范超,宿驚濤,文瑾,李倩,吳文忠

(大連醫(yī)諾生物股份有限公司,遼寧 大連,116600)

蝦青素(astaxanthin)是類胡蘿卜素的一種,為一種較強(qiáng)的天然抗氧化劑[1]。與其他類胡蘿卜素一樣,蝦青素屬于一種脂溶性的色素,抗氧化能力強(qiáng),為維生素E的550倍、β-胡蘿卜素的10倍。蝦青素在水產(chǎn)資源中分布廣泛,其中雨生紅球藻公認(rèn)是天然蝦青素的良好來源[2]。蝦青素在體外和體內(nèi)模型中均顯示出潛在的生物學(xué)活性,對動(dòng)物和人類代謝均有較好作用[3]。蝦青素用作營養(yǎng)補(bǔ)充劑,抗氧化劑和抗癌劑,可預(yù)防糖尿病、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病,并刺激免疫[4-8]。蝦青素產(chǎn)品以多種劑型作為保健食品在市場發(fā)售。蝦青素作為一類脂溶性類胡蘿卜素類物質(zhì),自身存在水溶性差的特性,導(dǎo)致其在生物體內(nèi)生物利用度較低,這在部分腸胃功能障礙以及消化系統(tǒng)功能弱的特殊人群中表現(xiàn)更為顯著,因此,對藻源蝦青素類產(chǎn)品生物利用度的研究是促進(jìn)其作為功效因子應(yīng)用的重要環(huán)節(jié)[9-10]。

生物利用度,指藥物活性成分從制劑釋放吸收進(jìn)入全身循環(huán)的速度和程度,其可作為藥物制劑質(zhì)量的重要指標(biāo)[11]。生物利用度的影響因素在于以下兩方面[12-13]:劑型因素(藥物由制劑中的釋放速度),如活性成分的溶解性、pKa值、某些劑型特性、工藝條件等;生理因素(活性成分釋放后的吸收速度和吸收分?jǐn)?shù)),如胃腸道液體環(huán)境、活性成分在胃腸道的轉(zhuǎn)運(yùn)形式、吸收部位表面積和局部血流、代謝、腸道菌群、疾病因素等。改進(jìn)方法主要圍繞在增加活性成分的表面積、提高活性成分的溶解度或兩種手段聯(lián)合應(yīng)用等方法上。隨著新技術(shù)、新材料的發(fā)展,難溶性成分通過劑型修飾,經(jīng)口服也可獲得較好的吸收和生物利用度。在現(xiàn)有研究中[14-15],微囊劑型對活性成分的生物利用度具有顯著的提升作用已被明確報(bào)道,其原因包括增加活性成分的水溶性,保護(hù)易降解成分,增強(qiáng)其穩(wěn)定性,增加活性成分的釋放和胃腸道吸收的表面積/體積比等。為了改善蝦青素作為功能食品的穩(wěn)定性和生物利用度,可以通過微囊化、乳化等手段將其進(jìn)行劑型改造,改善其溶解性并提高釋放度。因此,本實(shí)驗(yàn)旨在考察并對比蝦青素各劑型間的生物利用度差異。

在口服類產(chǎn)品生物利用度的體外考察過程中,由于應(yīng)盡可能模擬攝入產(chǎn)品后體內(nèi)的吸收過程,即胃腸道的消化吸收,且不同產(chǎn)品、劑型的生物利用度差異主要表現(xiàn)在胃腸道環(huán)境釋放差異及小腸吸收差異,因此,本實(shí)驗(yàn)分別在模擬胃腸道釋放能力及小腸上皮透過率兩方面考察不同制劑的蝦青素在體外的消化吸收情況。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

XanGuard?雨生紅球藻蝦青素油10%、XanGuard?雨生紅球藻蝦青素微囊粉2.5%,XanGuard?雨生紅球藻蝦青素微粒2.5%、XanGuard?雨生紅球藻蝦青素乳液1%,均為質(zhì)量分?jǐn)?shù),由大連醫(yī)諾生物股份有限公司提供。

胃蛋白酶、胰酶,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;膽鹽,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;HCl、NaOH,科密歐化學(xué)試劑有限公司。

人源克隆結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2(30～50代), American Type Culture Collection;DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清,Thermo Scientific;非必需氨基酸、青霉素-鏈霉素雙抗溶液、胰蛋白酶-EDTA消化液,北京索萊寶科技有限公司;CCK-8細(xì)胞增殖及毒性檢測試劑盒、DMEM高糖無酚紅細(xì)胞培養(yǎng)基,大連美侖生物技術(shù)有限公司;Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室,Corning公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RC-8DS溶出度儀,新天光分析儀器技術(shù)有限公司;雷磁PHS-3C pH計(jì),上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;安捷倫1260型高效液相色譜儀,安捷倫科技有限公司;超凈工作臺(tái),蘇州凈化設(shè)備總廠;低溫高速離心機(jī)、3111細(xì)胞培養(yǎng)箱,Thermo Fisher Scientific;YS2倒置生物顯微鏡,日本Nikon公司;Infinit M PLEX多功能酶標(biāo)儀,瑞士Tecan公司;Millicell-ERS跨膜電阻檢測儀,MERCK公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 體外消化模擬

各制劑設(shè)置3個(gè)平行組。分別稱取1 g蝦青素油、4 g蝦青素微囊粉、4 g蝦青素微粒、10 g蝦青素乳液(各制劑約含蝦青素100 mg),與400 mL PBS混合加入1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值到2.0后,加入胃蛋白酶,使其質(zhì)量濃度為0.42 mg/mL,調(diào)節(jié)溶出度儀攪拌槳轉(zhuǎn)速為100 r/min,反應(yīng)溫度為37 ℃,開始模擬胃消化。并在模擬胃消化開始后的30、60、90、120 min取樣,樣品過濾除去固體不溶物后,取濾液進(jìn)行測定。

結(jié)束胃消化后,攪拌槳繼續(xù)攪拌,每組加入0.1 mol/L NaOH溶液,調(diào)節(jié)pH值至6.8～7.0,加入胰酶及豬膽鹽粉末,使其終質(zhì)量濃度為0.25、3.0 mg/mL,攪拌均一后開始計(jì)時(shí),并在模擬腸消化開始后的30、60、90、120 min取樣,過濾樣品溶液后,取各時(shí)間點(diǎn)消化液樣品濾液進(jìn)行測定。根據(jù)公式(1)求得蝦青素釋放度,所得的消化終產(chǎn)物留存用于后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

(1)

式中:C,溶解在消化液中的蝦青素含量,%;C0,總蝦青素含量,%。

1.3.2 Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)

Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清、1%(體積分?jǐn)?shù))青霉素-鏈霉素溶液、1%(體積分?jǐn)?shù))非必需氨基酸溶液的DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基中,置于37 ℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

1.3.3 Caco-2細(xì)胞活力檢測

以1×104個(gè)細(xì)胞/孔為最終接種密度,將Caco-2細(xì)胞接種于96孔板中,待細(xì)胞密度生長至80%左右時(shí),加入DMEM梯度稀釋的各制劑消化終產(chǎn)物,孵育24 h后,吸棄消化終產(chǎn)物稀釋液,并用PBS洗2遍,加入含體積分?jǐn)?shù)10%的CCK-8的培養(yǎng)基,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中,避光反應(yīng)1 h后,多功能酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞活力,選擇波長450 nm處檢測各孔內(nèi)吸光度,根據(jù)公式(2)計(jì)算細(xì)胞存活率。

(2)

式中:As,蝦青素處理孔吸光度;Ac,蝦青素未處理孔吸光度;Ab,不含細(xì)胞孔吸光度。

1.3.4 細(xì)胞透過率檢測

將Caco-2細(xì)胞以5×104個(gè)細(xì)胞/cm2接種在具有可滲透性聚碳酸酯膜的12孔transwell小室中。在小室頂端側(cè)(apical side,AP)加入0.5 mL細(xì)胞懸液,基底側(cè)(basolateral side,BL)加入1.5 mL完全培養(yǎng)液。隔天更換AP及BL培養(yǎng)基,1周后每天換液,培養(yǎng)至21 d。期間利用跨膜電阻儀評估跨上皮電阻(transepithelial electrical resistance,TEER)來驗(yàn)證Caco-2細(xì)胞單層的完整性和致密性。當(dāng)TEER>350 Ω/cm2時(shí),認(rèn)為Caco-2細(xì)胞單層模型成功建立。

棄去小室上下層培養(yǎng)液,以PBS緩沖液小心潤洗小室上下層,充分洗去殘余培養(yǎng)基?？疾煳r青素各制劑消化終產(chǎn)物從AP到BL的轉(zhuǎn)運(yùn),在AP加入0.5 mL DMEM高糖無酚紅細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋的蝦青素各制劑消化終產(chǎn)物,BL加入1.5 mL空白DMEM高糖無酚紅細(xì)胞培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱進(jìn)行模擬小腸上皮的吸收透過。于1、3、5、8、12 h各取BL小室溶液100 μL,并補(bǔ)足同體積DMEM高糖無酚紅細(xì)胞培養(yǎng)基,檢測各時(shí)間點(diǎn)BL蝦青素含量,根據(jù)公式(3)計(jì)算表觀滲透系數(shù)進(jìn)而推導(dǎo)生物利用度。

(3)

式中:Papp,表觀滲透系數(shù),cm/s;dQ/dT,單位時(shí)間透過單層膜藥量,pmol/s;A,單細(xì)胞層表面積(膜面積),cm2;C0,起始上層小室溶液濃度,pmol/L。

1.3.5 蝦青素樣品含量檢測

本實(shí)驗(yàn)中采用內(nèi)標(biāo)法,使用液相色譜進(jìn)行消化液樣本及細(xì)胞樣本中的蝦青素含量檢測。稱取適量反式-β-阿樸-8-胡蘿卜醛,以丙酮溶解作為內(nèi)標(biāo)溶液,終質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL。精密稱取10%蝦青素油標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g于100 mL棕色容量瓶中,以丙酮定容為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,再精密吸取2 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于50 mL棕色容量瓶中,以丙酮定容為標(biāo)準(zhǔn)使用液。精密移取2 mL樣品溶液、標(biāo)準(zhǔn)使用液,1 mL內(nèi)標(biāo)溶液、3 mL膽固醇酯酶-Tris-HCl溶液(pH 7.0),混勻后37 ℃水浴反應(yīng)45 min,再加入1 mL丙酮、1 g Na2SO4·10H2O、2 mL石油醚,渦旋,3 000 r/min,5 min離心萃取,吸取石油醚層,加入1 g Na2SO4,室溫條件N2吹干石油醚,準(zhǔn)確加入2 mL丙酮,渦旋振蕩溶解過濾,進(jìn)行HPLC分析。

色譜條件:色譜柱TMC-C18柱,4.6 mm×250 mm×5 μm;流動(dòng)相組成如下:溶劑A,V(磷酸)∶V(H2O)=1∶99;溶劑B,甲醇;溶劑C,甲基叔丁基醚,流速1.0 mL/min;進(jìn)行如下方式的梯度洗脫:初始,6% A/84% B/10% C;15 min變?yōu)?% A/71% B/23% C,保持8 min;8 min后變?yōu)?% A/21% B/73% C,保持4 min,4 min后變?yōu)?% A/84% B/10% C,保持8 min(均為體積分?jǐn)?shù))。檢測波長為474 nm,進(jìn)樣量20 μL,柱溫30 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦青素各劑型的體外消化模擬

本研究首先探究了在體外消化模擬過程中各制劑的體外消化情況。在體外消化過程中,蝦青素各制劑在胃腸道pH及消化酶作用下使蝦青素釋放到消化液體系中。圖1為蝦青素油、蝦青素微囊粉、蝦青素微粒、蝦青素乳液的釋放度曲線。由圖1可知,除乳液外,不同運(yùn)載體系的蝦青素均在體外腸道消化過程中表現(xiàn)出較高的釋放,在模擬胃液環(huán)境消化完成后,蝦青素油、微囊粉、微粒、乳液釋放度分別為0%、52.88%、38.41%、72.10%,在模擬腸道消化完成后,蝦青素油、微囊粉、微粒、乳液釋放度分別達(dá)到14.73%、93.71%、89.07%、67.11%。根據(jù)上述結(jié)果,提示在胃腸道消化過程中微囊粉、微粒、乳液運(yùn)載體系表現(xiàn)出較好的蝦青素釋放度。其中蝦青素乳液在整個(gè)胃腸道消化過程中釋放較為穩(wěn)定。

圖1 各劑型蝦青素在體外消化中的釋放度

2.2 蝦青素各劑型消化終產(chǎn)物細(xì)胞毒性檢測

為了探究蝦青素各制劑消化終產(chǎn)物對細(xì)胞活力的影響,將各制劑消化終產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋后給予細(xì)胞24 h,通過CCK-8法檢測細(xì)胞活力變化,所得結(jié)果如圖2所示,各劑型消化終產(chǎn)物稀釋梯度選擇10倍、20倍、40倍。蝦青素油、蝦青素微囊粉、蝦青素微粒及蝦青素乳液制劑消化終產(chǎn)物在稀釋40倍時(shí)對細(xì)胞活力無較大影響,細(xì)胞存活率分別為85.36%、94.02%、93.76%、97.16%,因此在后續(xù)消化終產(chǎn)物透過率實(shí)驗(yàn)中對各制劑終產(chǎn)物的稀釋倍數(shù)設(shè)置為40倍。

圖2 各劑型蝦青素消化終產(chǎn)物對Caco-2細(xì)胞存活率的影響

2.3 蝦青素各劑型消化終產(chǎn)物在Caco-2細(xì)胞單層膜的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)檢測

2.3.1 Caco-2細(xì)胞單層膜的建立

圖3為Caco-2細(xì)胞在transwell小室中的生長曲線,Caco-2細(xì)胞的跨膜電阻隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加逐漸升高,在培養(yǎng)周期達(dá)到7 d后,跨膜電阻達(dá)到268 Ω/cm2,后期電阻增長速度變慢,于培養(yǎng)21 d后電阻達(dá)到372 Ω/cm2,且在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)較好,成膜后并未出現(xiàn)顯著的細(xì)胞死亡。提示Caco-2細(xì)胞單層膜建立完好,可進(jìn)行蝦青素各制劑消化終產(chǎn)物的透過率實(shí)驗(yàn)。

圖3 Caco-2細(xì)胞單層膜TEER變化曲線

2.3.2 蝦青素各劑型消化終產(chǎn)物在Caco-2細(xì)胞單層透過率檢測

在transwell小室AP加入以無血清無酚紅培養(yǎng)基稀釋40倍的蝦青素各制劑消化終產(chǎn)物,考察在1～12 h內(nèi)蝦青素透過情況。取BL透過樣本進(jìn)行蝦青素含量檢測,計(jì)算表觀滲透系數(shù)Papp,所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示,蝦青素油、微囊粉、微粒及乳液的Papp(AP→BL)分別為0.058×10-6、0.483×10-6、0.461×10-6、0.656×10-6cm/s,乳液的Papp顯著高于其他3種制劑消化終產(chǎn)物,微囊粉及微粒表現(xiàn)出相似的Papp,即在4種制劑中,乳液最易于透過模擬小腸上皮,而模擬小腸上皮對微囊粉及微粒消化終產(chǎn)物的透過率并未表現(xiàn)出較大差異,油劑型的消化終產(chǎn)物最難透過模擬小腸上皮。

圖4 不同制劑的蝦青素消化終產(chǎn)物的表觀滲透系數(shù)

3 結(jié)論與討論

在本研究中主要探究了不同制劑類型的蝦青素在體外消化中的釋放度及在Caco-2單層細(xì)胞膜的透過特性,旨在體外水平反映蝦青素在不同制劑中可能存在的生物利用度差異。以未制劑化的蝦青素油為對比,體現(xiàn)了制劑后的蝦青素對吸收利用的促進(jìn)情況。

蝦青素是一種脂溶性天然色素類胡蘿卜素,因其對人類健康的潛在益處而聞名。然而,由于其較低的生物利用度,在食品工業(yè)中的應(yīng)用受到限制。口服脂溶性活性成分補(bǔ)充劑吸收利用低下的原因大致可歸納為3種:活性成分溶解度和溶出速率較低;活性成分的胃腸道黏膜滲透性較差;在體內(nèi)快速消除。因此在本實(shí)驗(yàn)所涉及劑型的生物利用度比較中,主要對不同蝦青素制劑的胃腸道消化過程及腸道黏膜滲透性兩方面進(jìn)行體外模擬。高玉云等[16]研究發(fā)現(xiàn),類胡蘿卜素的消化吸收主要發(fā)生在腸道消化階段,且由于其親脂性,使類胡蘿卜素的腸道吸收存在一定的限制。在本研究中,首先通過在體外模擬胃腸道消化過程,蝦青素微囊粉、微粒及乳液在模擬胃腸液中均表現(xiàn)出了較高的釋放。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,蝦青素油在腸道環(huán)境中與膽鹽及胰酶形成了包裹蝦青素的水溶性膠束,進(jìn)而可被小腸上皮吸收并進(jìn)一步代謝。將蝦青素油進(jìn)行制劑化,與適當(dāng)?shù)馁x形劑及聚合物等結(jié)合,制備為乳液、微囊粉、微粒劑型后,形成了堅(jiān)固的包封系統(tǒng),在消化液中以穩(wěn)定的分散體系存在,既能保護(hù)蝦青素,提高穩(wěn)定性,又能提高蝦青素與胃腸道消化酶接觸的表面積,使蝦青素釋放度顯著提升[17-18]。在3種制劑中,微囊粉更易在模擬胃腸道消化條件下分解,使蝦青素釋放,顯著促進(jìn)了蝦青素的消化吸收。此外,微粒在體外消化模擬中具有與微囊粉相似的消化特性,但與微囊粉相比在蝦青素釋放速度上有所減慢,表現(xiàn)出了一定的緩釋現(xiàn)象。原因可能在于蝦青素微粒劑型的制備在微囊粉基礎(chǔ)上,經(jīng)過了水溶性保護(hù)層的多重包埋,使其釋放速度減慢。乳液為穩(wěn)定的乳化體系,乳液形式的蝦青素降解速率顯著降低,且由于其較小的粒徑,除具有增加蝦青素穩(wěn)定性的優(yōu)勢外,近一步增加了蝦青素暴露于消化液中消化酶的表面積,使其更易于被消化,表現(xiàn)為更高的釋放度,提高生物可獲得率。綜上所述,本研究涉及的對蝦青素的制劑化修飾形式,可顯著提升蝦青素釋放度,進(jìn)一步促進(jìn)其在小腸上皮的吸收代謝。

Caco-2細(xì)胞來源于人類結(jié)腸癌細(xì)胞,其結(jié)構(gòu)和生化特點(diǎn)類似于人類小腸上皮細(xì)胞,其特點(diǎn)在于連續(xù)生長分化一段時(shí)間后可形成具有小腸上皮結(jié)構(gòu)的單層細(xì)胞膜,含有與小腸刷狀緣上皮相關(guān)的酶,能夠在細(xì)胞水平提供關(guān)于藥物分子通過小腸黏膜的吸收、代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)信息,廣泛用于體外模擬小腸上皮生理結(jié)構(gòu)功能[19]。該模型操作簡便,重現(xiàn)性好,可評價(jià)不同實(shí)驗(yàn)條件下藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)速率[20]。在該細(xì)胞模型中,通常用Papp值來評價(jià)藥物在腸道的吸收情況,Papp>10-6cm/s時(shí)生物利用度為100%;Papp值為(0.1～10)×10-6cm/s,生物利用度為1%～100%;Papp<10-7cm/s,則生物利用度<1%。在本實(shí)驗(yàn)中,首先將蝦青素各制劑的消化終產(chǎn)物給予Caco-2細(xì)胞,考察制劑配方、消化液成分等對細(xì)胞的潛在毒性,將消化終產(chǎn)物稀釋到不影響細(xì)胞活力的倍數(shù)再進(jìn)行透過率檢測。將生長狀態(tài)良好的Caco-2細(xì)胞在transwell小室中培養(yǎng)約21 d左右后形成模擬小腸上皮,該階段通過檢測細(xì)胞電阻確定培養(yǎng)時(shí)間。形成模擬通過小腸上皮給予稀釋后消化液樣本,檢測一段時(shí)間各制劑消化終產(chǎn)物透過模擬小腸上皮蝦青素含量,計(jì)算Papp值進(jìn)而推導(dǎo)各制劑對小腸上皮吸收的促進(jìn)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,蝦青素油屬于吸收率較低的制劑形式,而蝦青素制劑化后Papp值顯著提高,更易被吸收。微囊粉、微粒等制劑由于粒徑較小、增溶、增加穩(wěn)定性、增加吸收表面積等優(yōu)勢,對于許多生物利用度低的成分可顯著提高其吸收利用[21-22]。在本實(shí)驗(yàn)體外消化過程中的胃消化階段,由于pH、靜電相互作用及消化酶的影響等因素,微囊粉、微粒結(jié)構(gòu)已經(jīng)被打開,即在透過率實(shí)驗(yàn)中微囊粉及微粒表現(xiàn)出相似的透過率。在蝦青素制備為乳液后,除具有較高的蝦青素釋放度外,模擬小腸透過率還可進(jìn)一步提升。引起該現(xiàn)象的原因可能是乳液與微囊粉、微粒相比,具有更低的粒徑,更易穿過模擬小腸上皮而被吸收,即具有更高的生物利用度。

綜上所述,本研究在體外水平研究了蝦青素不同制劑形式的消化、吸收過程。結(jié)果表明,通過設(shè)計(jì)不同類型的制劑形式可以有效提高蝦青素的釋放度及轉(zhuǎn)運(yùn),一定程度上改善了蝦青素生物利用度低的問題,后續(xù)在蝦青素的應(yīng)用中可根據(jù)不同的應(yīng)用場景選擇不同的劑型。但本實(shí)驗(yàn)得出的體外生物利用度比較,為通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)推導(dǎo)估算得到,無法涵蓋所有體內(nèi)影響因素,因此本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)所得生物利用度可能存在一定差異,后續(xù)仍需開展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果。