李志恒 于 鑫 袁 瑩 徐志卿,*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系,北京 100069; 2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系,北京 100069)

產(chǎn)前應(yīng)激(prenatal stress,PS)即母體妊娠期間受到環(huán)境因素、社會(huì)因素等各種負(fù)性壓力[1],將對(duì)人類與嚙齒類動(dòng)物的子代產(chǎn)生不利影響,如損傷情緒相關(guān)腦區(qū)的發(fā)育過(guò)程,造成學(xué)習(xí)認(rèn)知功能障礙,嚴(yán)重者還會(huì)導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)生[2]。抑郁癥是以持續(xù)性的情緒低落為主要臨床癥狀的情感類疾病[3]。據(jù)世界衛(wèi)生組織[4]報(bào)道,全球大約有3.5億人身處抑郁癥的痛苦之中,它是一種發(fā)病率高、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重的嚴(yán)重精神類疾病。因此,抑郁癥已成為急需關(guān)注并迫切需要解決的公共衛(wèi)生問(wèn)題[5]。

抑郁癥的三大癥狀為情緒低落、快感缺失和絕望無(wú)助[6]。抑郁癥與內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)(medial prefrontal cortex,mPFC)腦區(qū)[7]及情緒相關(guān)腦區(qū)關(guān)系密切[8-10]。PFC活動(dòng)減弱[11],PS導(dǎo)致mPFC腦區(qū)神經(jīng)元密度減少[8]。筆者未檢索到有研究報(bào)道產(chǎn)前束縛應(yīng)激對(duì)情緒相關(guān)腦區(qū)c-Fos神經(jīng)元激活密度改變的影響,這對(duì)進(jìn)一步探討PS后情緒相關(guān)腦區(qū)功能的改變有一定意義,可為研究PS導(dǎo)致的抑郁癥的發(fā)病機(jī)制提供思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

鼠源多克隆抗-NeuN抗體(美國(guó)Millipore公司);鼠源多克隆抗-GAD67抗體(美國(guó)Sigma公司);鼠源多克隆CamKⅡα抗體(美國(guó)Sigma公司);兔源單克隆c-Fos抗體(英國(guó)CST公司);山羊抗兔488多克隆抗體(美國(guó)Millipore公司);山羊抗鼠594多克隆抗體(美國(guó)Millipore公司);蔗糖(上海麥克林生化科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PS子代大鼠模型制備

PS組孕鼠每天給予3次束縛應(yīng)激,起始時(shí)間分別為 8:45 am-9:30 am,11:45 am-12:30 am,15:45 am-16:30 am,每次45 min,每天共計(jì)135 min。從孕期第14天(pregnancy day 14, GD14)到孕期第20天(pregnancy day 20, GD20),一共束縛7 d,束縛盒為透明塑料盒,其正面有3個(gè)卡位,底面為黑色,束縛板也為黑色。頭端具有呼吸小孔防止束縛孕鼠窒息,尾端有可使尾巴伸出來(lái)的小孔。將孕鼠放到束縛盒內(nèi),孕鼠不同孕期根據(jù)其身體體積的大小不同靈活調(diào)節(jié)擋板,以孕鼠在束縛盒內(nèi)不能隨意活動(dòng)為最合適的束縛程度。每次束縛結(jié)束,將孕鼠放回原來(lái)飼養(yǎng)籠,清洗干燥束縛盒和擋板,以備下次使用。

1.3.2 子代大鼠分組

子代大鼠出生第一天,即產(chǎn)后第一天(postpartum day 1,PD1)。為避免數(shù)量不一致導(dǎo)致子代大鼠營(yíng)養(yǎng)攝取偏差,每一只母鼠只留8只雄性子代。子代大鼠離乳前一直由母鼠哺乳,21 d離乳后分籠飼養(yǎng),3只一籠。為了防止遺傳因素的干擾以及子代大鼠個(gè)體差異,入組的子代大鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)選取自不同的母鼠。正常孕鼠的子代雄鼠為正常對(duì)照組(Ctrl組),產(chǎn)前束縛孕鼠的子代雄鼠成年時(shí)經(jīng)行為學(xué)測(cè)試篩選出抑郁樣行為大鼠作為產(chǎn)前應(yīng)激組(PS組)。

1.3.3 抑郁樣行為測(cè)試

蔗糖偏好測(cè)試(sucrose preference test,SPT):測(cè)試時(shí)大鼠不給予飼料。根據(jù)動(dòng)物只數(shù)配置合適的糖水瓶和清水瓶對(duì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)前將裝有1 %(質(zhì)量分?jǐn)?shù))蔗糖水的糖水瓶和裝有清水的清水瓶稱質(zhì)量記錄。隨后將兩瓶同時(shí)輕柔地插到蔗糖偏好測(cè)試籠箅子上,并且糖水瓶和清水瓶之間隔開(kāi)固定距離;隨后在安靜無(wú)打擾的環(huán)境中讓大鼠自由飲水 1 h。飲水結(jié)束后,動(dòng)作輕柔地回收清水瓶和糖水瓶并進(jìn)行稱質(zhì)量記錄,計(jì)算糖水瓶及清水瓶實(shí)驗(yàn)前后質(zhì)量差,將所得數(shù)據(jù)代入公式:A=B/(B+C)×100 %,計(jì)算每只大鼠的糖水飲用百分比。A:糖水飲用百分比;B:糖水飲用質(zhì)量;C:清水飲用質(zhì)量;B、C單位為g。

結(jié)合傳輸設(shè)備、蓄電池的實(shí)時(shí)/在線網(wǎng)管監(jiān)測(cè)與檢測(cè)數(shù)據(jù)、充放電實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、歷史運(yùn)行狀態(tài)性能等動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)，設(shè)備和業(yè)務(wù)統(tǒng)計(jì)資源靜態(tài)數(shù)據(jù)、歷史缺陷和檢修工單等流程數(shù)據(jù)、設(shè)備動(dòng)環(huán)信息等數(shù)據(jù)，建立設(shè)備狀態(tài)變化分類預(yù)測(cè)模型，整體反應(yīng)設(shè)備狀態(tài)，感知設(shè)備狀態(tài)和網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)。

開(kāi)放曠場(chǎng)測(cè)試(open field testing,OFT):采用動(dòng)物開(kāi)放曠場(chǎng)測(cè)試箱,底壁和四周壁均為黑色的敞口箱,曠場(chǎng)箱體積(100 cm×100 cm×30 cm),被平均分為25個(gè)同樣大小的正方格。實(shí)驗(yàn)時(shí)保持正常光照,將大鼠輕輕放入箱底中心區(qū)域,讓其在箱內(nèi)自由探索,每一只大鼠在曠場(chǎng)箱內(nèi)探索 6 min。箱底正上方的攝像機(jī)記錄 5 min。使用稀釋過(guò)的乙醇和干凈紙巾將曠場(chǎng)箱底進(jìn)行擦拭,盡量避免前一只測(cè)試大鼠氣味對(duì)下一只大鼠測(cè)試結(jié)果的影響。采用ANY-maze行為學(xué)分析軟件對(duì)大鼠在中央?yún)^(qū)停留時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

強(qiáng)迫游泳測(cè)試(forced swim test,FST):實(shí)驗(yàn)時(shí)保持正常光照,將測(cè)試大鼠放入70 cm×40 cm水桶中游泳,水溫控制在 (25 ± 2)℃,攝像機(jī)錄像記錄 5 min。將視頻導(dǎo)入ANY-maze行為學(xué)分析軟件統(tǒng)計(jì)每只大鼠的不動(dòng)時(shí)間(大鼠停止掙扎并漂浮在水中或僅有必要的輕微動(dòng)作以保持頭部在水面以上)。

1.3.4 c-Fos免疫熒光染色

選取Ctrl組和PS組子代大鼠各6只,實(shí)驗(yàn)日備好70 cm×40 cm透明圓柱形水桶,實(shí)驗(yàn)前加入常溫水至桶高的2/3處,保持水溫在 (25 ± 2)℃。每次放入1只大鼠使其游泳5 min,5 min后將其放回原來(lái)的飼養(yǎng)籠。每只大鼠安穩(wěn)放置一段時(shí)間后使用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))戊巴比妥進(jìn)行麻醉灌注取材,從大鼠放回原飼養(yǎng)籠到灌注之間的時(shí)間間隔為90 min。

使用37 ℃的1 mol/L 磷酸鹽溶液(phosphate solution, PB)+肝素鈉溶液心臟灌注(1 mol/L PB,pH=7.30)沖刷血液2 min,37 ℃的4 %(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛(perfluorinated alkaline,PFA)灌注2 min,4 ℃的4 %(質(zhì)量分?jǐn)?shù))PFA灌注15 min。立即解剖大鼠大腦放入4 ℃ 4 % (質(zhì)量分?jǐn)?shù))PFA溶液過(guò)夜。腦組織依次在20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))和30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的蔗糖溶液中脫水,直到組織下沉。將組織塊嵌入OCT包埋冷凍并在冷凍切片機(jī)(萊卡,CM1950)上切片,獲得35μm厚的切片。組織切片用1 mol/L PBS洗滌一遍,然后用0.3%(體積分?jǐn)?shù)) Triton X-100在室溫下打孔1 h,3%(體積分?jǐn)?shù)) Triton X-100在室溫下封閉1 h。組織切片隨后用兔源c-Fos抗體(1∶500)和小鼠源NeuN(1∶1 000)在4 ℃下孵育2夜。一抗孵育后,切片用1 mol/L PBS洗滌3次,并與山羊抗兔Alexa Fluor 488和山羊抗小鼠Alexa Fluor 594(1∶1 000)在室溫下孵育2 h。細(xì)胞核用4,6-二氨基2-苯乙烯醇(DAPI)熒光封片劑染色。

圖像采集采用20 ×物鏡下的共聚焦顯微鏡(萊卡SP8)。量化mPFC、基底外側(cè)杏仁核(basolaterel amygdala, BLA)、腹側(cè)海馬(ventral hippocampus,VH)、腹外側(cè)導(dǎo)管周?chē)屹|(zhì)(ventrolateral periaqueductal gray,vlPAG)腦區(qū)的c-Fos+神經(jīng)元密度和c-Fos+神經(jīng)元占NeuN+神經(jīng)元的比例。c-Fos+神經(jīng)元密度為計(jì)算1 mm2內(nèi)c-Fos+神經(jīng)元的數(shù)量;c-Fos+神經(jīng)元占總NeuN+神經(jīng)元的比例為c-Fos+NeuN+神經(jīng)元的數(shù)量占總NeuN+神經(jīng)元的比例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有行為學(xué)和形態(tài)學(xué)的數(shù)據(jù)分析使用雙盲法,雙人雙次將行為學(xué)視頻導(dǎo)入行為學(xué)分析軟件,形態(tài)圖片導(dǎo)入Image J 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,盡量避免人為失誤。

2 結(jié)果

2.1 PS導(dǎo)致子代雄性大鼠產(chǎn)生抑郁樣行為

蔗糖偏好測(cè)試中PS組糖水偏好率明顯低于對(duì)照組(圖1A);開(kāi)放曠場(chǎng)測(cè)試中PS組在中心區(qū)停留時(shí)間較對(duì)照組減少(圖1B); PS組強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間較對(duì)照組明顯延長(zhǎng)(圖1C),表現(xiàn)出快感缺失和絕望無(wú)助。

圖1 PS導(dǎo)致子代大鼠產(chǎn)生抑郁樣行為Fig.1 PS leads to depression behavior in offspring male rats

2.2 PS后,子代大鼠mPFC腦區(qū)應(yīng)激敏感性神經(jīng)元密度下降

如圖2A所示,PS組在FST后mPFC中c-Fos+細(xì)胞與正常對(duì)照組相比,密度降低(53.82 ± 0.54vs80.45 ± 0.62,P<0.01,圖2B),比例下降(4.895 ± 0.360vs7.924 ± 0.691,P<0.01,圖2C)。

圖2 PS子代大鼠mPFC腦區(qū)應(yīng)激敏感性神經(jīng)元密度下降Fig.2 After prenatal stress, the density of stress-sensitive neurons in the mPFC brain region of the offspring rats decreased

2.3 PS后,子代大鼠BLA腦區(qū)應(yīng)激敏感性神經(jīng)元密度下降

PS子代成年大鼠BLA腦區(qū)c-Fos+細(xì)胞密度(PS組: 66.76 ± 5.24,Ctrl組:71.26 ± 5.16,P<0.01)和NeuN+細(xì)胞中c-Fos++NeuN+細(xì)胞的百分比與對(duì)照組相比(PS組: 6.386 ± 0.440,Ctrl組:8.758 ± 0.518,P<0.01)均降低(圖3)。

圖3 PS子代大鼠BLA腦區(qū)應(yīng)激敏感性神經(jīng)元密度下降Fig.3 After prenatal stress, the density of stress sensitive neurons in the BLA region of the offspring rats decreased

2.4 PS子代大鼠VH腦區(qū)應(yīng)激敏感性神經(jīng)元密度下降

PS子代成年大鼠VH腦區(qū)c-Fos+細(xì)胞密度與Ctrl組相比下降(PS組: 78.43 ± 2.53,Ctrl組:86.86 ± 3.09,P<0.05)。NeuN+細(xì)胞中c-Fos++NeuN+細(xì)胞的百分比與Ctrl組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PS組: 4.565 ± 0.365,Ctrl組:4.426 ± 0.322,P>0.05)(圖4)。

圖4 PS子代大鼠VH腦區(qū)應(yīng)激敏感性神經(jīng)元密度下降Fig.4 After prenatal stress, the density of stress-sensitive neurons in the VH brain region of the offspring rats decreased

2.5 PS子代大鼠vlPAG腦區(qū)應(yīng)激敏感性神經(jīng)元密度不變

PS子代成年大鼠vlPAG腦區(qū)中c-Fos+細(xì)胞密度(PS組: 111.0 0± 5.18,Ctrl組:106.10 ± 17.02,P>0.05)和NeuN+細(xì)胞中c-Fos++NeuN+細(xì)胞的百分比(PS組: 8.396 ± 0.881,Ctrl組:8.300 ± 1.639,P>0.05)與Ctrl組相比,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(圖5)。

圖5 PS子代大鼠vlPAG腦區(qū)應(yīng)激敏感性神經(jīng)元密度不變Fig.5 After prenatal stress, the density of stress sensitive neurons in vlPAG brain region of offspring rats remained unchanged

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PS會(huì)導(dǎo)致子代雄性大鼠產(chǎn)生焦慮抑郁樣行為,表現(xiàn)為糖水偏好測(cè)試中糖水飲用率明顯降低;開(kāi)放曠場(chǎng)測(cè)試中,中心停留時(shí)間較正常對(duì)照組減少;強(qiáng)迫游泳測(cè)試中,PS組較正常對(duì)照組不動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng);表現(xiàn)出快感缺失和絕望無(wú)助癥狀即出現(xiàn)抑郁樣行為。上述行為變化結(jié)果與先前研究報(bào)道一致[12-13]。

本研究結(jié)果顯示,PS子代大鼠mPFC腦區(qū)應(yīng)激敏感性神經(jīng)元密度下降,之后根據(jù)文獻(xiàn)[14]報(bào)道方法先進(jìn)行5 min強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)作為應(yīng)激源,取材后對(duì)腦片進(jìn)行c-Fos與NeuN免疫熒光染色,發(fā)現(xiàn)應(yīng)激敏感性神經(jīng)元占總神經(jīng)元的比例下降。由此可知,PS后,在mPFC腦區(qū)c-Fos陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量下降時(shí),主要是NeuN與c-Fos共標(biāo)的陽(yáng)性神經(jīng)元下降才導(dǎo)致應(yīng)激敏感性神經(jīng)元比例下降。PS后,子代大鼠BLA腦區(qū)及VH腦區(qū)應(yīng)激敏感性神經(jīng)元密度下降,PS損害了海馬的形態(tài)發(fā)育,包括神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)元分化。PS后,子代大鼠vlPAG腦區(qū)應(yīng)激敏感性神經(jīng)元密度不變。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他應(yīng)激相關(guān)文獻(xiàn)[8]研究報(bào)道類似,情緒相關(guān)腦區(qū)與抑郁癥密切相關(guān),一方面,是抑郁相關(guān)環(huán)路中的重要中樞調(diào)控思維和情緒[15]。另一方面,重度抑郁癥患者功能磁共振成像[16]顯示血流量和葡萄糖代謝減少。在產(chǎn)前聽(tīng)覺(jué)應(yīng)激動(dòng)物模型上[8],mPFC腦區(qū)神經(jīng)元密度減少。已有報(bào)道[17]顯示,mPFC腦區(qū)體積減小,神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少。抑郁癥和慢性應(yīng)激暴露會(huì)導(dǎo)致與抑郁癥有關(guān)的皮質(zhì)和邊緣腦區(qū)域的神經(jīng)元萎縮,腦成像研究表明抑郁癥患者大腦的連通性和網(wǎng)絡(luò)功能發(fā)生改變。腦皮質(zhì)損傷后c-Fos的短暫激活與抑郁癥的擴(kuò)散模式相似[18]。研究[19]表明,PS子代大鼠海馬(hippocampus, HIP)和前額葉皮質(zhì)中c-Fos蛋白和mRNA水平降低。小鼠經(jīng)PS后,短期行為應(yīng)激治療可改善慢性束縛應(yīng)激(chronic restraint stress, CRST)小鼠調(diào)節(jié)應(yīng)激對(duì)應(yīng)的mPFC、BLA腦區(qū)c-Fos密度下降這一改變[20],這與本實(shí)驗(yàn)變化趨勢(shì)一致。經(jīng)歷2次輕度聽(tīng)覺(jué)應(yīng)激的產(chǎn)前壓力小鼠紋狀體(corpus striatum, STR)及海馬腦區(qū)c-Fos蛋白表達(dá)增加與血清轉(zhuǎn)運(yùn)體(serotonin transporters, SERT)有關(guān)且變化趨勢(shì)一致[21]。PS除了影響總神經(jīng)元激活數(shù)量,還對(duì)單個(gè)神經(jīng)元的樹(shù)突棘密度和突觸造成影響。研究[22]顯示,在GD12-16時(shí)給予每天2次(9:00 am-3:00 pm),每次30 min的束縛應(yīng)激大鼠模型中,眶額葉皮質(zhì)(orbitofrontal cortex, OFC)、mPFC和海馬CA1區(qū)(hippocampus CA1 region)樹(shù)突形態(tài)和實(shí)際神經(jīng)元體積發(fā)生改變。導(dǎo)致PFC錐體神經(jīng)元頂端樹(shù)突棘密度降低,海馬CA1區(qū)蘑菇棘比例降低[23]。鑒于蘑菇棘被認(rèn)為更“成熟”可形成比其他棘更強(qiáng)更穩(wěn)定的突觸類型,蘑菇棘密度下降,機(jī)體樹(shù)突因?yàn)榇鷥斂赡鼙磉_(dá)更多的非成熟棘補(bǔ)償突觸的損失[24]。樹(shù)突棘密度的動(dòng)態(tài)平衡是興奮性突觸自身調(diào)節(jié)的結(jié)果[25],樹(shù)突棘的密度和形態(tài)改變與神經(jīng)發(fā)育[26]及以認(rèn)知障礙為特征的疾病密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PS會(huì)導(dǎo)致子代雄性大鼠產(chǎn)生焦慮抑郁樣行為;會(huì)導(dǎo)致mPFC、BLA和VH腦區(qū)應(yīng)激敏感性神經(jīng)元密度下降,提示神經(jīng)元的興奮性可能降低。vlPAG腦區(qū)應(yīng)激敏感性神經(jīng)元密度不變,說(shuō)明并非所有情緒相關(guān)腦區(qū)應(yīng)激敏感性神經(jīng)元密度在PS后發(fā)生改變,可能提示產(chǎn)前應(yīng)激對(duì)vlPAG腦區(qū)c-Fos陽(yáng)性神經(jīng)元無(wú)影響。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明李志恒:提出研究思路,設(shè)計(jì)研究方案,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作,采集分析數(shù)據(jù),撰寫(xiě)論文;于鑫、袁瑩:協(xié)助進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn);協(xié)助分析數(shù)據(jù);徐志卿:總體把關(guān),審定論文。