李曦明,溫燕龍,楊雪瑩,劉昱輝,李凌飛*,田洋, 2,3*

1(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南 昆明,650201)2(國(guó)家辣木加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)),云南 昆明,650201)3(普洱學(xué)院,云南 普洱,665000)

辣木(Moringaoleifera),又名鼓槌樹[1-2]。廣泛栽種于非洲、亞洲及拉丁美洲熱帶、亞熱帶地區(qū)[3]。目前,云南、廣東、海南及福建等省大量栽培。辣木富含蛋白質(zhì)、維生素A、葉酸、鈣、鐵、硒等營(yíng)養(yǎng)素,及類胡蘿卜素、酚類、黃酮類、植物甾醇、生物堿、有機(jī)酸類等功能成分。因此,辣木擁有“奇跡樹”和“母親最好的朋友”等美稱[4]。已有研究表明,辣木具有抗氧化、降血糖、降血脂、降血壓、抗癌、抗炎、抗衰老、調(diào)節(jié)腸道功能、調(diào)節(jié)睡眠質(zhì)量等功效[5-7]。

固態(tài)發(fā)酵是在基本無游離水的固體基質(zhì)上進(jìn)行的發(fā)酵過程[8]。固態(tài)發(fā)酵可以提高副產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[9],且具有操作簡(jiǎn)單、成本低、廢水產(chǎn)量低和生產(chǎn)效率高[10-11]等優(yōu)點(diǎn)。在發(fā)酵過程中,微生物可以分泌降解底物分子所需的酶[10],因此,固態(tài)發(fā)酵是生產(chǎn)生物活性物質(zhì)的一種經(jīng)濟(jì)有效的方法[9,12]。目前,利用固態(tài)發(fā)酵來提高物質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值或生物活性已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

本研究以辣木葉為研究對(duì)象,以植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)為發(fā)酵菌種,探究辣木葉發(fā)酵前后蛋白質(zhì)、黃酮、多糖、多酚的含量變化,測(cè)定其抗氧化能力,并利用超高效液相色譜高分辨質(zhì)譜(ultra high performance liquid chromatography-orbitrap exploris-mass spectrometry,UHPLC-OE-MS)技術(shù)深入探討辣木葉發(fā)酵前后物質(zhì)成分的變化,以期為乳酸菌發(fā)酵辣木葉的代謝物鑒定提供理論依據(jù),為開發(fā)相關(guān)辣木葉功能食品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣木葉,云南紅河谷辣木產(chǎn)業(yè)有限公司;植物乳桿菌CICC 194165,中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

甲醇、乙酸(色譜純),美國(guó)Fisher Chemical公司;福林-酚試劑、沒食子酸(分析純),上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

400Y粉碎機(jī),鉑歐五金制品有限公司;LRH-250智能生化培養(yǎng)箱,鄭州生元儀器有限公司;FD-1A-50冷凍干燥機(jī),上海比朗儀器制造有限公司;Vanquish超高效液相、Orbitrap Exploris120高分辨質(zhì)譜儀,美國(guó)賽默飛公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

取50 g干辣木葉粉,于121 ℃滅菌15 min,冷卻后將辣木葉粉轉(zhuǎn)移到發(fā)酵盤中,加入30 mL無菌水,調(diào)整初始含水量為60%,接種量5% 3×108CFU/mL的植物乳桿菌菌液,攪拌均勻,38 ℃發(fā)酵10 d。發(fā)酵結(jié)束后將辣木葉粉凍干,-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

參照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 黃酮含量的測(cè)定

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[2]。稱0.5 g辣木葉粉,加體積分?jǐn)?shù)60%乙醇30 mL,超聲30 min,離心后用乙醇定容至25 mL。取0.5 mL,加0.3 mL 50 g/L NaNO2溶液,0.3 mL 100 g/L Al(NO3)3溶液,4 mL 40 g/L NaOH溶液,15 min后定容至10 mL。于510 nm測(cè)定吸光度,計(jì)算總黃酮含量,如公式(1)所示,單位為mg/GAE 100 g。

(1)

式中:ρ,黃酮質(zhì)量濃度,mg/mL;V1,提取液總體積, mL;V2,吸取提取液體積, mL;m,辣木葉質(zhì)量,g。

1.3.4 多酚含量測(cè)定

以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別取0.8、1.6、2.4、3.2、4.0、6.0 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品于試管中,取1 mL 10 mg/mL的辣木葉醇溶樣品于試管中,加入2 mL 70 g/L的NaHCO3溶液,隨后加入1 mL福林酚溶液,于765 nm處測(cè)定吸光度,如公式(2)所示:

(2)

式中:ρ,多酚質(zhì)量濃度,mg/mL;V1,稀釋體積, mL;V2,樣品體積, mL;V3,取樣體積, mL;m,樣品質(zhì)量, g。

1.3.5 多糖含量的測(cè)定

參考郭剛軍等[2]的方法并加以修改。分別配制0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。取1 mL葡萄糖溶液,加0.2 mL苯酚和2.5 mL硫酸,靜置30 min,于490 nm處測(cè)定吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制0.1 mg/mL辣木粗多糖溶液,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算辣木葉多糖含量,如公式(3)所示:

(3)

1.3.6 抗氧化活性測(cè)定

1.3.6.1 DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率測(cè)定

取0.5 g辣木葉于錐形瓶中,加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇15 mL,超聲30 min,離心過濾,用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇定容至25 mL。取1 mL提取液,再加3 mL DPPH溶液,30 min后于517 nm測(cè)定吸光度。將7 mmol/L ABTS溶液與40 mmol/L K2S2O8溶液混合定容至50 mL,靜置12～16 h。ABTS陽離子自由基工作液在734 nm處吸光值要求為0.70±0.02。將0.5 mL 1 mg/mL的提取物與4 mL ABTS溶液混合,于734 nm處測(cè)定吸光度。

1.3.7 代謝物提取

將20 mg樣品置于1 000 μL提取液(甲醇∶水=3∶1,體積比)中。在35 Hz下均質(zhì)4 min,在冰水浴中超聲5 min。然后在-40 ℃孵育1 h,離心后將上清液轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣瓶中上機(jī)分析。

1.3.8 代謝物檢測(cè)

A相為水相,B相為乙腈。樣品盤溫度4 ℃,進(jìn)樣體積2 μL。護(hù)套氣體流速50 Arb,Aux氣體流速15 Arb,毛細(xì)管溫度320 ℃,MS/MS分辨率15 000,噴霧電壓3.8 kV(正)或-3.4 kV(負(fù))。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;運(yùn)用Orbitrap Exploris對(duì)樣本中的代謝物進(jìn)行檢測(cè),然后對(duì)代謝物進(jìn)行鑒定。根據(jù)P<0.05,變量重要性投影(variable importance in project,VIP)>1,進(jìn)行差異代謝物篩選,將差異代謝物通過京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)進(jìn)行注釋解析,分析差異代謝物通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣木葉發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)及功能成分含量的變化

由圖1-a可知,辣木葉經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵10 d后蛋白質(zhì)含量顯著增加(P<0.05)。蛋白質(zhì)含量從發(fā)酵前的44.92 g/100 g增加到了52.16 g/100 g。與發(fā)酵前相比,蛋白質(zhì)含量提高了16.12%。此結(jié)果與郭剛軍等[2]研究結(jié)果一致,他們采用酵母發(fā)酵自制辣木葉茶,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而增加。由圖1-b可知,未發(fā)酵辣木葉中黃酮含量為10.74 mg/g,發(fā)酵10 d后黃酮含量為10.97 mg/g,提高了2.1%,未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由圖1-c可知,發(fā)酵前辣木葉中多酚含量為45.64 mg/g,發(fā)酵后提升到53.10 mg/g,比發(fā)酵前提高了16.35%。在發(fā)酵過程中,辣木葉中多酚含量逐漸升高,最后趨于平穩(wěn)。這與張?jiān)凭甑萚12]對(duì)辣木葉經(jīng)毛霉固態(tài)發(fā)酵后多酚含量升高的結(jié)果一致。由圖1-d可知,發(fā)酵到第10天,辣木葉多糖含量從23.56%提高到33.45%,比發(fā)酵前顯著提高(P<0.05)。植物乳桿菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的纖維素酶,將辣木纖維素分解為多糖,進(jìn)而增高了辣木葉多糖含量。

a-蛋白質(zhì);b-黃酮;c-多酚;d-多糖

2.2 辣木葉發(fā)酵前后抗氧化能力變化

由圖2-a可知,發(fā)酵10 d后辣木葉的ABTS陽離子自由基清除率比發(fā)酵前略有升高,ABTS陽離子自由基清除率從70.60%上升到71.10%,但差異不顯著。由圖2-b可知,發(fā)酵10 d后,辣木葉DPPH自由基清除率雖然略有下降,從43.90%降低至38.50%,同樣差異不顯著。

a-ABTS陽離子自由基清除率;b-DPPH自由基清除率

2.3 代謝物多維統(tǒng)計(jì)分析

2.3.1 辣木葉發(fā)酵前后代謝物主成分分析(principal component analysis,PCA)

PCA可以反映辣木葉發(fā)酵前后代謝物的變化程度,采用UHPLC-OE-MS對(duì)發(fā)酵辣木葉的代謝物進(jìn)行檢測(cè)分析。在正、負(fù)離子模式下PC1和PC2累計(jì)貢獻(xiàn)率分別是64.7%和67.5%,從PCA得分圖(圖3-a、圖3-b)可知,樣本全部處于95%置信區(qū)間內(nèi),表明實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性好,樣本點(diǎn)分布越遠(yuǎn),表明整體代謝水平差異越大。在研究中,未發(fā)酵與發(fā)酵的辣木葉中代謝物可以明顯區(qū)分開,表明未發(fā)酵和發(fā)酵后的辣木葉代謝物具有顯著差異。

a-正離子模式PCA得分圖;b-負(fù)離子模式PCA得分圖;c-正離子模式OPLS-DA得分圖;d-負(fù)離子模式OPLS-DA得分圖;e-正離子模式代謝產(chǎn)物置換圖;f-負(fù)離子模式代謝產(chǎn)物置換圖

2.3.2 辣木葉發(fā)酵前后代謝物的正交偏最小二乘-判別分析(orthogonal partial least square discriminant analysis,OPLS-DA)

對(duì)模型質(zhì)量進(jìn)行檢驗(yàn)(圖3-c、圖3-d);將驗(yàn)證得到的R2Y和Q2對(duì)模型有效性進(jìn)行評(píng)判;本研究中,樣本間橫向距離遠(yuǎn),樣本組間差異大,組內(nèi)重復(fù)性好。

為避免模型出現(xiàn)過度擬合現(xiàn)象,通過置換檢驗(yàn)對(duì)模型有效性做進(jìn)一步檢驗(yàn)。本研究置換檢驗(yàn)結(jié)果如圖3-e、圖3-f所示。本研究正負(fù)離子模式下置換檢驗(yàn)?zāi)Ｐ头謩e為R2Y=0.98、Q2=-0.28;R2Y=0.99、Q2=-0.29,表明原模型不存在過擬合現(xiàn)象。

2.4 辣木葉發(fā)酵前后差異代謝物篩選

根據(jù)t檢驗(yàn)的P<0.05,同時(shí)結(jié)合OPLS-DA模型獲得的VIP>1,進(jìn)行差異代謝物的篩選,獲得物質(zhì)的火山圖(圖4),火山圖可以直觀展示組間代謝物差異的整體分布情況。

圖4 辣木葉未發(fā)酵組與發(fā)酵組的代謝物火山圖

2.5 差異代謝物聚類分析

將發(fā)酵前后辣木葉中顯著差異的代謝物進(jìn)行歸一化處理,選取相對(duì)含量較高的前40個(gè)代謝物繪制聚類熱圖。由圖5可知,在辣木葉發(fā)酵前后共檢測(cè)到

565種代謝物,主要集中在氨基酸及黃酮類。具有顯著差異的物質(zhì)有96種,其中52種代謝物顯著增加,44種顯著降低。顯著降低的物質(zhì)包括L-賴氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、煙酰胺等。結(jié)果表明,發(fā)酵組中的腺嘌呤、綠原酸、對(duì)乙酰氨基酚、次黃嘌呤、紫云英苷、金絲桃苷含量均高于未發(fā)酵組。綠原酸為多酚類化合物,具有抗菌消炎、清熱解毒的作用[13],還具有抗肝損傷、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[14-15]。金絲桃苷具有抗炎[16]、抗氧化[17]、抗癌、抗纖維化[18]等作用,對(duì)心腦缺血、肝纖維化和心力衰竭[19]等疾病有治療效果。紫云英苷是黃芪、辣木葉等多種天然植物黃酮類化合物之一。研究表明,紫云英苷具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等功效[20]。從總體來看,發(fā)酵10 d后的辣木葉中黃酮類物質(zhì)和苯丙素類化合物相對(duì)含量顯著提高,黃酮類化合物屬植物次生代謝產(chǎn)物,在植物體內(nèi)大部分與糖結(jié)合成苷類或碳糖基的形式存在,部分以游離形式存在。此外,在鑒定出的96種差異性代謝物中,發(fā)酵辣木葉中煙酰胺、L-色氨酸相對(duì)含量低于未發(fā)酵辣木葉。煙酰胺參與蛋白質(zhì)的新陳代謝,可改善人類營(yíng)養(yǎng)。色氨酸在體內(nèi)能轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥色胺、煙酸,人體缺乏色氨酸會(huì)引起一般低蛋白癥,心肌纖維化等病癥。

2.6 差異代謝物的代謝通路分析

通過KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)差異代謝物的代謝通路進(jìn)行分析。結(jié)果表明,辣木葉發(fā)酵后的差異代謝物共參與69條代謝通路,分別為氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、跨膜運(yùn)輸、其他氨基酸代謝等。以影響值>0.2為篩選依據(jù),得到5條關(guān)鍵代謝通路(圖6),分別為苯丙氨酸代謝、黃酮和黃酮醇的生物合成、異喹啉生物堿的生物合成、丙氨酸精氨酸脯氨酸代謝、天冬氨酸谷氨酸代謝。這5條代謝途徑與氨基酸類、黃酮類物質(zhì)的代謝和生物堿類等物質(zhì)的生物合成有關(guān),其中苯丙氨酸代謝的氣泡顏色最深、氣泡相對(duì)較大。苯丙氨酸屬芳香族氨基酸,在體內(nèi)經(jīng)苯丙氨酸羥化酶催化后氧化成酪氨酸,并與酪氨酸一同合成重要的神經(jīng)遞質(zhì)和激素,參與機(jī)體糖代謝和脂肪代謝。由此可見,植物乳桿菌發(fā)酵對(duì)辣木葉中氨基酸類物質(zhì)的影響最顯著。

圖6 辣木葉未發(fā)酵組對(duì)發(fā)酵組的關(guān)鍵通路分析圖

3 結(jié)論

本研究以辣木葉為研究材料,探討了植物乳桿菌發(fā)酵前后辣木葉的營(yíng)養(yǎng)成分及代謝物的變化。結(jié)果表明,發(fā)酵提高了辣木葉中的蛋白質(zhì)、黃酮、多酚、多糖含量,但辣木葉的抗氧化活性沒有顯著變化。基于UHPLC-OE-MS非靶標(biāo)代謝組學(xué)技術(shù),從未發(fā)酵和發(fā)酵的2組辣木葉中共鑒定出96種差異代謝物。通過對(duì)代謝通路進(jìn)行分析,得到5條關(guān)鍵代謝通路,這些代謝途徑與氨基酸類物質(zhì)的代謝以及黃酮類、生物堿類物質(zhì)的生物合成有關(guān),表明植物乳桿菌發(fā)酵對(duì)辣木葉營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的形成、生物活性的提高具有積極的促進(jìn)作用。本研究可為乳酸菌發(fā)酵辣木葉的代謝物鑒定提供理論依據(jù),也為開發(fā)相關(guān)辣木葉功能食品提供理論參考。