喬晉芳,杜煥敏,劉川,祁玉婷,吳碩,徐寧,戴玉杰,邵麗,劉君*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津,300457)2(中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所,天津,300308)3(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱,150038)

L-半胱氨酸是一種重要的含硫氨基酸,被廣泛用于醫(yī)藥制造、食品加工及飼料生產(chǎn)等領(lǐng)域[1-4]。全球每年L-半胱氨酸需求超過4 000 t,市場前景十分光明[5]。目前,L-半胱氨酸的工業(yè)生產(chǎn)仍采用鹽酸水解毛發(fā)的傳統(tǒng)生產(chǎn)模式[6],但這種方法有很大的局限性,如收率低和環(huán)境污染嚴(yán)重。微生物發(fā)酵法具有原料來源廣泛、生產(chǎn)條件溫和、環(huán)境友好和過程容易控制等優(yōu)勢,越來越受到各國的重視。

微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-半胱氨酸常用的菌株主要是大腸桿菌(Escherichiacoli)和谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)[7-9]。由于L-半胱氨酸代謝合成網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜且具細(xì)胞毒性[3,10-11],建立高效L-半胱氨酸生產(chǎn)菌株面臨困難。因此,降低細(xì)胞毒性是微生物發(fā)酵法高效生產(chǎn)L-半胱氨酸的一種有效策略。早期的研究報道,有效的外排系統(tǒng)可以維持細(xì)胞內(nèi)氨基酸的穩(wěn)態(tài),降低反饋抑制和細(xì)胞毒性,并進(jìn)一步提高生產(chǎn)能力[5,12-13]。LIU等[14]在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了一種新的L-蛋氨酸外排蛋白YjeH,它顯著提高了L-蛋氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)能力,并將L-蛋氨酸的產(chǎn)量提高了70%。ZHANG等[15]在谷氨酸棒桿菌中發(fā)現(xiàn)了一種新的L-絲氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SerE,SerE過表達(dá)極大地提高了菌株對L-絲氨酸的耐受性,并進(jìn)一步提高了L-絲氨酸的產(chǎn)量。外排系統(tǒng)在L-半胱氨酸的生產(chǎn)中也發(fā)揮著重要作用,能夠顯著增強(qiáng)L-半胱氨酸的分泌能力和耐受性,從而進(jìn)一步提高L-半胱氨酸生產(chǎn)能力[5,16]。在大腸桿菌中已鑒定出至少5種L-半胱氨酸外排蛋白,包括EamA、EamB、Bcr、CydDC和TolC[2]。過表達(dá)上述外排蛋白后,胞內(nèi)L-半胱氨酸水平顯著降低,同時L-半胱氨酸耐受性和生產(chǎn)能力顯著提高[17]。此外,CefA和CefB被鑒定為菠蘿泛菌的L-半胱氨酸外排蛋白,過表達(dá)這些蛋白可降低生長抑制效應(yīng)并促進(jìn)胞外L-半胱氨酸積累[18]。

谷氨酸棒桿菌作為一種重要的食品安全級工業(yè)微生物,被認(rèn)為是生產(chǎn)各種氨基酸的理想菌株[19-20]。在谷氨酸棒桿菌中,約750種膜蛋白涉及17個轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族作為氨基酸候選轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。然而,很少有關(guān)于谷氨酸棒桿菌L-半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究。為了提高谷氨酸棒桿菌L-半胱氨酸的生產(chǎn)能力,尋求其自身的L-半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有重要意義。因此,本研究通過轉(zhuǎn)錄組分析尋找谷氨酸棒桿菌中潛在的L-半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,然后測試不同候選基因缺失突變體的L-半胱氨酸耐受性和外排能力,最終確定Cg1298-Cg1299為谷氨酸棒桿菌的L-半胱氨酸外排蛋白,并通過發(fā)酵實(shí)驗(yàn)探究了轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對L-半胱氨酸發(fā)酵的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

表1列出了本研究中使用的所有菌株。其中大腸桿菌DH5a與谷氨酸棒桿菌ATCC 13032均由中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所保藏。

本研究中使用的質(zhì)粒列于表2。大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pECXK-99E用于基因表達(dá),pCRD206用于基因敲除。

表2 本研究所用的質(zhì)粒

1.1.2 工具酶及試劑

T4DNA連接酶、Eco31 I、XbaI、BamH I、Phusion DNA聚合酶,Thermo Fisher公司;質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒,天根生物公司;卡那霉素,索萊寶生物科技有限公司;L-半胱氨酸,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;瓊脂粉、腦心浸液、胰蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、尿素、山梨醇、玉米漿,天津百賽斯生物科技有限公司;其他試劑(如NaCl、K2HPO4、MgCl2等)均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

Luria-Bertani(LB)(g/L):酵母提取物 5,胰蛋白胨 10,NaCl 10。LBHIS(g/L):酵母提取物 2.5,胰蛋白胨 5,腦心浸液 18.5,NaCl 5,山梨醇 91。CGXII(g/L):葡萄糖 5,NH4Cl 20,尿素 5,KH2PO41,K2HPO41.3,MgCl20.25,CaCl210 mg/L,3-嗎啉丙磺酸42,生物素0.2 mg/L,維生素B10.1 mg/L,原兒茶酸0.03 mg/L,FeCl210 mg/L,MnCl210 mg/L,ZnCl21 mg/L,CuCl20.2 mg/L,NiCl20.02 mg/L。種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 30,玉米漿 20,(NH4)2SO45,尿素 2,MgSO40.5,KH2PO40.5。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 80,玉米漿 30,Na2S2O320,KH2PO41,MgSO40.5,L-蛋氨酸 0.5,L-異亮氨酸 0.5,MnSO40.01,FeSO40.01,維生素B11 mg/L,生物素0.2 mg/L。此外,向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加20 g/L CaCO3以緩沖pH。PBS(pH=7.2)(g/L):NaCl 8,KH2PO40.2,Na2HPO4·12 H2O 2.9,KCl 0.2。其中固體培養(yǎng)基加20 g/L瓊脂粉。

大腸桿菌DH5a為宿主細(xì)胞,在37 ℃ LB培養(yǎng)基中進(jìn)行基因克隆。谷氨酸棒桿菌ATCC 13032在32 ℃ LBHIS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。如有抗生素需求,將50 μg/L或25 μg/L卡那霉素分別添加到培養(yǎng)基中,用來培養(yǎng)大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因敲除

利用特異性引物以谷氨酸棒桿菌ATCC 13032基因組DNA為模板擴(kuò)增目標(biāo)基因。PCR擴(kuò)增使用Phusion DNA聚合酶。通過Gibson組裝方法將純化的產(chǎn)物克隆到目標(biāo)載體中[21],并獲得重組質(zhì)粒。根據(jù)OKIBE等[22]報道的方法,通過兩步同源重組法構(gòu)建谷氨酸棒桿菌的基因缺失菌株。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測序分析

將過夜培養(yǎng)谷氨酸棒桿菌ATCC 13032按照初始OD600值為0.1的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮LBHIS培養(yǎng)基,向體系中添加不同濃度的L-半胱氨酸(5、20、50 mmol/L)。當(dāng)菌株生長到對數(shù)中期時,立即采集樣本進(jìn)行RNA提取。RNA制備純細(xì)胞/細(xì)菌試劑盒用于分離提純總RNA。轉(zhuǎn)錄組測序在北京諾禾致源科技股份有限公司完成,參考基因組為(https://www.genome.jp/dbget-bin/get_linkdb?-t+genes+gn:T00244)。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果已上傳NCBI SRA數(shù)據(jù)庫,登錄號:PRJNA942449。

1.2.3L-半胱氨酸耐受性分析

瓊脂平板中隨機(jī)選擇單克隆,在32 ℃ LBHIS培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。洗滌并收集菌體,PBS重懸,將重懸后的菌液轉(zhuǎn)接到新鮮的LBHIS培養(yǎng)基中(含有0、2.5、5、7.5、10 mmol/LL-半胱氨酸),初始OD600值為0.1。32 ℃,200 r/min培養(yǎng)定時取樣,使用紫外分光光度計(中國上海鑫茂儀器)在600 nm處檢測吸光度值。

1.2.4 二肽攝取和L-半胱氨酸外排測定

為了表征野生型和缺失突變體的外排性能,使用二肽Cys-Tyr測試L-半胱氨酸的外排能力[23]。菌株在LBHIS培養(yǎng)基中32 ℃過夜培養(yǎng)。低速離心收菌、重懸并轉(zhuǎn)接至新鮮CGXII培養(yǎng)基中,初始OD600值為0.1。菌體達(dá)到中期生長階段,立即收菌并用32 ℃預(yù)熱的PBS將其重懸至OD600= 10。將重懸物轉(zhuǎn)接到32 ℃預(yù)熱的CGXII培養(yǎng)基中,并加入10 mmol/L的Cys-Tyr,在200 r/min,32 ℃條件下培養(yǎng)10 min取樣,測定細(xì)胞外L-半胱氨酸濃度。

1.2.5 搖瓶發(fā)酵

挑選單菌落WT、cg1298-R、cg1299-R和cg1298-1299-R接種至5 mL LBHIS 液體培養(yǎng)基中,200 r/min,32 ℃過夜培養(yǎng)。以5%接種量接種至20 mL種子培養(yǎng)基中,200 r/min,32 ℃培養(yǎng)12 h后,轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)L-半胱氨酸,控制初始OD值為1,發(fā)酵時長為72 h。

1.2.6L-半胱氨酸測定方法

使用GAITONDE[24]的標(biāo)準(zhǔn)方法測定L-半胱氨酸的濃度。茚三酮溶液與L-半胱氨酸發(fā)生特異性反應(yīng),形成的粉紅色產(chǎn)物在560 nm處可檢測到吸收光。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-半胱氨酸對谷氨酸棒桿菌生長的影響

L-半胱氨酸的細(xì)胞毒性被認(rèn)為是微生物法發(fā)酵生產(chǎn)L-半胱氨酸的一個限制因素[3,17,23]。為了研究這一毒性機(jī)制對谷氨酸棒桿菌的影響,我們首先監(jiān)測了在不同濃度L-半胱氨酸(0、2.5、5、7.5、10 mmol/L)脅迫下谷氨酸棒桿菌的生長能力。如圖1所示,谷氨酸棒桿菌生物量隨L-半胱氨酸濃度的增加而降低,尤其在添加10 mmol/LL-半胱氨酸壓力下,該菌株的生物量僅為對照組的44%。

圖1 谷氨酸棒桿菌在不同濃度L-半胱氨酸脅迫下的細(xì)胞生長測定

2.2 轉(zhuǎn)錄組分析L-半胱氨酸對谷氨酸棒桿菌的影響

為了探究谷氨酸棒桿菌的L-半胱氨酸解毒機(jī)制,我們對其進(jìn)行了不同濃度L-半胱氨酸 (5、20、50 mmol/L)的脅迫,并做轉(zhuǎn)錄組測序分析。

2.2.1 轉(zhuǎn)錄組分析L-半胱氨酸生物合成途徑基因變化

為了進(jìn)一步了解L-半胱氨酸對谷氨酸棒桿菌的影響,我們分析了L-半胱氨酸生物合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)變化。谷氨酸棒桿菌中L-半胱氨酸的合成途徑包括碳模塊和硫模塊,其中硫模塊分為硫酸鹽同化途徑和硫代硫酸鹽同化途徑。在谷氨酸棒桿菌中硫酸鹽同化途徑比較清晰,但是硫代硫酸鹽同化途徑鮮有報道。如圖2所示,受到L-半胱氨酸脅迫時,谷氨酸棒桿菌硫酸鹽同化途徑的關(guān)鍵基因表達(dá)量都顯著下降,這將會降低其硫同化的速度,進(jìn)而影響L-半胱氨酸的生物合成。另一方面,L-半胱氨酸碳模塊的基因表達(dá)量也都下調(diào),使得更少的代謝流流向L-半胱氨酸合成途徑,進(jìn)一步影響合成L-半胱氨酸。以50 mmol/LL-半胱氨酸處理組為例,與對照組相比,硫酸鹽同化途徑基因cysD、cysN、cysH、cysI和cysJ分別下降93.1%、94.5%、93.7%、91.1%和84.7%;L-半胱氨酸的碳模塊基因serA、serC、serB、cysE和cysK分別下降27.0%、26.6%、39.0%、16.8%和78.5%。由于L-半胱氨酸具有細(xì)胞毒性,使得谷氨酸棒桿菌不能積累過量的L-半胱氨酸,這成為以谷氨酸棒桿菌為底盤菌株生產(chǎn)L-半胱氨酸不可避免的問題。先前的研究報道,將L-半胱氨酸從體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到體外可以降低L-半胱氨酸對細(xì)胞的毒害作用[25],從而提高菌株對L-半胱氨酸的耐受性,因此,尋找合適的L-半胱氨酸外排蛋白顯得尤為重要。

圖2 轉(zhuǎn)錄組分析L-半胱氨酸生物合成途徑基因表達(dá)水平變化

2.2.2 谷氨酸棒桿菌外排蛋白篩選

谷氨酸棒桿菌中對L-半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究甚少,本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序,以轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在3個L-半胱氨酸脅迫條件下的表達(dá)量變化為依據(jù),尋找谷氨酸棒桿菌中潛在的L-半胱氨酸外排蛋白。為了進(jìn)一步篩選谷氨酸棒桿菌中的天然L-半胱氨酸外排蛋白,使用火山圖分析了L-半胱氨酸脅迫下實(shí)驗(yàn)組中的差異表達(dá)基因,如圖3-a所示,與野生型谷氨酸棒桿菌ATCC 13032相比,在5、20、50 mmol/LL-半胱氨酸處理組中分別有131、245、303個基因上調(diào),122、198、262個基因下調(diào)。其中,與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的差異表達(dá)基因131個,其中表達(dá)上調(diào)基因有32個,結(jié)合KEGG注釋從差異表達(dá)基因中選出14個候選的L-半胱氨酸外排蛋白基因cg2812、cg2279、cg1664、cg1100、cg0314、cg3321、cg3245、cg2339、cg2301、cg2277、cg1288、cg0456、cg1298和cg1299(表3、圖3-b),其中實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)對候選基因cg1298和cg1299進(jìn)行了初步的探究[26]。

表3 L-半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白候選基因

2.3 谷氨酸棒桿菌L-半胱氨酸外排蛋白功能鑒定

2.3.1L-半胱氨酸候選蛋白對谷氨酸棒桿菌生長影響

為了探究候選外排蛋白的L-半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能,我們對野生型谷氨酸棒桿菌ATCC 13032中15個候選基因分別進(jìn)行敲除,將所得菌株在含有0 mmol/L和7.5 mmol/LL-半胱氨酸的LBHIS培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)8 h后測定其細(xì)胞生長。如圖3-c所示,在0 mmol/LL-半胱氨酸處理組中,所有菌株的生長沒有明顯差異。然而在7.5 mmol/LL-半胱氨酸處理組中,cg1298和cg1299缺失菌株的生物量顯著減少,與野生型谷氨酸棒桿菌ATCC 13032菌株相比分別下降了13.5%和16.7%。

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),cg1298和cg1299在基因組上有重疊區(qū)域(圖3-d),推測其可能協(xié)同發(fā)揮功能。因此,對cg1298和cg1299同時進(jìn)行敲除,并研究了該雙敲菌株對L-半胱氨酸的耐受性。結(jié)果表明,與單敲菌株相比,雙敲菌株對L-半胱氨酸更加敏感,與野生型谷氨酸棒桿菌ATCC 13032菌株相比,其生長降低了24.2%(圖3-c)。為了進(jìn)一步研究cg1298和cg1299的功能,對雙敲菌株進(jìn)行了基因的回補(bǔ),得到其回補(bǔ)菌株Δcg1298-cg1299-R,并進(jìn)行生長測試(圖3-e)。如圖3-e所示,回補(bǔ)菌株的生長與野生型谷氨酸棒桿菌ATCC 13032的基本一致,證明了回補(bǔ)菌株恢復(fù)了其對L-半胱氨酸的抗性。

2.3.2 Cg1298-Cg1299對L-半胱氨酸外排能力測定

外排能力被認(rèn)為是外排蛋白的一項(xiàng)重要指標(biāo)。為更好地了解候選蛋白Cg1298-Cg1299對L-半胱氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)能力,使用二肽Cys-Tyr檢測3種缺失菌(Δcg1298、Δcg1299 和Δcg1298-cg1299)的L-半胱氨酸外排能力。二肽轉(zhuǎn)運(yùn)原理如圖4-a所示,Cys-Tyr穿過細(xì)胞膜經(jīng)過細(xì)胞代謝分解成氨基酸后,L-半胱氨酸通過外排蛋白排出胞外。

a-L-半胱氨酸外排示意圖;b-胞外L-半胱氨酸含量

由圖4-b可知,與野生型谷氨酸棒桿菌ATCC 13032相比,3株缺失菌株的L-半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)能力都有不同程度下降,尤其是雙敲菌株,其L-半胱氨酸的外排能力下降了26.3%。綜上所述, Cg1298和Cg1299具有L-半胱氨酸的外排功能。接著,以谷氨酸棒桿菌 ATCC 13032為研究對象,利用網(wǎng)站https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins& 對Cg1298和Cg1299進(jìn)行同源性分析,發(fā)現(xiàn)Cg1298和Cg1299與大腸桿菌中CydDC具有一定的同源性,相似性分別為29%和29%(表4)。早期研究指出,CydDC屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族,具有轉(zhuǎn)運(yùn)谷胱甘肽和半胱氨酸的能力,其主要形成一個復(fù)合體行使轉(zhuǎn)運(yùn)功能[27-29]。因此,推測Cg1298-Cg1299具有與大腸桿菌CydDC相似的功能,可能也以復(fù)合體的形式行使轉(zhuǎn)運(yùn)功能,這也與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致(圖3-e、圖4-b)。

表4 谷氨酸棒桿菌中L-半胱氨酸外排蛋白的同源性分析

2.3.3 Cg1298-Cg1299對L-半胱氨酸發(fā)酵影響

由于cg1298-cg1299雙敲菌株顯著降低了L-半胱氨酸的耐受性及轉(zhuǎn)運(yùn)能力,推測Cg1298-Cg1299是谷氨酸棒桿菌中與L-半胱氨酸外排相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。研究指出,L-半胱氨酸的外排可以增強(qiáng)菌株對L-半胱氨酸的耐受性,提高L-半胱氨酸的產(chǎn)量[23]。在本研究中,將cg1298、cg1299和cg1298-cg1299分別在L-半胱氨酸底盤菌株Q中過表達(dá)[3],成功構(gòu)建了3株工程菌株(Q-cg1298、Q-cg1299、Q-cg1298-1299)。結(jié)果表明,與對照菌株相比,3株菌株的細(xì)胞生長在培養(yǎng)前48 h無明顯差異,然而48 h后生物量均略微下降(圖5-a)。如圖5-b所示,過表達(dá)菌株Q-cg1298-1299的L-半胱氨酸產(chǎn)量在搖瓶發(fā)酵中產(chǎn)量達(dá)到466 mg/L,比對照菌株(398 mg/L)提高約17.1%,這與L-半胱氨酸的耐受性和外排能力一致(圖3、圖4),從而進(jìn)一步證明了Cg1298-Cg1299是谷氨酸棒桿菌的L-半胱氨酸外排蛋白。

3 結(jié)論與討論

如今,隨著代謝工程和合成生物學(xué)的蓬勃發(fā)展,微生物已經(jīng)成為了生產(chǎn)各種產(chǎn)品的一個有前景的工具[30-32]。針對產(chǎn)品毒性和產(chǎn)量問題,外排系統(tǒng)對產(chǎn)量提高的重要性日益明顯,尤其是氨基酸生產(chǎn)[33-35]。在對Cg1298-Cg1299的詳細(xì)研究中,根據(jù)以下證據(jù)確定其為谷氨酸棒桿菌中新的L-半胱氨酸外排蛋白:(a)轉(zhuǎn)錄組分析得出無論以高濃度還是低濃度L-半胱氨酸刺激,cg1298和cg1299的基因表達(dá)量都被上調(diào);(b)cg1298-cg1299雙敲菌株對L-半胱氨酸的敏感性顯著增強(qiáng),而回補(bǔ)菌株則恢復(fù)了對L-半胱氨酸的抗性;(c)與野生型谷氨酸棒桿菌 ATCC 13032相比,cg1298-cg1299雙敲菌株對L-半胱氨酸的外排能力顯著降低;(d)在L-半胱氨酸生產(chǎn)菌株中過表達(dá)cg1298-cg1299顯著提高了L-半胱氨酸的產(chǎn)量,從應(yīng)用的角度證明其外排功能。

先前的研究報道,外排系統(tǒng)在氨基酸積累中起著關(guān)鍵作用。MALLA等[36]通過功能性宏基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了一種L-賴氨酸外排蛋白MglE,通過過表達(dá)該外排蛋白使大腸桿菌對L-賴氨酸的耐受性提高了40%,并將谷氨酸棒桿菌中L-賴氨酸產(chǎn)量提高了7.8%。WEI等[3]在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)了大腸桿菌來源的L-半胱氨酸外排蛋白Bcr,該菌株的L-半胱氨酸產(chǎn)量顯著增加,約為對照菌株的2倍。本研究在L-半胱氨酸底盤菌中過表達(dá)了外排蛋白Cg1298-Cg1299,發(fā)酵72 h后L-半胱氨酸產(chǎn)量比對照組提高約17.1%。綜上所述,本研究鑒定了一種新的L-半胱氨酸外排蛋白,在谷氨酸棒桿菌中挖掘半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有助于了解菌株對L-半胱氨酸的耐受機(jī)制,為進(jìn)一步構(gòu)建高效L-半胱氨酸細(xì)胞工廠提供了新的參考。