魯曦,任珂

(陜西科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西 西安,710021)

山羊(Caprahircas)和綿羊(Ovisaries)為偶蹄目牛科羊亞科的不同屬生物,山羊有60條染色體,而綿羊只有54條[1-2]。除了分類學(xué)上不同之外,二者在生活習(xí)性、繁殖能力等方面也存在差異。例如山羊食性雜,除牧草外還喜食灌木嫩枝、藤蔓等,而綿羊喜食非禾本科草、闊葉草[3]。山羊繁殖能力強(qiáng),每胎可產(chǎn)羔2～3只,哺乳期7～9個月,年產(chǎn)乳量450～600 kg;而綿羊多為單胎,哺乳期為3～5個月,年產(chǎn)乳量僅為30～350 kg[4-5]。

以上因素導(dǎo)致綿羊養(yǎng)殖范圍小、難度高,產(chǎn)乳量僅占羊乳總產(chǎn)量38%。但由于綿羊乳鐵蛋白含量是牛乳的3倍,其蛋白質(zhì)、酪蛋白、共軛亞油酸和維生素C含量均顯著高于山羊乳[6-8]。與牛乳和山羊乳相比,綿羊乳在我國乳品加工領(lǐng)域尚處于初級階段,且綿羊乳功能成分研究較為缺乏。因此本研究通過測定山羊乳與綿羊乳外泌體miRNAs表達(dá)譜,并對其進(jìn)行對比分析,揭示2種羊乳的潛在功能差異。

外泌體是細(xì)胞自然產(chǎn)生的胞外囊泡,幾乎存在于所有生物液體中。作為一種“納米載體”,粒徑在30～150 nm[9],通過攜帶脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、mRNA、非編碼RNA和DNA,在各種生物學(xué)過程中以及物種間傳遞遺傳信息[10]。乳外泌體在自然界中含量豐富,并表現(xiàn)出許多有利于治療作用的納米載體特性[11]。母乳與牛乳外泌體中的miR-146a等分子,具有抑制Toll樣受體(Toll like receptors,TLR)依賴的免疫炎癥反應(yīng)激活[12-13];豬乳源外泌體miRNAs可以提高葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)腸炎模型腸道緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)[14]。藥物負(fù)載效果研究中也發(fā)現(xiàn)山羊乳外泌體的藥物裝載能力顯著高于牛乳和水牛乳[15]。此外,還有研究發(fā)現(xiàn)山羊乳外泌體能夠顯著降低了登革熱病毒的復(fù)制和成熟病毒粒子的分泌[16]。以上數(shù)據(jù)提示羊乳外泌體與其天然負(fù)載大分子具有重要的生物學(xué)功能。然而,目前關(guān)于山羊和綿羊乳外泌體miRNAs表達(dá)譜研究十分有限,這在一定程度上限制了研究人員對羊乳功能的進(jìn)一步認(rèn)識,也影響了羊乳外泌體的深入研究與應(yīng)用。

本研究利用超高速離心法分離山羊與綿羊乳外泌體,接著構(gòu)建了山羊乳及綿羊乳外泌體sRNA文庫,利用Illumina平臺對其中的miRNAs分子進(jìn)行測序和生物信息學(xué)分析,并分析其功能及差異性。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和制備

本研究采用前中泌乳期的關(guān)中奶山羊和東弗里生綿羊乳液樣本。分別將30份山羊乳樣品和綿羊乳樣品隨機(jī)分為3組,并充分混合。樣品采集后立即冷凍,并置于干冰中運(yùn)輸至實驗室,保存于超低溫冰箱(-80 ℃)直至后續(xù)研究。

1.2 儀器與設(shè)備

OptiamTML-90k Ultracentrifuge超速離心儀,Beckman Coulter公司;NanoPhotometer?分光光度計,IMPLEN公司;Qubit?2.0熒光定量儀,Life Technologies公司;2100型生物分析儀,Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 羊乳外泌體提取

取出樣本25 ℃水浴解凍后,在4 ℃、2 000×g離心10 min,將上清液繼續(xù)在4 ℃、10 000×g離心30 min,隨后將樣本上清轉(zhuǎn)移至超高速離心管中,在4 ℃、110 000×g離心75 min棄上清液。用 1 mL PBS 重懸沉淀并稀釋,用0.22 μm膜過濾后,繼續(xù)將樣本轉(zhuǎn)移至超高速離心管,在4 ℃、110 000×g繼續(xù)離心75 min收集沉淀,用PBS重懸,并利用透射電鏡和納米顆粒跟蹤分析技術(shù)(nanoparticle tracking analysis,NTA)對外泌體進(jìn)行鑒定,其余外泌體置于-80 ℃保存。

1.3.2 總RNA提取

取外泌體樣本用TRIzol法提取后在1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠上監(jiān)測RNA降解和污染,并利用NanoPhotometer?分光光度計和Qubit?2.0 熒光定量儀分別檢測RNA純度和濃度。最后使用Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)評估RNA完整性。

1.3.3 sRNA文庫構(gòu)建及測序

每個樣品的總RNA量為3 μg。使用NEBNext?Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina?(NEB, USA)生成測序文庫,并將索引代碼添加到每個樣品的屬性序列中。具體是將NEB 3′ SR Adaptor直接特異連接到miRNA、siRNA和piRNA的3′端,SR RT引物雜交到多余的3′ SR 接頭,將單鏈DNA接頭轉(zhuǎn)化為雙鏈DNA分子。5′ SR Adaptor連接到miRNA、siRNA和piRNA的5′端。然后利用M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成首鏈cDNA。隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物在8%(體積分?jǐn)?shù))聚丙烯酰胺凝膠(100V, 80 min)上純化。回收140～160 bp(小非編碼RNA長度加上3′和5′接頭)的DNA片段,溶解于8 μL洗脫緩沖液中,在Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)上對文庫質(zhì)量進(jìn)行評估。之后在cBot聚類生成系統(tǒng)上對樣本進(jìn)行聚類。聚類生成后,文庫制備在Illumina HiSeq 2500平臺上測序,生成50 bp的單端reads。

1.3.4 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

使用Fastq軟件篩選原始數(shù)據(jù),去除山羊乳和綿羊乳外泌體miRNA樣品溶液中低質(zhì)量序列、接頭污染序列和PolyA/T/G/C序列,獲得純凈序列。同時計算原始數(shù)據(jù)的Q20、Q30和GC含量,然后從純凈序列中選擇一定長度范圍進(jìn)行所有下游分析。

1.3.5 sRNAs定位及序列特征分析

利用Bowtie對照參考基因組數(shù)據(jù),分析它們在基因組上的表達(dá)和分布。將sRNA與miRBase及Rfam數(shù)據(jù)庫比對,對sRNAs進(jìn)行鑒定,最終鑒定出的已知miRNAs用于后續(xù)分析。去除其中的rRNAs、tRNAs、snRNAs和snoRNAs等非miRNAs序列,同時對比對成功的非miRNAs序列進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計。

1.3.6 已知miRNAs鑒定和新miRNAs預(yù)測

以基因組序列為參考,篩選出已知的miRNAs。整合 miREvo和mirdeep2軟件,通過探索二級結(jié)構(gòu)、Dicer酶切位點和未注釋的sRNAs的最小自由能來預(yù)測新的miRNAs。同時對不同長度的已知miRNAs的首位堿基分布及各位點堿基分布情況進(jìn)行統(tǒng)計。

1.3.7 靶基因預(yù)測與生物信息學(xué)分析

使用miRanda和RNAhybrid軟件分別對山羊乳及綿羊乳外泌體中檢測到的所有miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測并取交集,對預(yù)測到的靶基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊乳和綿羊乳外泌體鑒定

如圖1所示,在透射電鏡下山羊乳和綿羊乳外泌體呈圓形、大小均勻、有典型的“茶托”結(jié)構(gòu)。

a-山羊乳外泌體;b-綿羊乳外泌體

粒徑分析結(jié)果如圖2所示,山羊乳和綿羊乳外泌體粒徑大多分布于50～150 nm,濃度分別為4.37×109和9.42×1010個/mL。以上結(jié)果與以往山羊乳外泌體形態(tài)報道[11, 17]基本相符。

a-山羊乳外泌體;b-綿羊乳外泌體

2.2 測序數(shù)據(jù)和質(zhì)控結(jié)果

如表1所示,山羊乳和綿羊乳外泌體測序數(shù)據(jù)通過質(zhì)控,分別得到純凈序列8 866 439條(98.37%)和8 210 089條(97.75%)。接下來,對山羊乳和綿羊乳外泌體長度區(qū)間為18～35 nt的sRNAs純凈序列進(jìn)行后續(xù)分析。

表1 山羊乳及綿羊乳外泌體中測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果

2.3 羊乳sRNAs序列比對及miRNAs首位堿基偏好性

將長度篩選后的sRNAs定位到參考序列上(山羊:Capra hircus_Ensemble_97和NCBI_GCA_001704415.1_ARS1;綿羊:Ovis aries_Ensemble_97),分析了sRNAs和miRNAs在參考序列上的分布情況,結(jié)果如表2。通過比較發(fā)現(xiàn),綿羊乳外泌體與基因組比對率為87.11%,而山羊乳外泌體的比對率僅為27.09%。

表2 山羊乳及綿羊乳外泌體中sRNA序列比對分析結(jié)果

堿基偏好性有助于了解miRNAs的加工作用機(jī)理與測序準(zhǔn)確性。由圖3可知,不論山羊乳還是綿羊乳,不同長度的已知miRNAs首位堿基均對U具有顯著偏好性,其中綿羊乳外泌體miRNAs在25 nt對堿基A有顯著偏好。

a-山羊乳外泌體;b-綿羊乳外泌體

2.4 已知miRNAs及預(yù)測的新miRNAs比對和表達(dá)情況

在山羊乳和綿羊乳外泌體miRNAs中,分別鑒定出161和80種成熟miRNAs,其中miR-148a、miR-26a和let-7b均在山羊乳和綿羊乳外泌體中表達(dá)量較高,miR-151只在山羊乳外泌體中檢出(表3)。

表3 部分羊乳外泌體miRNAs表達(dá)情況

此外,對新miRNAs進(jìn)行預(yù)測。在山羊乳和綿羊乳中分別預(yù)測到了5和7種新miRNAs,其中表達(dá)量最高的分別是Novel-62和Novel-82,其成熟體序列分別是:Novel-62:UCAGGACCUGUUGUUUCU和Novel-82:UAGAAAGUUUCUUUGGGGUUUU。這些新miRNAs在一定程度上豐富了山羊和綿羊乳miRNA的序列信息。

2.5 靶基因預(yù)測及GO功能分析

對山羊乳及綿羊乳外泌體中所有miRNAs靶基因進(jìn)行GO富集,發(fā)現(xiàn)山羊乳及綿羊乳外泌體miRNAs在細(xì)胞組成、生物學(xué)過程和分子功能層面均具有顯著差異。例如:山羊乳外泌體miRNAs中有49.86%的靶基因參與組成細(xì)胞骨架(圖4-a);而綿羊乳中有43.35% 參與各類細(xì)胞器的組成,如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)、高爾基體等(圖4-b)。

a-山羊乳外泌體;b-綿羊乳外泌體

在生物學(xué)過程層面,山羊乳的種類豐富,可參與定位、運(yùn)輸、蛋白質(zhì)修飾過程等(圖5-a);綿羊乳外泌體miRNAs靶基因大多集中在代謝過程,占比82.77%(圖5-b)。分子功能層面上,山羊乳外泌體miRNAs靶基因有13 706個,綿羊乳外泌體miRNA靶基因有571個。但可以看出,山羊乳及綿羊乳外泌體miRNAs靶基因蛋白質(zhì)結(jié)合、催化活性和受體結(jié)合3種類型中均有富集(圖6)。通過分析還發(fā)現(xiàn):綿羊乳外泌體miRNAs靶基因還具有腸菌素結(jié)合的功能。研究發(fā)現(xiàn)腸菌素作為一種由腸桿菌分泌的細(xì)菌素,具有調(diào)節(jié)菌群數(shù)量的作用,還可通過與ATP合成酶互作來促進(jìn)微生物對鐵的吸收及宿主發(fā)育[18]。

a-山羊乳外泌體;b-綿羊乳外泌體

a-山羊乳外泌體;b-綿羊乳外泌體

2.6 靶基因通路富集分析

對山羊乳和綿羊乳外泌體miRNAs中的靶基因進(jìn)行KEGG通路富集分析,圖7展示了富集顯著的20條通路。

a-山羊乳外泌體;b-綿羊乳外泌體

山羊乳外泌體中miRNAs中共10 512個靶基因,被富集到274條通路,其中花生四烯酸代謝、醚脂質(zhì)代謝、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、α-亞麻酸代謝、Ras信號通路、甘油磷脂新陳代謝、軸突引導(dǎo)和移植物抗宿主病這8條通路獲得顯著富集(P<0.05),最為顯著的是花生四烯酸代謝通路。

花生四烯酸是20碳鏈多不飽和脂肪酸,作為生物細(xì)胞膜的組成部分,包括環(huán)氧化酶(cyclooxygenase,COX)、脂氧合酶和細(xì)胞色素P450等3種途徑。其中COX通路是動脈粥樣硬化性和缺血性心臟病的主要治療靶點之一,可能影響該疾病的病理生理特征,包括血小板聚集、血管壁張力和動脈粥樣硬化病變中的炎癥過程[19],這些將為開發(fā)心血管疾病和癌癥的新治療藥物提供參考。

綿羊乳外泌體中miRNAs中共有1 067個靶基因被注釋到256 條通路中,其中11條獲得顯著富集(P<0.05),分別是氨基酸的生物合成,碳代謝,果糖和甘露糖代謝,蛋白質(zhì)消化吸收,癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào),葉酸生物合成,苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸的生物合成,吞噬體,核苷酸切除修復(fù)和NF-κB信號通路,最顯著富集的通路為氨基酸的生物合成。氨基酸的合成是生物合成代謝的關(guān)鍵,與兒童生長發(fā)育、免疫系統(tǒng)完善具有重要作用,這提示綿羊乳外泌體miRNAs在以上方面或許具有獨特的功能。

3 討論

本研究利用超高速離心法對羊乳樣本進(jìn)行外泌體提取和鑒定,隨后構(gòu)建了山羊乳及綿羊乳外泌體的sRNA文庫,并利用高通量測序技術(shù)研究了山羊乳和綿羊乳外泌體miRNAs的類型和表達(dá)量,最后對2種羊乳外泌體miRNAs的特點、靶基因參與的生物學(xué)過程進(jìn)行分析。

在對miRNAs序列的鑒定分析時發(fā)現(xiàn):山羊乳外泌體中鑒定出161種已知miRNAs和5種新型miRNAs序列;而在綿羊乳外泌體中鑒定出80種已知miRNAs和7種新型miRNAs序列。在已知miRNAs序列中,miR-148a、miR-26a和let-7b均在山羊乳和綿羊乳外泌體中表達(dá)量較高,其中miR-148a在2種羊乳樣本中表達(dá)量最高,分別占77.97%和79.53%,而該miRNA也在人乳中高度表達(dá),它可通過靶向TLR4介導(dǎo)的途徑抑制NF-κB 和p65的激活,且在小鼠子宮內(nèi)膜炎模型發(fā)現(xiàn)miR-148a的上調(diào)具有緩解炎癥的作用[20]。miR-151只在山羊乳外泌體中表達(dá),它通過靶向白細(xì)胞介素17A(IL-17A) 減弱動脈粥樣硬化內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,是一種動脈粥樣硬化治療的潛在途徑[21]。通過文獻(xiàn)進(jìn)行檢索后發(fā)現(xiàn),這些高表達(dá)miRNAs在減輕病原微生物感染、炎癥、抑制癌細(xì)胞增殖遷移,甚至可作為緩解某些疾病的靶點或手段,這也提示上述羊乳外泌體miRNAs可能通過以上過程參與到了人體生理功能的調(diào)節(jié)過程。

此外,生物信息學(xué)分析時發(fā)現(xiàn)山羊乳和綿羊乳外泌體miRNAs的靶基因在分子功能性上也存在差異,如山羊乳miRNAs靶基因數(shù)量較多,集中在結(jié)合和催化活性等方面;綿羊乳外泌體miRNAs部分靶基因具有腸菌素結(jié)合的功能,且對宿主發(fā)育具有一定促進(jìn)作用,上述結(jié)果提示山羊與綿羊乳外泌體miRNAs的差異化表達(dá),使得不同羊乳外泌體可能具有不同功能,而這在今后研究中應(yīng)當(dāng)給予關(guān)注。

本研究也存在某些不足之處,例如:(1)本研究采用透射電鏡和納米顆粒跟蹤分析技術(shù)對外泌體進(jìn)行鑒定,由于目前對山羊與綿羊乳研究的局限,與特異性抗體的缺乏,難以通過免疫印跡等免疫學(xué)方法鑒定外泌體;(2)在miRNAs注釋過程中發(fā)現(xiàn),綿羊乳外泌體sRNAs總數(shù)為8 041 316,與參考序列比對之后有87.11%的序列可以被準(zhǔn)確注釋;雖然山羊乳外泌體sRNAs序列與綿羊乳相當(dāng),但僅有27.09%的序列被準(zhǔn)確注釋,本研究先后使用了Capra hircus_Ensemble_97和NCBI_GCA_001704415.1_ARS1兩套基因組序列進(jìn)行比對但結(jié)果依然未能改善。造成這一情況的可能原因包括:樣本問題,即山羊乳樣品雜合度高,在進(jìn)行擴(kuò)增時使得其他序列種類增多;二是基因組重復(fù)序列的復(fù)雜性,即山羊乳外泌體重復(fù)序列種類占比22.83%,而綿羊乳僅為3.27%;2個物種的RNA數(shù)據(jù)庫信息尚不完善,也可能是造成注釋比例偏低的原因。這方面應(yīng)當(dāng)在后續(xù)的研究中予以重視。雖然存在上述2點不足,但對于2類樣本外泌體miRNAs的序列提取與表達(dá)分析仍然具有可比性。

羊乳營養(yǎng)豐富且與母乳成分較為接近,羊乳脂肪顆粒僅為牛奶的1/3,更利于人體吸收。近年來隨著羊乳及其制品逐漸被大眾接受,羊乳中功能成分的研究成為羊乳深加工與開發(fā)利用的關(guān)鍵。本研究構(gòu)建了山羊乳和綿羊乳外泌體miRNAs表達(dá)譜,為不同類型羊乳外泌體的生理功能與各自優(yōu)勢提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),也為羊乳外泌體的后續(xù)研究提供參考。