enneking分期ⅡB～Ⅲ期和發(fā)生遠隔轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者腫瘤組織PBX1蛋白陽性率和mRNA相對表達量分別高于Enneking分期Ⅰ～ⅡA期和無遠隔轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者（P＜0.05）。不同性別、年齡、腫瘤部位、組織學(xué)類型和腫瘤大小的骨肉瘤患者腫瘤組織中PBX1蛋白陽性率和mRNA相對表達量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同臨床病理特征骨肉瘤患者腫瘤組織PBX1表達比較

2.4 骨肉瘤患者生存情況分析

85例骨肉瘤患者均完成隨訪，隨訪時間為5～60個月，中位隨訪時間為28個月。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，PBX1蛋白陽性患者生存時間為（29.44±2.06）個月，5年生存率為17.46%，均低于PBX1蛋白陰性患者[（48.86±3.48）個月，63.64%]（Log-rankχ2=15.092，P＜0.001）。見圖2。

圖2 PBX1蛋白陽性組和陰性組生存情況分析

2.5 影響骨肉瘤患者生存期的危險因素分析

Cox比例風(fēng)險回歸分析結(jié)果顯示，Enneking分期ⅡB～Ⅲ期、發(fā)生遠隔轉(zhuǎn)移和PBX1蛋白陽性是影響骨肉瘤患者生存期的危險因素[風(fēng)險比（hazard ratio，HR）分別為2.861、2.244和2.361，95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）分別為1.204～6.799、1.047～4.814和1.258～5.265]。見表2。

表2 影響骨肉瘤患者生存期的危險因素分析

3 討論

骨肉瘤是一種起源于間葉組織的惡性程度較高的腫瘤，侵襲性強，易早期發(fā)生轉(zhuǎn)移。PBX1是一種同源盒基因家族成員，可作為轉(zhuǎn)錄因子參與機體的發(fā)育過程、干細胞編碼和干性維持。有研究發(fā)現(xiàn)，多種惡性腫瘤組織PBX1表達異常[8-9]。LIU等[10]發(fā)現(xiàn)，抑制PBX1表達可誘導(dǎo)前列腺癌細胞凋亡。LIN等[11]發(fā)現(xiàn)，在急性白血病中，PBX1同源域通過t（1；19）染色體異位轉(zhuǎn)化為嵌合E2A-PBX1癌蛋白擁有致癌活性。下調(diào)PBX1可能通過PBX1/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通路，增加食管鱗狀細胞癌細胞的放射敏感性[12]。本研究結(jié)果顯示，骨肉瘤組織PBX1蛋白陽性率和mRNA相對表達量均高于正常骨組織（P＜0.001），說明骨肉瘤組織PBX1蛋白和基因均呈高表達，PBX1可能作為癌基因參與了骨肉瘤的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，Enneking分期ⅡB～Ⅲ期和發(fā)生遠隔轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者腫瘤組織PBX1蛋白陽性率和mRNA相對表達量均顯著升高，進一步說明PBX1可能參與了骨肉瘤的發(fā)展。

本研究結(jié)果還顯示，PBX1蛋白陽性骨肉瘤患者生存時間和5年生存率均低于PBX1蛋白陰性患者（P＜0.001），提示PBX1蛋白與骨肉瘤患者預(yù)后密切相關(guān)。本研究Cox比例風(fēng)險回歸分析結(jié)果顯示，Enneking分期ⅡB～Ⅲ期、發(fā)生遠隔轉(zhuǎn)移和PBX1蛋白陽性表達是影響骨肉瘤患者生存期的危險因素。PBX1蛋白或可作為骨肉瘤預(yù)后評估的潛在生物標(biāo)志物。

綜上所述，骨肉瘤組織PBX1蛋白陽性表達率和mRNA表達量顯著升高，且與Enneking分期和遠隔轉(zhuǎn)移有關(guān)，或可作為骨肉瘤患者早期診療和預(yù)后評估潛在的生物標(biāo)志物，其具體作用機制還有待進一步研究。