洪意,謝雅妮,吳瑜凡,秦曉杰,董慶利,王翔*

1(上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院,上海,200093)2(華東理工大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院分析測(cè)試中心,上海,200237)

沙門氏菌是最常見(jiàn)的食源性致病菌之一,能夠?qū)е履c胃炎和敗血癥等疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì),在全球范圍內(nèi)沙門氏菌每年造成約1.53億例腸道感染病例以及5.7萬(wàn)人死亡[1]。在中國(guó),沙門氏菌也成為了細(xì)菌性食源性疾病的第二大常見(jiàn)原因[2],腸炎沙門氏菌(Salmonellaentericaserovar Enteritidis)是其中重要的血清型之一,主要通過(guò)禽類及其副產(chǎn)品等食品傳播感染[3]。

隨著抗生素的廣泛甚至不合理使用,細(xì)菌耐藥性普遍增強(qiáng)給細(xì)菌感染的控制帶來(lái)挑戰(zhàn)。據(jù)2018年中國(guó)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)(China antimicrobial surveillance network,CHINET)的報(bào)道,細(xì)菌耐藥性整體呈上升趨勢(shì),耐藥菌的分離比2017年增加了28.7%[4]。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)沙門氏菌主要對(duì)四環(huán)素、氨芐西林、磺胺類與鏈霉素等抗生素藥物表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性[5]。其中,氨芐西林作為第一種廣譜β-內(nèi)酰胺類抗生素,可通過(guò)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成發(fā)揮作用[6],在細(xì)菌中的耐藥狀況較為嚴(yán)重[7]。細(xì)菌主要通過(guò)修飾青霉素結(jié)合蛋白、生產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶、改變膜的通透性以及促進(jìn)外排泵等方式提高對(duì)氨芐西林的耐藥性[8],而耐藥基因則通過(guò)染色體基因突變與水平基因轉(zhuǎn)移等方式獲得[9]。水平基因轉(zhuǎn)移既是細(xì)菌整體耐藥性快速上升的重要原因,也是耐藥基因傳播的主要手段,耐藥基因由質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等載體以低于染色體基因突變的成本,賦予細(xì)菌耐藥的特性[10],而腸炎沙門氏菌中含有許多的耐藥質(zhì)粒。

細(xì)菌在獲得耐藥性后通常會(huì)發(fā)生生長(zhǎng)速率下降及對(duì)不利環(huán)境的抗性降低,這種現(xiàn)象稱為適應(yīng)性代價(jià)[11]。也有研究發(fā)現(xiàn)耐藥性的獲得會(huì)誘導(dǎo)細(xì)菌對(duì)常見(jiàn)的食品相關(guān)壓力產(chǎn)生交叉抗性,導(dǎo)致細(xì)菌在食品鏈中具有更強(qiáng)的存活能力[12],造成食品安全隱患。對(duì)于氨芐西林此類作用于細(xì)胞壁的抗生素,細(xì)菌可通過(guò)一系列信號(hào)通路的協(xié)調(diào)反應(yīng)改變細(xì)菌的代謝和抗性,加之不同種類細(xì)菌間的異質(zhì)性以及抗生素作用機(jī)制不同,變化有待進(jìn)一步探究。因此,本研究將通過(guò)質(zhì)粒導(dǎo)入的方式賦予腸炎沙門氏菌氨芐西林的耐藥特征,并檢測(cè)轉(zhuǎn)化后菌株的耐藥性、生長(zhǎng)特性、熱與酸抗性的變化,以期為沙門氏菌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以及在食品加工環(huán)節(jié)中的防治提供參考,從而保障食品安全。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)中所用的5株抗生素敏感腸炎沙門氏菌及含pKD46的大腸埃希氏菌為本實(shí)驗(yàn)室保存。野生型腸炎沙門氏菌均分離于食品,1、4號(hào)來(lái)自雞肉,2、3、5號(hào)來(lái)自豬肉。經(jīng)藥敏測(cè)試發(fā)現(xiàn)對(duì)包括氨芐西林、頭孢唑啉、四環(huán)素、亞胺培南等在內(nèi)17種抗生素藥物敏感。100 μg/mL的LA培養(yǎng)基與培養(yǎng)液由1 000 mL滅菌的LB培養(yǎng)基與培養(yǎng)液中加入100 mg/mL的氨芐西林原液1 mL配制而成。

LB培養(yǎng)基,青島海博生物有限公司;SOC培養(yǎng)液、MH培養(yǎng)液(Mueller-Hinton Broth),上海生工生物工程有限公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒,上海捷瑞生物工程有限公司;甘油、鹽酸(分析純),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;氨芐西林原液,北京博奧森生物科技有限公司;GN4F革蘭氏陰性菌藥敏板,美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。

Bioscreen C全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀,芬蘭Oy Growth Curves Ab公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化

野生沙門氏菌(WT)在LB培養(yǎng)液中于37 ℃,靜置培養(yǎng)24 h到達(dá)穩(wěn)定期。含有pKD46質(zhì)粒的大腸埃希氏菌和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的沙門氏菌在含有100 μg/mL氨芐西林的LA培養(yǎng)基中培養(yǎng),30 ℃靜止培養(yǎng)至穩(wěn)定期。

1.2.2 質(zhì)粒提取與感受態(tài)細(xì)胞制備

大腸埃希氏菌活化后,根據(jù)上海捷瑞生物工程有限公司質(zhì)粒小量提取試劑盒說(shuō)明書步驟提取pKD46質(zhì)粒。使用電轉(zhuǎn)法進(jìn)行沙門氏菌轉(zhuǎn)化,采用甘油洗滌法制備感受態(tài)細(xì)胞。將活化后的沙門氏菌在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)至OD值為0.5。將培養(yǎng)完成的菌液置于冰上冷卻30 min后分裝至15 mL離心管中,4 ℃下2 500 r/min離心10 min,除去上清液。再用雙蒸水重懸菌體,離心去除上清液。隨后再用預(yù)冷的10%(體積分?jǐn)?shù))甘油,重懸離心2次以至徹底去除菌液中的離子。最后加入500 μL預(yù)冷的10%(體積分?jǐn)?shù))甘油重懸。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

采用電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化沙門氏菌,先取3 μL質(zhì)粒與0.2 cm電擊杯置于冰上預(yù)冷,再將質(zhì)粒與感受態(tài)細(xì)胞混合均勻,置于電擊杯中,輕輕敲擊杯壁使混合液體進(jìn)入杯底。將電轉(zhuǎn)儀調(diào)至2.5 kV,電擊后,迅速加入1 mL的SOC溶液重懸細(xì)胞,輕輕吹吸數(shù)次后轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞懸液在30 ℃下220 r/min振蕩復(fù)蘇2 h。取100 μL復(fù)蘇菌液于LA平板上涂布,培養(yǎng)觀察轉(zhuǎn)化情況。挑取單菌落于LA培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)至穩(wěn)定期與50%(體積分?jǐn)?shù))甘油混合保存于-80 ℃下,為后續(xù)試驗(yàn)所用。

1.2.4 最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)值測(cè)定

使用革蘭氏陰性菌藥敏板對(duì)轉(zhuǎn)化后的沙門氏菌(pKD46)對(duì)多種抗生素的MIC值進(jìn)行測(cè)定。從LA培養(yǎng)基上挑取3～5個(gè)生長(zhǎng)正常的單菌落,在無(wú)菌水中乳化,充分混合并調(diào)為0.5麥?zhǔn)蠞岫取Ｈ?0 μL配制好的菌液與10 mL的MH培養(yǎng)液混合,移至藥敏板中,每孔30 μL。將藥敏板于37 ℃下靜置培養(yǎng)24 h,觀察孔中是否生長(zhǎng),并參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(Clinical and Laboratory Standardization, CLSI)對(duì)抗生素耐藥性進(jìn)行判斷。

1.2.5 生長(zhǎng)特性測(cè)定

對(duì)野生及轉(zhuǎn)化后沙門氏菌在25、30、35 ℃下的生長(zhǎng)特性,包括最大比生長(zhǎng)速率(μmax)和延滯期(λ)進(jìn)行測(cè)定。將培養(yǎng)至穩(wěn)定期的菌液進(jìn)行梯度稀釋,每個(gè)濃度取200 μL于100微孔板中在全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀(BioscreenC)測(cè)定生長(zhǎng)狀態(tài),溫度設(shè)定為25、30、35 ℃,中等強(qiáng)度振動(dòng),每10 min檢測(cè)1次OD600。通過(guò)不同稀釋梯度的菌液濃度與檢測(cè)時(shí)間(time to detection,Tdet)做線性回歸計(jì)算最大比生長(zhǎng)速率μmax,檢測(cè)時(shí)間即定義為初始的OD值至達(dá)到菌液濃度107CFU/mL時(shí)所對(duì)應(yīng)OD值的時(shí)間,計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

式中:slope,斜率。

基于以上公式所求μmax值,根據(jù)BARANYI等[13]提出的方法計(jì)算延滯期λ,計(jì)算如公式(2)所示:

(2)

式中:x0,初始菌量,CFU/mL;xdet,達(dá)到檢測(cè)時(shí)間的菌數(shù),CFU/mL;Tdet,OD值達(dá)到107CFU/mL濃度的時(shí)間,h;μmax,對(duì)數(shù)期細(xì)菌生長(zhǎng)的最大比生長(zhǎng)速率,lg CFU/h;λ,生長(zhǎng)延滯期,h。

1.2.6 熱失活特性測(cè)定

采用WANG等[14]的方法對(duì)菌在55 ℃/12 min、57.5 ℃/3 min、60 ℃/12 s的處理下觀察存活情況。取培養(yǎng)至穩(wěn)定期的菌液30 μL于PCR管中,按照對(duì)應(yīng)的溫度與處理時(shí)間在PCR儀中從37 ℃開(kāi)始升溫,處理結(jié)束后迅速將PCR管置于冰水中停止熱失活,對(duì)初始菌液及熱失活后菌液進(jìn)行梯度稀釋并進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。以近似D值作為熱失活表征參數(shù),計(jì)算如公式(3)所示:

(3)

式中:t,熱處理時(shí)間,min;N0,初始菌濃度,CFU/mL;Nt,熱處理后菌濃度,CFU/mL。

1.2.7 酸失活特性測(cè)定

依據(jù)沙門氏菌在酸化培養(yǎng)液中處理后細(xì)菌對(duì)數(shù)減少量判斷耐酸情況,實(shí)驗(yàn)中采用1%(體積分?jǐn)?shù))鹽酸將培養(yǎng)液pH調(diào)至3.0。取1 mL培養(yǎng)至穩(wěn)定期的沙門氏菌至酸化的LB培養(yǎng)液中,4 ℃培養(yǎng)18 h后,3 600 r/min離心5 min,用普通的LB培養(yǎng)液重懸離心2次,沉淀菌體用1 mL的LB重懸后于梯度稀釋并在平板上計(jì)數(shù),對(duì)比耐藥質(zhì)粒導(dǎo)入前后的對(duì)數(shù)減少值。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)不少于2次,計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。單因素方差分析(one-way analysis of variance,ANOVA)和圖基(Tukey’s)檢驗(yàn)對(duì)不同耐藥表型沙門氏菌之間的生長(zhǎng)延滯期、最大比生長(zhǎng)速率、熱失活特性及酸抗性的差異進(jìn)行顯著性分析。試驗(yàn)采用95%置信限,P<0.05則差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)均通過(guò)SPSS 25進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐藥沙門氏菌MIC測(cè)定

經(jīng)耐藥質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后共獲得5株沙門氏菌耐藥菌株。革蘭氏陰性菌藥敏板對(duì)質(zhì)粒導(dǎo)入后的沙門氏菌進(jìn)行了16種抗菌藥物的MIC測(cè)定,表1展示了其中MIC值發(fā)生變化的6種抗生素耐藥情況。整體而言,經(jīng)質(zhì)粒導(dǎo)入氨芐西林耐藥基因不易導(dǎo)致廣泛的交叉耐藥。其中,轉(zhuǎn)化后的沙門氏菌對(duì)氨芐西林/舒巴坦鈉、頭孢唑啉與替卡西林/克拉維酸的MIC值普遍增加;米諾環(huán)素與呋喃妥因的MIC值普遍下降,1號(hào)與5號(hào)菌對(duì)氨芐西林/舒巴坦鈉的耐藥表型和1號(hào)、4號(hào)與5號(hào)對(duì)頭孢唑啉的耐藥表型均從敏感變?yōu)槟退帯?/p>

表1 質(zhì)粒導(dǎo)入前后腸炎沙門氏菌對(duì)不同抗生素的MIC值

2.2 生長(zhǎng)特性分析

質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的沙門氏菌整體生長(zhǎng)特性存在較為顯著的變化(圖1)。在3種溫度條件下,沙門氏菌的平均生長(zhǎng)延滯期λ均發(fā)生了顯著的延長(zhǎng)(P<0.05),25 ℃時(shí)由3.02 h延至5.59 h;30 ℃時(shí)由2.09 h延至4.48 h;35 ℃時(shí)由2.27 h延至3.02 h。而對(duì)于最大比生長(zhǎng)速率μmax的平均值在轉(zhuǎn)化前后則無(wú)顯著差異。

a-生長(zhǎng)延滯期;b-最大比生長(zhǎng)速率

2.3 熱抗性分析

質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的5株耐藥沙門氏菌,在3種溫度條件下近似D值均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖2),即耐藥沙門氏菌對(duì)熱的抗性降低。其中,平均近似D值在55 ℃下由4.76 min降至3.35 min,差異不顯著;在57.5 ℃下由1.70 min顯著降至0.64 min(P<0.01);在60 ℃下由0.77 min顯著降至0.24 min(P<0.01)。

圖2 野生型與耐藥型腸炎沙門氏菌近似D值

2.4 酸抗性分析

野生型與質(zhì)粒導(dǎo)入的耐藥型沙門氏菌整體在pH=3.0條件下細(xì)菌減少量如圖3所示,耐藥菌的平均對(duì)數(shù)減少值雖然低于野生型,但兩者之間的酸抗性無(wú)顯著性差異。其中,野生型沙門氏菌的對(duì)數(shù)減少平均值為2.90 lg CFU/mL,耐藥型沙門氏菌為1.81 lg CFU/mL。

圖3 野生型與耐藥型腸炎沙門氏菌對(duì)數(shù)減少值

3 討論與結(jié)論

腸炎沙門氏菌是一種人畜共患的食源性致病菌,質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因傳播以及所帶來(lái)的生長(zhǎng)特性與抗性給耐藥細(xì)菌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估帶來(lái)新的挑戰(zhàn)。本研究將含有氨芐西林耐藥基因的外源質(zhì)粒pKD46導(dǎo)入敏感的腸炎沙門氏菌中,并對(duì)轉(zhuǎn)化后沙門氏菌的耐藥性、生長(zhǎng)特性以及熱與酸抗性進(jìn)行了探究,發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒介導(dǎo)氨芐西林耐藥的腸炎沙門氏菌對(duì)其他不同種類的抗生素交叉抗性較弱,延滯期λ增長(zhǎng)而最大比生長(zhǎng)速率μmax無(wú)顯著差異,熱抗性降低,酸抗性無(wú)顯著差異。

CHOI等[15]在探究質(zhì)粒介導(dǎo)的耐黏菌素大腸埃希氏菌生長(zhǎng)特征時(shí)得到了與本研究相似的結(jié)論,3株耐藥大腸埃希氏菌的最大比生長(zhǎng)速率μmax與敏感菌無(wú)顯著性差異。JIANG等[16]同樣發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入含有廣譜β-內(nèi)酰胺酶的pHK01質(zhì)粒對(duì)大腸埃希氏菌的生長(zhǎng)曲線無(wú)影響,然而當(dāng)質(zhì)粒中的一些sRNA過(guò)表達(dá)時(shí)會(huì)使延滯期改變。推測(cè)質(zhì)粒本身或許比其攜帶的耐藥基因?qū)?xì)菌生長(zhǎng)特性的影響更大。減毒的鼠傷寒沙門氏菌在導(dǎo)入真核表達(dá)質(zhì)粒plRES2-RGFP-4-1BBL后,生長(zhǎng)繁殖較親本變慢[17]。在對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌的研究中發(fā)現(xiàn),在自然營(yíng)養(yǎng)條件下具有較大質(zhì)粒的菌株比無(wú)質(zhì)粒的敏感菌株衰減更快[18]。而在自然環(huán)境中,適應(yīng)性代價(jià)較低的質(zhì)粒在傳播中占據(jù)更大優(yōu)勢(shì)[19],WANG等[20]比較了自然分離的沙門氏菌生長(zhǎng)特性,發(fā)現(xiàn)敏感、耐藥與多重耐藥菌株間的生長(zhǎng)并無(wú)顯著性差異。

目前,關(guān)于研究耐藥質(zhì)粒與食品相關(guān)壓力抗性關(guān)聯(lián)的研究較少。在自然分離的菌株中,質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因傳播是細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)的主要原因,研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌[21]、單增李斯特菌[22]和大腸埃希氏菌[23]等的敏感與耐藥菌株間熱抗性不存在顯著性差異,然而本次研究中發(fā)現(xiàn)耐藥沙門氏菌的耐熱性是顯著降低的。熱激蛋白是生物體在應(yīng)急條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白質(zhì),通常作為分子伴侶協(xié)助熱損傷的蛋白進(jìn)行修復(fù)與折疊[24]。耐藥質(zhì)粒的導(dǎo)入能在短時(shí)間內(nèi)擾亂宿主原有的基因表達(dá),包括熱激蛋白,而自然界分離的耐藥菌中耐藥質(zhì)粒則在長(zhǎng)久的傳播中實(shí)現(xiàn)了補(bǔ)償性進(jìn)化從而盡可能減小了對(duì)宿主基因組的影響,這可能是解釋實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的原因之一。此外,研究發(fā)現(xiàn)攜帶四環(huán)素抗性基因的質(zhì)粒與沙門氏菌中的熱激誘導(dǎo)相關(guān)[25],肺炎克雷伯氏菌中預(yù)測(cè)細(xì)菌熱抗性蛋白的基因與廣譜β-內(nèi)酰胺酶的基因通過(guò)質(zhì)粒共傳播的現(xiàn)象[26],均表明耐藥質(zhì)粒的傳播與細(xì)菌熱抗性之間存在著復(fù)雜的聯(lián)系。而酸抗性的結(jié)果更加多樣,研究發(fā)現(xiàn)大腸埃希氏菌的敏感菌株耐酸能力更強(qiáng)[23],相反,單增李斯特菌[22]與金黃色葡萄球菌[21]的耐藥菌株酸抗性更強(qiáng),而在沙門氏菌中酸抗性則與耐藥性無(wú)關(guān)[27-28]。細(xì)菌的酸抗性主要包括3種機(jī)制:提高胞內(nèi)pH、酸激蛋白的修復(fù)以及細(xì)胞膜修飾[29],其中許多與耐藥機(jī)制相同,如外排泵、雙組分系統(tǒng)調(diào)節(jié)以及改變膜的通透性等[30],因此不同菌株各自的特性及不同抗生素耐藥機(jī)制導(dǎo)致研究間出現(xiàn)了較強(qiáng)的異質(zhì)性。

綜上所述,腸炎沙門氏菌在導(dǎo)入含有特定基因的耐藥質(zhì)粒后,耐藥譜變化較小,交叉抗性主要體現(xiàn)在作用機(jī)制相似的抗生素中;細(xì)菌的最大比生長(zhǎng)速率μmax不變,延滯期λ增長(zhǎng);耐藥菌的耐熱性顯著降低,對(duì)食品生產(chǎn)加工過(guò)程中致病菌的防控有利;耐藥菌的酸抗性有所增加,但不顯著,不足以產(chǎn)生抗性的交叉保護(hù),然而這可能與細(xì)菌的種類以及抗生素的耐藥機(jī)制相關(guān)。試驗(yàn)結(jié)果一定程度上說(shuō)明質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因傳播不會(huì)增加食品生產(chǎn)加工過(guò)程中致病菌防控的負(fù)擔(dān),但耐藥性的提高仍會(huì)增加動(dòng)物飼養(yǎng)以及臨床治療的難度,且目前相關(guān)的研究數(shù)量較少,細(xì)菌與抗生素種類的多樣性同樣不容忽視,需要更多深入的研究為耐藥性食源性致病菌的防控提供支持與參考。