嵇熠彬,梅永超,楊波,陳海琴

(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122)

共軛亞油酸(conjugated linoleic acid, CLA)是具有共軛雙鍵的十八碳二烯酸的總稱,是亞油酸(linoleic acid, LA)的立體和幾何異構體[1]。其中,c9,t11-CLA和t10,c12-CLA等2種單體獲得了美國食品和藥物管理局安全認證,大量研究證明CLA具有抗癌、預防心血管疾病、改善炎癥等功能[2-3],但是不同的單體具有不同的生理活性。c9,t11-CLA可以抑制腸癌細胞的生長,誘導乳腺癌細胞的凋亡,具有抗癌、改善炎癥等生理功能[2-3],而t10,c12-CLA具有減少脂質積累的作用[4],并且t10,c12-CLA在某些動物模型中會促進結腸癌細胞的轉移、乳腺腫瘤細胞生長以及子宮癌細胞生長等[5-6]。無論是為了研究不同CLA單體的生理功能,還是為了滿足特定的生理需求,獲得CLA單體都具有重要的現實意義。

來源于短雙歧桿菌的亞油酸異構酶(Bifidobacteriumbreveisomerase, BBI)是目前唯一已知的乳酸菌源的單酶轉化LA生成c9,t11-CLA的亞油酸異構酶[7]。不同于植物乳桿菌中的多組分酶系,需經水合、脫水、移位等5步反應生成c9,t11-CLA[8-9],BBI可以經單步反應轉化LA生成c9,t11-CLA[7]。有研究表明,短雙歧桿菌CCFM683是一株具有較高CLA生物轉化能力的雙歧桿菌,不僅可以轉化LA生成c9,t11-CLA(轉化率高達90.3%),還可以轉化α-亞麻酸(α-linolenic acid, ALA)和γ-亞麻酸(γ-linolenic acid, GLA)生成相應的共軛亞麻酸(conjugated linolenic acid, CLNA)[7]。

然而,短雙歧桿菌作為一種嚴格厭氧菌,對生長環(huán)境要求極為嚴苛;培養(yǎng)基成分復雜,培養(yǎng)成本昂貴,較難應用于工業(yè)化生產[10-11]。因此,實現BBI在合適宿主中的表達不僅具有工業(yè)化生產c9,t11-CLA的潛力,還有助于獲得一定量的純化蛋白來研究BBI的結構與功能。大腸桿菌作為優(yōu)良的表達宿主,具有生長速度快、培養(yǎng)成本低廉、遺傳背景清晰等優(yōu)點,被廣泛應用于目的基因的異源表達和工業(yè)化生產[12-13]。根據重組蛋白的不同表達需求特性,生物技術公司開發(fā)了一系列商業(yè)化大腸桿菌宿主,如E.coliBL21(DE3)-pLysS菌株,它是在E.coliBL21(DE3)菌株的基礎上加入了可以表達T7溶菌酶的基因,能在不影響目的基因表達的同時降低背景表達水平,因此適用于表達某些對宿主有危害的重組蛋白;E.coliRosetta(DE3)菌株則補充了大腸桿菌中的6種稀有密碼子對應的轉運RNA,它可以顯著提高外源基因的表達水平。

此外,目的蛋白異源表達時可以引入標簽,組氨酸標簽作為一種分子質量小、對蛋白分泌、折疊影響較小的蛋白標簽,一方面便于檢測目的蛋白的表達量,另一方面也可以作為純化標簽實現快速純化[14]。盡管有上述優(yōu)勢,但組氨酸標簽添加的位置會對部分目的蛋白的表達量和活性產生重大影響,標簽位置是目的蛋白異源表達時必須要考慮的影響因素之一[15]。

因此,本研究采用大腸桿菌作為表達宿主,將來源于短雙歧桿菌CCFM683的亞油酸異構酶bbi基因在3種類型的大腸桿菌宿主中進行異源表達,通過改變標簽位置、優(yōu)化蛋白表達條件,實現BBI蛋白的異源表達。在此基礎上,初步探究了BBI對不同脂肪酸底物的偏好性,同時利用分子對接技術解釋其潛在的原因,這為進一步揭示BBI的結構與功能關系奠定了研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

E.coliBL21/pET-28a(+)-bbi-His、E.coliBL21/pET-28a(+)-His-bbi、E.coliBL21 pLysS/pET-28a(+)-bbi-His、E.coliBL21 pLysS/pET-28a(+)-His-bbi、E.coliRosetta/pET-28a(+)-bbi-His、E.coliRosetta/pET-28a(+)-His-bbi,現保藏于江南大學食品學院生物技術中心菌種庫。

1.1.2 試劑

異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG),上海生工生物工程公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒,碧云天生物技術公司;酸洗玻璃珠,美國BioSpec公司;LA(純度≥99%)、內標十五烷酸(C15∶0),Sigma-Aldrich公司;重氮甲烷、2.0 mol/L己烷溶液,百靈威科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基及主要試劑配制

Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基(g/L):NaCl 10,胰蛋白胨10,酵母提取物5。

磷酸鹽破碎緩沖液(mg/L):KH2PO4901.9,K2HPO4587.422,pH=6.5。

LA母液(30 mg/mL):300 mg LA,20 mg吐溫-80加水定容至10 mL,充分乳化后用0.22 μm無菌濾膜過濾除菌,-20 ℃保存。ALA和GLA以同樣的方式進行配制。

卡那霉素(100 mg/mL):1 g卡那霉素加水定容至10 mL,混合溶解后用0.22 μm無菌濾膜過濾除菌,-20 ℃保存。

氯霉素(34 mg/mL):340 mg氯霉素加無水乙醇定容至10 mL,充分溶解后用0.22 μm無菌濾膜過濾除菌,-20 ℃保存。

十五烷酸內標(2 mg/mL):100 mg十五烷酸加正己烷定容至50 mL,充分溶解后分裝,-20 ℃保存。

1.1.4 儀器與設備

Trace 1300氣相色譜儀,美國賽默飛世爾科技有限公司;組織破碎儀,寧波新芝生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組菌誘導表達

將本實驗室構建并保存的重組菌進行復蘇培養(yǎng),在含不同抗生素的LB平板上劃線培養(yǎng)至單菌落產生,挑取單菌落至5 mL LB液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng),以1%(體積分數)的接種量接種至20 mL LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)至OD600在0.6～0.8之間,添加誘導劑IPTG至終濃度為0.2 mmol/L后16 ℃誘導培養(yǎng)。誘導結束后經8 000×g離心5 min,收集菌體,保存于-80 ℃冰箱中用于后續(xù)實驗。

1.2.2 誘導表達條件優(yōu)化

IPTG濃度優(yōu)化:在不同濃度的IPTG(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)下,重組菌于16 ℃誘導8 h,測定酶活力以確定IPTG的最佳濃度。

1.2.3 BBI活性檢測

KPB緩沖液重懸菌體,加入等體積的酸洗玻璃珠,通過組織破碎儀進行破碎,提取粗蛋白用于活性檢測。取1 mg破碎的粗蛋白,加入10 μL LA母液定容至1 mL,于37 ℃、200 r/min反應2 h,待反應結束通過重氮甲烷甲酯化,利用氣相色譜法進行脂肪酸檢測[16]。

氣相色譜條件:初始溫度150 ℃,以5 ℃/min升溫至200 ℃,保持10 min;以4 ℃/min升溫至240 ℃,保持10 min。載氣He,進樣器和檢測器溫度保持在240 ℃[17]。

BBI的粗酶活性檢測指標為共軛脂肪酸的轉化率,即LA轉化生成CLA,LNA轉化生成CLNA的轉化率。CLA轉化率和CLNA轉化率的計算如公式(1)和公式(2)所示:

(1)

(2)

1.2.4 BBI序列信息分析及分子對接

使用ExPASy(http://www.expasy.ch/tools/)分析蛋白的基本理化性質。利用RoseTTAFold(https://www.rosettacommol/Lmmol/Lol/Lons.org/software/servers#rosie)構建BBI的三維結構模型,從ZinC數據庫獲得LA、ALA和GLA的三維結構,使用拉氏圖提供的信息對蛋白模型進行質量評估。使用AutoDock 4.2軟件以構建的BBI蛋白模型為受體,將3種脂肪酸分別作為配體進行分子對接,對接參數采用默認設置。

其中：是狀態(tài)向量；是神經網絡的量測輸出；是神經網絡的估計輸出；是干擾輸入；；是連接權矩陣；是具有適當維數的常數矩陣；是常數輸入；是初始條件，變時滯滿足，是已知常數；是神經元的激活函數，滿足

2 結果與分析

2.1 BBI序列信息分析

2.1.1 BBI蛋白的理化性質分析

使用ExPASy軟件分析顯示,BBI蛋白由330個氨基酸組成,理論分子質量為37.18 kDa,分子式為C1753H2591N419O442S18,理論等電點8.63。該蛋白由20種氨基酸組成,其中含量最豐富的氨基酸為丙氨酸(占10.9%),含量最少的是組氨酸(占1.5%),帶負電荷的殘基總數為16,帶正電荷的殘基總數為21。BBI的脂肪系數為98.76,親水系數為0.482,是疏水蛋白,其不穩(wěn)定指數為26.36,說明其為穩(wěn)定蛋白。結合BBI在原始短雙歧桿菌CCFM683中為膜結合蛋白這一推測,它在異源表達過程中可能會出現表達量低或者重組蛋白無活性等情況[7]。

圖1 BBI蛋白的氨基酸組成

2.1.2 BBI蛋白三級結構預測與建模

BBI作為新發(fā)現的膜結合型亞油酸異構酶,與已知結構的蛋白同源性低,利用RoseTTAFold的從頭建模方式模擬其三維結構,結果見圖2-a。一個合理的模型構象落在不允許區(qū)域的氨基酸殘基數目在總蛋白中的占比應低于5%。由其構象評估由圖2-b可知,BBI蛋白內部92.9%的氨基酸殘基位于最適區(qū)域(紅色),0.3%的氨基酸殘基位于不允許區(qū)域(白色),所以構建的模型結構是合理的。β2腎上腺素能受體中有7段α螺旋,一部分形成了識別底物的底物結合口袋,另一部分接觸底物并形成不同構象[18]。BBI蛋白分子中47.58%的氨基酸殘基處于α螺旋區(qū)域,其余肽鏈則以無規(guī)則卷曲和轉角結構連接著10段α螺旋,這些螺旋不是完全筆直的,其中1/3的螺旋中存在著不利于螺旋形成的脯氨酸,形成略微彎折的螺旋結構,BBI整體呈桶狀,其結構與β2腎上腺素能受體結構相似,與底物結合的方式也可能相近。

2.2 組氨酸標簽位置和不同大腸桿菌宿主對BBI粗酶活性的影響

2.2.1 組氨酸標簽位置對BBI粗酶活性的影響

組氨酸標簽作為一個分子質量較小的常見標簽,其仍會對目的蛋白的表達產生影響。ESEN等[15]在研究甲酸脫氫酶(Chaetomiumthermophilumformate dehydrogenase,CtFDH)時發(fā)現組氨酸標簽位于C端時CtFDH的比酶活力是其位于N端時的3倍。朱圣花[19]在研究重組人釉原蛋白(recombinant human amelogenin,rhAm)時發(fā)現,當組氨酸標簽位于C端時rhAm完全不表達,將其添加到N端時rhAm表達能力變強。因此,為確定組氨酸標簽位置對BBI異源表達的影響,本文構建了組氨酸標簽分別位于N端和C端的重組質粒pET-28a(+)-His-bbi和pET-28a(+)-bbi-His,將其轉化至E.coliBL21(DE3)中。由圖3中E.coliBL21(黑色)可知,與空載對照相比,2株BBI大腸桿菌重組菌均具有轉化LA至CLA的能力,說明目的基因成功實現了在大腸桿菌中的異源表達。BBI在E.coliBL21(DE3)中表達時,組氨酸標簽位于BBI的C端時CLA轉化率(73.7%)明顯高于其位于N端時CLA轉化率(7.9%),組氨酸標簽位于BBI的N端時可能影響了BBI蛋白的表達和酶活力。馬君燕等[20]發(fā)現鷹嘴豆孢克魯維酵母外切菊粉酶的C端可能具有促進酶和底物結合作用,加上組氨酸標簽后影響其結合,從而影響酶的催化活性。由圖2-a可知,BBI蛋白分子中9段α螺旋共同構成一個“桶”,形成一個空腔,若將組氨酸標簽添加到N端可能對這個空腔的構象產生影響,進而影響底物與活性位點的結合。

圖3 不同大腸桿菌重組菌的轉化率

2.2.2 不同大腸桿菌宿主對BBI粗酶活性的影響

利用原核表達系統進行異源表達時需要考慮很多因素,包括選擇合適的宿主、構建合適的重組質粒以及優(yōu)化誘導表達條件等。職韶陽等[21]在表達鳶尾素(irisin)時發(fā)現E.coliRosetta-irisin較E.coliBL21-irisin的表達量提高了2.3倍。因此,為探究不同類型的大腸桿菌表達宿主對BBI的影響,本研究將已獲得的2個重組載體在E.coliBL21、E.coliBL21-pLysS和E.coliRosetta中分別進行表達,共6個重組菌。由圖3可知,在3個大腸桿菌表達宿主中,組氨酸標簽位于N端的粗酶活性均明顯弱于組氨酸標簽位于C端時。同時,重組質粒pET-28a(+)-bbi-His分別在3個宿主中進行表達時,E.coliBL21 pLysS/pET-28a(+)-bbi-His(86.96%)和E.coliRosetta/pET-28a(+)-bbi-His(86.11%)這2種類型的大腸桿菌宿主中的粗酶活性略高于其在E.coliBL21/pET-28a(+)-bbi-His(73.69%)中的活性。因此,選取重組菌株E.coliRosetta/pET-28a(+)-bbi-His、E.coliBL21/pET-28a(+)-bbi-His和E.coliBL21 pLysS/pET-28a(+)-bbi-His作為后續(xù)優(yōu)化實驗的出發(fā)菌株。

2.3 BBI誘導表達條件優(yōu)化

IPTG作為強誘導劑,不能被菌體所代謝且具有一定的細胞毒性,影響菌體的生長和蛋白的表達。誘導時間過短會導致目的蛋白無法大量表達,而誘導時間過長則可能會因為菌體衰亡釋放有毒物質,從而導致目的蛋白降解或者活性減弱。因此,本研究對誘導劑濃度和誘導時間進行了單因素優(yōu)化,通過BBI粗酶活性檢測目的蛋白表達情況。

本研究考察了誘導劑IPTG的濃度對BBI表達的影響,結果如圖4-a所示,IPTG濃度在0.2～1.0 mmol/L之間時,E.coliRosetta/pET-28a(+)-bbi-His粗酶活性隨著誘導劑濃度增加略微增強,且粗酶活性高于其他2株重組菌[E.coliBL21 pLysS/pET-28a(+)-bbi-His和E.coliBL21/pET-28a(+)-bbi-His]。綜合考慮粗酶活性及實驗成本,將E.coliRosetta/pET-28a(+)-bbi-His和E.coliBL21 pLysS/pET-28a(+)-bbi-His的IPTG最佳誘導濃度定為1.0 mmol/L,將E.coliBL21/pET-28a(+)-bbi-His的IPTG最佳誘導濃度定為0.6 mmol/L。

a-誘導劑IPTG濃度;b-誘導時間

本研究進一步考察了誘導時間對BBI表達的影響,結果如圖4-b所示,在4～8 h內,BBI的粗酶活性隨著誘導時間的延長逐漸升高;在8～24 h內,BBI的粗酶活性隨著誘導時間的延長逐漸降低,因此最佳誘導時間為8 h。

綜上所述,BBI的最佳表達條件為E.coliRosetta/pET-28a(+)-bbi-His菌株以1.0 mmol/L IPTG誘導8 h。

2.4 BBI對不同脂肪酸底物的偏好性分析

短雙歧桿菌CCFM683不僅可以轉化LA生成CLA,還可以轉化LNA生成CLNA[7]。本文為探究BBI對于不同游離脂肪酸的偏好性,以ALA、GLA和LA為底物測定轉化率。如圖5所示,BBI粗酶對ALA的利用能力最高,可達63.54%,其次為LA,對GLA的利用能力最弱,僅為20.15%,這與BBI在短雙歧桿菌CCFM683中的表現出來的偏好性一致。因此,相較于LA和GLA,BBI粗酶更偏好轉化ALA。

圖5 BBI粗酶對不同脂肪酸底物的轉化率

通過AutoDock軟件將組氨酸標簽位于BBI的C端的重組蛋白和3種底物(ALA、GLA和LA)分別進行對接。選取了蛋白與底物的最佳復合結果,計算其結合自由能。ALA、GLA和LA對應的結合自由能分別為-31.51、-30.17和-31.80 kJ/mol,均形成了2個氫鍵而無其他作用力。在分子對接中,結合自由能越低則構象越穩(wěn)定,與蛋白質結合力越強。一般認為,結合自由能>-16.74 kJ/mol結合力極弱或無結合能力;-29.29 kJ/mol<結合自由能≤-16.74 kJ/mol結合力中等;結合自由能≤-29.29 kJ/mol結合力較強。因此,這3種底物與BBI的結合力均較強,且三者的結合自由能相差不大,缺乏晶體結構和活性位點信息,對接結果可能存在誤差。同時,由圖6可知,這3種底物都與Arg243形成氫鍵,推測其為BBI結合位點之一;由圖2-a(紅色殘基)可知,Arg243位于9段α螺旋形成的空腔內,與之前組氨酸標簽位于N端時影響B(tài)BI與底物的結合推測一致。

a-LA;b-ALA;c-GLA

3 結論

c9,t11-CLA具有許多重要的生理功能,目前市售的CLA為多種同分異構體的混合物。BBI是目前唯一已知的乳酸菌來源的的單酶轉化生成c9,t11-CLA的亞油酸異構酶,具有很好的應用前景。前期研究發(fā)現短雙歧桿菌CCFM683只能在生長過程中轉化LA,其靜息細胞不具備轉化能力,同時BBI經預測為九次跨膜蛋白,在短雙歧桿菌CCFM683中的表達量極低,為了解決這個問題,對BBI進行異源表達和優(yōu)化重組表達條件勢在必行[7]。

本研究在3種類型的大腸桿菌宿主中實現了BBI的異源表達,并且探究了組氨酸標簽位于C端和N端時對粗酶活性的影響,在此基礎上,通過對誘導劑IPTG的濃度和誘導時間進行優(yōu)化,確定了組氨酸標簽位于C端的重組質粒在E.coliRosetta中進行表達,并以1.0 mmol/L的IPTG誘導8 h,BBI的粗酶活性最高。在最佳誘導條件下,初步探究了BBI對不同底物的偏好性,確定了其對ALA的利用能力最強,其次為LA,最后是GLA。通過分子對接技術,確定了BBI與底物的潛在結合位點Arg243位于空腔內,這與組氨酸位于目的蛋白N端時粗酶活性明顯較低這一實驗結果相符。綜上,本研究為進一步研究BBI的結構與功能關系奠定基礎。