劉嬌嬌,孟金浩,梁權(quán)耀,曾婷靖,左恩輝,龐宗文,李樹波*

1(廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院,廣西 南寧,530004)2(廣西大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,廣西 南寧,530004)

作為一種食品添加劑,β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,EC 3.2.1.23)能夠水解乳糖為葡萄糖和半乳糖[1-2],被廣泛用于降低乳制品中乳糖含量,進(jìn)而解決消費(fèi)者中的乳糖不耐受問題[3]。近年來,隨著乳糖不耐受癥狀逐漸大齡化,β-半乳糖苷酶的需求也逐年增加[4-6]。β-半乳糖苷酶廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物,而微生物源β-半乳糖苷酶具有周期短、產(chǎn)量高、不受季節(jié)氣候影響等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于β-半乳糖苷酶的工業(yè)生產(chǎn)[7-9]。不同微生物源β-半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)的差異性為其在不同環(huán)境中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)[10]。目前,微生物生產(chǎn)工業(yè)中主要使用的菌種包括:(1)乳酸克魯維酵母、脆壁酵母等酵母菌;(2)米曲霉、黑曲霉等霉菌,其酶最適溫度較高、最適pH偏酸性,適合面包及酸奶等酸性環(huán)境下使用[11-12]。馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)常見于發(fā)酵乳制品當(dāng)中,與乳酸克魯維酵母同為克魯維酵母屬,也是β-半乳糖苷酶的優(yōu)質(zhì)來源。它具備比乳酸克魯維酵母更強(qiáng)的耐熱性,使其在較高溫度的應(yīng)用環(huán)境中更具有優(yōu)勢(shì)。與此同時(shí),馬克斯克魯維酵母作為生長(zhǎng)速率最快的真核生物,其在β-半乳糖苷酶的生產(chǎn)過程中具備更高的效率[13]。雖然當(dāng)前已報(bào)道的研究中有很多利用廉價(jià)碳源進(jìn)行生產(chǎn)的研究,但對(duì)廉價(jià)氮源的利用卻少之又少,且產(chǎn)酶量不穩(wěn)定。

本研究對(duì)馬克斯克魯維酵母GX-UN120最適產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化,選取幾種廉價(jià)氮源進(jìn)行嘗試,并進(jìn)一步對(duì)β-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征,以期為不同環(huán)境中的工業(yè)應(yīng)用提供新的選擇。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)條件

馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)GX-UN120為廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院龐宗文教授惠贈(zèng)。馬克斯克魯維酵母接種于酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose medium, YPD)(10 g/L酵母粉、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖)中,40 ℃、150 r/min培養(yǎng)12～16 h,固體培養(yǎng)基則在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)。

1.2 試劑及儀器

蛋白胨、瓊脂粉、PBS、鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷(o-nitrophenyl β-D-galactopyranoside,ONPG),北京索萊寶科技有限公司;酵母粉、胰蛋白胨,英國(guó)Oxoid公司;葡萄糖,上海滬試試驗(yàn)器材股份有限公司;NaCl、乳糖、麥芽糖,成都金山化學(xué)試劑有限公司;FeCl2、FeCl3、CaCl2、MnCl2、MgCl2、CuCl2,天津歐博凱化工有限公司;大豆蛋白胨、玉米漿干粉,北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司。

MQL-61R恒溫?fù)u床,上海晏泉儀器有限公司;DHP-9082恒溫培養(yǎng)箱,上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;BT103S分配型蠕動(dòng)泵,保定雷弗科技有限公司;XO-400SD細(xì)胞破碎儀,南京先歐儀器制造有限公司;M200PRO光柵型酶標(biāo)儀,瑞士TECAN公司;MINIC-100金屬浴,德譽(yù)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備。

1.3 最適產(chǎn)酶條件單因素優(yōu)化

以YPD為初始培養(yǎng)基對(duì)GX-UN120產(chǎn)β-半乳糖苷酶的主要影響因素進(jìn)行單因素優(yōu)化,培養(yǎng)36 h獲得粗酶液的單位酶活力為指標(biāo)。將培養(yǎng)基中碳源等量替換為蔗糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、果糖;培養(yǎng)基中氮源等量替換為大豆蛋白胨、胰蛋白胨、玉米漿干粉、(NH4)2SO4;發(fā)酵溫度分別為25、30、35、40、45 ℃(pH 6.5, 200 r/min);初始pH分別為5.5、6、6.5、7、7.5、8(40 ℃、200 r/min);搖床轉(zhuǎn)速分別為0、50、100、150、200 r/min(40 ℃, pH 6.5)。

1.4 粗酶液的提取

將供試菌液以2%(體積分?jǐn)?shù))接種量接種于YPD液體培養(yǎng)基中,200 r/min,40 ℃培養(yǎng)36 h。取30 mL菌液離心10 min(4 ℃、8 000 r/min),棄去上清液,收集菌體。用pH 7.0,10 mmol/L的PBS重懸洗滌菌體。然后加入30 mL PBS并將其置于冰上進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎(250 W, 5 s/5 s,20 min),細(xì)胞破碎液經(jīng)8 000 r/min離心10 min后取上清液,經(jīng)0.22 μm濾膜抽濾后即為粗酶液。

1.5 β-半乳糖苷酶的純化

1.5.1 (NH4)2SO4分級(jí)沉淀

將9個(gè)裝有10 mL粗酶液的燒杯置于冰水浴中,在磁力攪拌條件下緩緩向其中加入研磨后的(NH4)2SO4粉末,分別添加至不同飽和度(20%～90%)。繼續(xù)攪拌20 min后在4 ℃下靜置30 min。靜置后離心(4 ℃、8 000 r/min、15 min)取上清液,測(cè)定酶活力,以確定沉淀所用最佳的(NH4)2SO4飽和度。依照測(cè)定獲得的最佳(NH4)2SO4飽和度,緩緩向粗酶液中添加(NH4)2SO4粉末,取最佳(NH4)2SO4飽和度范圍內(nèi)析出的沉淀物,于PBS中復(fù)溶后待后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.5.2 透析脫鹽

將1.5.1節(jié)中所獲得的復(fù)溶酶液裝入透析袋中,然后將其置于4 ℃冰柜中透析,每5 h換1次超純水直至粗酶液中電導(dǎo)率不再改變。

1.5.3 DEAE-Sepharose陰離子交換柱層析

預(yù)先將DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱用pH 6.5的PBS沖洗平衡4個(gè)柱體積,再將透析獲得的粗酶液上樣15 mL。分別使用濃度為0.1、0.3、0.5、0.7 mol/L NaCl緩沖液進(jìn)行沖洗,流速1 mL/min,洗脫180 min,每6 min收集1管洗脫液。最后將收集的洗脫液依次在280 nm下測(cè)定其吸光度并繪制洗脫曲線。對(duì)收集獲得的每一個(gè)洗脫峰進(jìn)行乳糖酶活力檢測(cè),將具有活性的洗脫液經(jīng)透析脫鹽、凍干復(fù)溶后得到純化酶。

1.5.4 蛋白濃度檢測(cè)

粗酶液及純化酶中的蛋白濃度采用BCA法測(cè)定其質(zhì)量濃度。

1.6 β-半乳糖苷酶的活性測(cè)定

采用ONPG試驗(yàn)法測(cè)定[14]。以10 mmol/L,pH 6.5的PBS為溶劑配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的ONPG溶液。取400 μL上述溶液于2 mL離心管中,35 ℃預(yù)熱10 min后,加入200 μL稀釋后的β-半乳糖苷酶酶液,于35 ℃反應(yīng)15 min后加入2.5 mL,0.15 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng),靜置5 min后,用酶標(biāo)儀測(cè)定反應(yīng)液在420 nm波長(zhǎng)處的吸光度。將35 ℃條件下,1 min催化ONPG反應(yīng)生成1 μmol鄰硝基苯酚(o-nitrophenol,ONP)的酶量定義為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活力單位[15]。

最適溫度及熱穩(wěn)定性測(cè)定:分別將200 μL酶液加入到400 μL提前預(yù)熱的ONPG溶液中,于25、30、35、40、45 ℃的金屬浴中反應(yīng)15 min后測(cè)定其相對(duì)酶活力;將200 μL酶液于20、30、40、50、60 ℃的金屬浴中熱處理30 min后再測(cè)定其酶活力。

最適pH及pH穩(wěn)定性測(cè)定:分別用pH 4、5、6、7、8、9的PBS溶液配制ONPG溶液,再加入200 μL酶液于40 ℃的金屬浴中反應(yīng)15 min后測(cè)定其相對(duì)酶活力。將純化后的酶分別溶于pH 4、5、6、7、8、9的PBS中,30 min后取200 μL加入到對(duì)應(yīng)pH的ONPG溶液中測(cè)定相對(duì)酶活力。

金屬離子對(duì)酶活力影響:用含有10 mmol/L不同金屬鹽的(CaCl2、CuCl2、MgCl2、ZnCl2、FeCl2、FeCl3、MnCl2)PBS配制ONPG溶液,再加入200 μL酶液后于40 ℃的金屬浴中反應(yīng)15 min后測(cè)定其相對(duì)酶活力。

酶促動(dòng)力學(xué)測(cè)定:以10 mmol/L,pH 6.5的PBS為溶劑分別配制質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL的ONPG溶液。分別取400 μL上述溶液與200 μL酶液于40 ℃的金屬浴中反應(yīng)15 min后測(cè)定其相對(duì)酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬克斯克魯維酵母最適產(chǎn)酶條件單因素優(yōu)化

2.1.1 碳源及氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶量的影響

如圖1所示,不同碳源下GX-UN120的β-半乳糖苷酶產(chǎn)量呈現(xiàn)出顯著差異,以半乳糖和乳糖為碳源時(shí)的產(chǎn)酶量分別為21.8和19.5 U/mL,是以葡萄糖為碳源的7.7和6.9倍,這可能表示該菌株表達(dá)β-半乳糖苷酶的相關(guān)基因受乳糖操縱子調(diào)控。此外,除去常見的有機(jī)無機(jī)氮源外還選擇了2種廉價(jià)氮源,其中玉米漿干粉效果最佳產(chǎn)酶量達(dá)到了3.1 U/mL,推測(cè)為玉米漿干粉中的維生素及無機(jī)鹽對(duì)酵母產(chǎn)酶產(chǎn)生了促進(jìn)作用。

a-碳源組;b-氮源組

2.1.2 培養(yǎng)基初始pH及溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶量的影響

溫度通過影響菌體內(nèi)相關(guān)催化酶的活性來影響菌體的生長(zhǎng)和繁殖速率,從而影響其產(chǎn)酶量。如圖2所示,GX-UN120在40 ℃時(shí)產(chǎn)酶量最高,當(dāng)溫度偏離40 ℃,產(chǎn)酶量與溫度的改變值均成負(fù)相關(guān)。此外,不同的初始pH對(duì)菌株產(chǎn)酶量也有類似的影響。pH為6.5時(shí),菌株產(chǎn)酶量達(dá)到最大值,這表明菌株更偏好中性環(huán)境。

a-溫度;b-pH

2.1.3 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌株產(chǎn)酶量影響

搖床轉(zhuǎn)速通過影響搖瓶發(fā)酵的溶氧量來影響菌株的代謝。由圖3可知,轉(zhuǎn)速<150 r/min時(shí)菌株的產(chǎn)酶量較低且轉(zhuǎn)速的改變對(duì)產(chǎn)酶量幾乎沒有影響。而轉(zhuǎn)速150 r/min時(shí),菌株的產(chǎn)酶量最高。推測(cè)為β-半乳糖苷酶的表達(dá)需要一定量的O2激活,在未達(dá)到一定量的溶氧環(huán)境下以低水平進(jìn)行本底表達(dá)。

圖3 轉(zhuǎn)速對(duì)菌株產(chǎn)酶量的影響

2.2 β-半乳糖苷酶的純化

2.2.1 (NH4)2SO4分級(jí)沉淀

由圖4可知,當(dāng)(NH4)2SO4飽和度由300 g/L提高到400 g/L時(shí),上清液的相對(duì)酶活力降低了61.01%,這表明大部分酶在300～400 g/L的飽和度間被沉淀了下來。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇保留300～400 g/L所獲得的沉淀,用10 mmol/L,pH 6.5的PBS復(fù)溶后于4 ℃冰箱保存待后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

圖4 添加不同濃度(NH4)2SO4后上清液的相對(duì)酶活力

2.2.2 DEAE-FastFlow陰離子交換柱層析

根據(jù)前期對(duì)該酶基因序列的測(cè)序結(jié)果,預(yù)測(cè)該酶的等電點(diǎn)小于7,因此選用DEAE-FF陰離子交換柱對(duì)該酶進(jìn)行純化[16]。如圖5所示,分別在0.3、0.5、0.7 mol/L濃度的NaCl洗脫得到3個(gè)蛋白峰,檢測(cè)其洗脫液的乳糖酶活性發(fā)現(xiàn)0.3 mol/L NaCl洗脫獲得的活性峰具有β-半乳糖苷酶活性。純化結(jié)果如表1所示,純化后粗酶液比酶活力由1.41 U/mg提升至124.09 U/mg,純化倍率達(dá)到88.01倍,粗酶液中大量雜蛋白被除去,酶液得到了很大程度的純化。

表1 馬克斯克魯維酵酵母GX-UN120 β-半乳糖苷酶純化結(jié)果

圖5 馬克斯克魯維酵母β-半乳糖苷酶純化曲線

2.3 β-半乳糖苷酶性質(zhì)表征

2.3.1 溫度對(duì)β-半乳糖苷酶影響

如圖6所示,從耐熱菌株GX-UN120中獲得的β-半乳糖苷酶的最適溫度為40 ℃,且在20～40 ℃該酶均表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性,30 min熱處理后活力均可維持在90%以上。因此該酶能夠適應(yīng)溫度跨度較大的工業(yè)環(huán)境,具備相應(yīng)的工業(yè)應(yīng)用潛力。

a-活性;b-熱穩(wěn)定性

2.3.2 pH對(duì)β-半乳糖苷酶影響

pH影響酶的構(gòu)象以及催化相關(guān)關(guān)鍵基團(tuán)的解離狀態(tài)來改變酶活性。如圖7所示,來自GX-UN120的β-半乳糖苷酶最適pH為6;在偏酸和偏堿的環(huán)境下酶活力均較低;特別是在pH=4時(shí)酶活力下降至41.8%,可能是由于環(huán)境中H+的增加影響活性基團(tuán)的解離。此外,該酶在中性環(huán)境下穩(wěn)定性較高,30 min內(nèi)酶活力能保持在90%以上。

a-活性;b-穩(wěn)定性

2.3.3 金屬離子對(duì)β-半乳糖苷酶影響

不同的金屬離子與酶結(jié)合或改變酶的構(gòu)象來影響酶的活力。如圖8所示,來自GX-UN120的β-半乳糖苷酶受到Cu2+、Ca2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+的抑制作用,其中Zn2+、Ca2+、Fe3+的抑制率均達(dá)90%以上。盡管Mg2+對(duì)該酶具有促進(jìn)作用,但僅提高了6.97%,因此Mg2+可能不是作為其活性中心存在,而是幫助穩(wěn)定酶蛋白的構(gòu)象而起作用。

圖8 金屬離子對(duì)β-半乳糖苷酶的活性影響

2.3.4 酶促動(dòng)力學(xué)常數(shù)

根據(jù)不同濃度底物濃度下酶促反應(yīng)的反應(yīng)速率,繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖如圖9所示。根據(jù)其線性方程y=1.508 5x+0.285 5,可計(jì)算得到該酶的Km為5.28 mmol/L,Vmax為0.29 mmol/min。再根據(jù)公式Vmax=kcat[E0]可以計(jì)算得到kcat=4.74 s-1。

圖9 不同底物濃度酶促反應(yīng)速率雙倒數(shù)圖

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)具有良好乳糖水解活力的馬克斯克魯維酵母GX-UN120進(jìn)行了發(fā)酵條件的優(yōu)化,在20 g/L半乳糖、20 g/L玉米漿干粉、40 ℃、初始pH 6.5、150 r/min的條件下使其產(chǎn)酶量最高達(dá)到26.3 U/mL。鄭義等[15]對(duì)馬克斯克魯維酵母ZX-5的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化,在碳源優(yōu)化上獲得了類似的結(jié)果;但以乳糖為碳源產(chǎn)酶量?jī)H能達(dá)到最高產(chǎn)量的一半。本研究中以乳糖為碳源的條件下,可達(dá)最高產(chǎn)酶量的89.3%,因此考慮到底物成本等因素,在工業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中乳糖或許比半乳糖更具有優(yōu)勢(shì)。同時(shí),得益于這一性質(zhì),GX-UN120或許可以利用一些富含乳糖的工業(yè)副產(chǎn)物(如乳清等)來進(jìn)行β-半乳糖苷酶的生產(chǎn),從而進(jìn)一步降低工業(yè)生產(chǎn)過程中的成本[17]。

對(duì)酶進(jìn)行純化后進(jìn)一步探究其酶學(xué)性質(zhì),其最適溫度為40 ℃,最適pH 6,Km為5.28 mmol/L、kcat為4.74 s-1、受到Mg2+的促進(jìn)作用并且受到Ca2+、Zn2+、Fe3+的完全抑制作用達(dá)90%以上。酵母來源的β-半乳糖苷酶一般最適pH偏中性,因此適用范圍廣泛,但其最適溫度會(huì)受酵母種類的影響而產(chǎn)生較大差異[18]。黃倩等[19]研究的馬克斯克魯維酵母XL-B36所產(chǎn)乳糖酶受到Mg2+、Mn2+的促進(jìn)作用,熱穩(wěn)定性與GX-UN120性質(zhì)類似但最適溫度為47 ℃。同樣的,鄭義等[15]研究的馬克斯克魯維酵母ZX-5受Mn2+的促進(jìn),但最適溫度為35 ℃。正是由于β-半乳糖苷酶性質(zhì)的多樣性,使其在不同環(huán)境中的應(yīng)用提供了選擇空間。本研究中所表征的β-半乳糖苷酶適用于中性環(huán)境,適用溫度范圍較廣,可在20～40 ℃保持穩(wěn)定,具備良好的應(yīng)用前景。