徐镠粵 廖慶華 彭柯皓 余美玲 陳燕梅 卓文基 賴曉宇

（廣東省結(jié)核病控制中心，廣東 廣州 610630）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的慢性傳染病，嚴(yán)重危害公共健康，患者除頭發(fā)、指甲外，全身各個(gè)器官和系統(tǒng)均可受累，以肺部感染為主。據(jù)《全球結(jié)核病報(bào)告》[1]顯示，2020年全球新發(fā)結(jié)核病病例987萬(wàn)例，較往年有所緩解；我國(guó)作為結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，僅次于印度，發(fā)病例數(shù)居全球第二位（8.5%），原因主要是新型結(jié)核病診斷技術(shù)的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用進(jìn)度緩慢，新型抗結(jié)核藥物匱乏。目前，結(jié)核病的微生物學(xué)診斷方法有抗酸染色鏡檢、MTB分離培養(yǎng)和體外藥物敏感性試驗(yàn)等，其中抗酸染色鏡檢是我國(guó)基層結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)核病的重要方法，也是較為經(jīng)濟(jì)的選擇，但其影響因素較多，敏感性較差，部分感染患者不能被及時(shí)發(fā)現(xiàn)。因此，開(kāi)發(fā)快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、低成本的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷方法非常重要。

核酸適配體是一段寡核苷酸序列（DNA或RNA），是從1個(gè)體外合成的隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)中，通過(guò)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）篩選到的與靶物質(zhì)特異性結(jié)合的一簇小分子單鏈DNA或RNA片段[2]。適配體具有可體外人工合成、高特異性、高親和力、高敏感性，以及作用的靶分子范圍極廣等特點(diǎn)[3]。本研究中的核酸適配體熒光探針?lè)ㄊ菑V東省結(jié)核病控制中心和有關(guān)企業(yè)共同研發(fā)的一種新的MTB鏡檢方法，目前尚處于實(shí)驗(yàn)階段。液基夾層杯法與傳統(tǒng)的抗酸染色鏡檢法最大的區(qū)別在于具有消化富集特點(diǎn)，能夠有效提高檢出率[4]。本研究擬評(píng)估液基夾層杯法和核酸適配體熒光探針?lè)ㄔ谂R床診斷結(jié)核病中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2 0 2 1年3-5月東莞市第六人民醫(yī)院175例臨床確診為肺結(jié)核的住院患者（肺結(jié)核組），其中男1 0 3 例、女7 2 例，年齡（43.6±10.3）歲。另選取80名健康體檢者為對(duì)照組，其中男46名、女34名，年齡（40.8±9.6）歲。留取所有研究對(duì)象3份痰液樣本（清晨痰、即時(shí)痰和夜間痰，均為用藥前留?。?，將3份痰液樣本混勻后，分別用液體培養(yǎng)法、固體培養(yǎng)法、抗酸染色鏡檢法、液基夾層杯法和核酸適配體熒光探針?lè)ㄟM(jìn)行檢測(cè)。肺結(jié)核診斷符合《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS288-2017）》要求[5]。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）長(zhǎng)期接受糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑治療；2）伴心臟、肝臟、腎臟疾??；3）惡性腫瘤患者。本研究經(jīng)廣東省結(jié)核病控制中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（20211129），所有受試者或其家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 液體培養(yǎng)法

將痰液樣本用NALC-NaOH混合溶液（批號(hào)C12157777，上海麥克林生化科技有限公司）消化離心后，棄上清，用磷酸鹽緩沖液（批號(hào)112520210408，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）重懸，加入含有MGIT PANTA和MGIT生長(zhǎng)添加劑（批號(hào)1042610，美國(guó)BD公司）的培養(yǎng)管中，使用BACTECTM MGIT 960液體培養(yǎng)系統(tǒng)（美國(guó)BD公司）進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果系統(tǒng)直接報(bào)告；培養(yǎng)陰性，42 d（6周）后報(bào)告結(jié)果。

1.2.2 固體培養(yǎng)法

將痰液樣本用4%氫氧化鈉消化15 min，接種于羅氏固體培養(yǎng)基（批號(hào)20211122，珠海貝索生物技術(shù)有限公司），于37 ℃溫箱中孵育，持續(xù)觀察菌株生長(zhǎng)情況，如56 d（8周）后培養(yǎng)基無(wú)菌落生長(zhǎng)，則報(bào)告為陰性。

1.2.3 液基夾層杯法

將痰液樣本用消化液（批號(hào)201201，湖南天騎醫(yī)學(xué)新技術(shù)股份有限公司）充分混勻后放置30～60 min，至消化完全。取2 mL消化好的樣本，加入已預(yù)熱濕膜后的夾層杯中，使用痰自動(dòng)涂片染色機(jī)（湖南天騎醫(yī)學(xué)新技術(shù)股份有限公司）進(jìn)行抗酸染色，烘干，油鏡下觀察。

1.2.4 核酸適配體熒光探針?lè)?/p>

將痰液樣本用4%氫氧化鈉消化15 min，加入蛋白酶K溶液，酶解后離心去上清，加入核酸適配體熒光探針，磷酸鹽緩沖液溫和振蕩孵育后離心去上清，用磷酸鹽緩沖液重懸，涂片鏡檢。MTB鏡下呈現(xiàn)桿狀綠色熒光（圖1）。

圖1 核酸適配體熒光探針?lè)?yáng)性涂片

1.2.5 抗酸染色鏡檢法

將痰液樣本直接涂布于載玻片上，用抗酸染色液（批號(hào)C210401，珠海貝索生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行染色，自然干燥，油鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Kappa一致性檢驗(yàn)進(jìn)行一致性分析，采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，R O C）曲線評(píng)價(jià)核酸適配體熒光探針?lè)ㄔ\斷肺結(jié)核的效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺結(jié)核組和對(duì)照組5種方法檢測(cè)結(jié)果

對(duì)照組中，抗酸染色鏡檢法和核酸適配體熒光探針?lè)ǚ謩e檢出1例和3例陽(yáng)性，其他方法均為陰性。5種方法檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 肺結(jié)核組和對(duì)照組5種方法檢測(cè)結(jié)果 例

2.2 核酸適配體熒光探針?lè)ㄔ\斷價(jià)值

以液體培養(yǎng)法為參考標(biāo)準(zhǔn)，核酸適配體熒光探針?lè)ǖ拿舾行詾?4.79%、特異性為50.98%、準(zhǔn)確度為52.57%、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為44.44%、陰性預(yù)測(cè)值為61.68%。一致性分析結(jié)果顯示，核酸適配體熒光探針?lè)ㄅc液體培養(yǎng)法、抗酸染色鏡檢法一致性較差（P＞0.05）；見(jiàn)表2、表3。ROC曲線分析結(jié)果顯示，以液體培養(yǎng)法為參考，核酸適配體熒光探針?lè)ㄔ\斷肺結(jié)核的曲線下面積為0.529，95%可信區(qū)間為0.442～0.616，P=0.515；以抗酸染色鏡檢法為參考，核酸適配體熒光探針?lè)ㄔ\斷肺結(jié)核的曲線下面積為0.506，95%可信區(qū)間為0.420～0.591，P=0.899。

表2 核酸適配體熒光探針?lè)ㄅc液體培養(yǎng)法比較 例

表3 核酸適配體熒光探針?lè)ㄅc抗酸染色鏡檢法比較例

2.3 液基夾層杯法診斷價(jià)值

以液體培養(yǎng)法結(jié)果為參考，液基夾層杯法的敏感性為78.08%、特異性為98.04%、準(zhǔn)確度為89.71%、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為96.61%、陰性預(yù)測(cè)值為86.21%。一致性分析結(jié)果顯示，液基夾層杯法與液體培養(yǎng)法、抗酸染色鏡檢法一致性較好（P＜0.001）。見(jiàn)表4、表5。

表4 液基夾層杯法與液體培養(yǎng)法比較 例

表5 液基夾層杯法與抗酸染色鏡檢法比較 例

ROC曲線分析結(jié)果顯示，以液體培養(yǎng)法為參考，液基夾層杯法診斷肺結(jié)核的曲線下面積為0.881，95%可信區(qū)間為0.821～0.940，P＜0.001；以抗酸染色鏡檢法為參考，液基夾層杯法斷肺結(jié)核的曲線下面積為0.792，95%可信區(qū)間為0.711～0.874，P＜0.001。

3 討論

結(jié)核病是全球十大致死性疾病之一，盡管不斷有新的診斷方法、藥物和疫苗被開(kāi)發(fā)出來(lái)，但結(jié)核病仍是威脅人類健康的全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題。結(jié)核病的檢測(cè)方法很多，痰涂片抗酸染色鏡檢簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)，是最常用的方法，特別是在欠發(fā)達(dá)地區(qū)[6]；培養(yǎng)法作為公認(rèn)的診斷結(jié)核病的病原學(xué)金標(biāo)準(zhǔn)，具有高敏感性和特異性，但耗時(shí)較長(zhǎng)[7]；液基夾層杯法是國(guó)家科技重大專項(xiàng)成果，作為結(jié)核病診斷的新技術(shù)，具有生物安全性高和陽(yáng)性檢出率高的特點(diǎn)[4]；近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外關(guān)于適配體的研究發(fā)展迅速，已成功篩選到多種MTB適配體用于結(jié)核病的診斷和鑒別，其檢測(cè)敏感性和特異性明顯高于傳統(tǒng)方法[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，液體培養(yǎng)法和固體培養(yǎng)法陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但固體培養(yǎng)法操作簡(jiǎn)單，成本低，可以直接判斷是否存在污染，更適合基層實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展；液體培養(yǎng)法則更為快速、準(zhǔn)確[8]。基于此，本研究以液體培養(yǎng)法為參考，比較液基夾層杯法和核酸適配體熒光探針?lè)ǖ囊恢滦?。借鑒培養(yǎng)法對(duì)樣本的消化預(yù)處理是液基夾層杯技術(shù)的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)，結(jié)合充分震蕩，使痰液樣本完全液化，有利于抗酸桿菌在特殊底膜上沉淀，然后染色讀片。該技術(shù)相較于傳統(tǒng)涂片染色，陽(yáng)性率有極大的提高[9]，并有效避免了生物安全風(fēng)險(xiǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，液基夾層杯法敏感性、特異性、準(zhǔn)確度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值與已有研究結(jié)果[10]一致，各項(xiàng)指標(biāo)優(yōu)于抗酸染色鏡檢法，且液基夾層杯法與液體培養(yǎng)法一致性較好。本研究有2例液基夾層杯法陽(yáng)性、液體培養(yǎng)法陰性的樣本，可能與患者服用過(guò)抗結(jié)核藥物有關(guān)。抗結(jié)核藥物治療后，患者體內(nèi)MTB活性降低，排菌減少，從而可能導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)涂片陽(yáng)性、培養(yǎng)陰性[11]。

適配體是單鏈DNA或RNA寡核苷酸，能夠與靶分子結(jié)合，具有很高的特異性和親和力，因此，適配體被用于診斷、生物傳感器和靶向治療，被認(rèn)為是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)中抗體的替代品[12]。目前已研發(fā)出多種應(yīng)用于MTB診斷的適配體，如分泌蛋白MPT64、CFP-10、ESAT6，作為靶物質(zhì)的適配體，在MTB診斷上均有重大突破[2]。本研究采用了一種新型適配體技術(shù)--核酸適配體熒光探針?lè)z測(cè)MTB，結(jié)果顯示，以液體培養(yǎng)法為參考，核酸適配體熒光探針?lè)舾行詾?4.79%，這與成熟的液基夾層杯法和培養(yǎng)法的結(jié)果有較大差異；在陰性對(duì)照組中，有3例被判斷為陽(yáng)性；經(jīng)Kappa一致性分析和ROC曲線分析，發(fā)現(xiàn)核酸適配體熒光探針?lè)ㄅc液體培養(yǎng)法、抗酸染色鏡檢法的一致性均較差。有研究發(fā)現(xiàn)，在篩選核酸適配體的過(guò)程中，一些適配體的結(jié)合可能會(huì)因競(jìng)爭(zhēng)相同的結(jié)合位點(diǎn)而被其他抗體抑制；另外，空間位阻和核苷酸長(zhǎng)度等也會(huì)影響適配體的親和力，這可能是該方法診斷價(jià)值不高的原因之一[13]?；诤怂徇m配體的優(yōu)化，可以通過(guò)位點(diǎn)序列的優(yōu)化或從動(dòng)力學(xué)上改善核酸適配體，從而提高其診斷MTB感染的價(jià)值[14]。

本研究樣本量較少，結(jié)論具有一定局限性，需要進(jìn)一步研究結(jié)果加以驗(yàn)證。

綜上所述，液基夾層杯法在結(jié)核病診斷中的價(jià)值較高，核酸適配體熒光探針技術(shù)尚需進(jìn)一步優(yōu)化。