趙婉瑩,周景文,侯穎*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津,300000)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)

異戊烯基化類黃酮屬于類黃酮類物質(zhì)[1],其以類黃酮為骨架通過(guò)C—C鍵或C—O鍵與親脂性的異戊烯基側(cè)鏈相連構(gòu)成[2],而異戊烯基修飾對(duì)提高類黃酮物質(zhì)的生物活性具有重要意義[3]。8-異戊烯基山奈酚是山奈酚8-C異戊烯基化的衍生物,主要存在于豆科植物(苦參)和小檗科植物(淫羊藿)[4-5]。8-pk具有多種生物活性,如抗氧化、保護(hù)心血管[6]和降血糖[7]等。目前8-pk主要通過(guò)植物提取、化學(xué)合成和生物合成得到。相比于天然植物提取和化學(xué)合成,生物合成異戊烯基類黃酮具有反應(yīng)條件溫和、操作簡(jiǎn)單、選擇性高和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。因此開發(fā)綠色高效的生物合成8-pk體系符合當(dāng)今中國(guó)的“雙碳”政策和可持續(xù)發(fā)展理念。

異戊烯基轉(zhuǎn)移酶是黃酮類化合物異戊烯基化修飾過(guò)程中的關(guān)鍵酶,其自身具有的膜定位信號(hào)肽可將異戊烯基轉(zhuǎn)移酶定位于細(xì)胞中不同的細(xì)胞器或細(xì)胞膜等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)[8]。本研究團(tuán)隊(duì)在前期挖掘了淫羊藿來(lái)源的EkF8DT,能夠識(shí)別山奈酚(kaempferol, Kae)進(jìn)而合成8-pk,這為8-pk的高效生物合成提供了基礎(chǔ)?，F(xiàn)有的研究已在釀酒酵母中首次實(shí)現(xiàn)了8-pk的從頭合成,通過(guò)截短N(yùn)端信號(hào)肽和強(qiáng)化甲羥戊酸途徑(mevalonate pathway,MVA)等方式,可生產(chǎn)25.9 mg/L的8-pk[9]。但其存在發(fā)酵周期長(zhǎng)、生產(chǎn)效率低、生產(chǎn)成本高等問(wèn)題,難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。E.coli作為實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)常用的菌株,因其生長(zhǎng)迅速、技術(shù)操作簡(jiǎn)單和遺傳工具發(fā)展成熟的優(yōu)勢(shì)而成為良好的底盤菌株。

異戊烯基轉(zhuǎn)移酶可以從不同的供體來(lái)獲得異戊烯基,其中以二甲基丙烯基二磷酸(dimethylallyl pyrophosphate,DMAPP)為主要的供體。DMAPP可由MVA途徑和甲基赤蘚糖醇4-磷酸途徑(methylerythritol 4-phosphate pathway,MEP)合成。E.coli中DMAPP通過(guò)MEP途徑產(chǎn)生,但是該途徑代謝強(qiáng)度較弱,導(dǎo)致DMAPP供給不足,限制了產(chǎn)物的高效合成。異戊烯醇利用途徑(isopentenol utilization pathway,IUP)可以分別以3-甲基-3丁烯-1-醇或3-甲基-2丁烯-1-醇作為原料,分2步生成異戊烯基二磷酸(isopentenyl diphosphate,IPP)和DMAPP(圖1)。IUP途徑由釀酒酵母來(lái)源的膽堿激酶(choline kinase fromSaccharomycescerevisiae,ScCK)、擬南芥來(lái)源的異戊烯磷酸激酶(isopentenyl phosphate kinase fromArabidopsisthaliana,AtIPK)和異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶(isopentenyl-pyrophosphate delta isomerase,IDI)組成,ATP是其唯一輔因子。研究表明通過(guò)表達(dá)膽堿激酶(choline kinase,CK)和磷酸異戊烯基激酶(isopentenyl phosphate kinase,IPK)引入了IUP途徑使β-胡蘿卜素產(chǎn)量增加23%[10]。通過(guò)對(duì)比IUP途徑與MVA途徑發(fā)現(xiàn),IUP能夠快速獲得IPP和DMAPP,從而將IPP和DMAPP水平提高15.7倍[11]。而MVA途徑會(huì)消耗大量的能量,因此,通過(guò)引入IUP途徑來(lái)提高DMAPP的供給,是高效生物合成8-pk的關(guān)鍵。此外,將異戊烯基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行N端的截短是提高其催化性能的常見手段[12]。通過(guò)截短前40和80個(gè)氨基酸殘基使得8-異戊烯基柚皮素的產(chǎn)量提高了44.2%和119.1%[13]。

G3P:3-磷酸甘油醛;dxs:1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶;ispC:1-脫氧木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶;ispD:4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚糖醇合酶;ispE:4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚糖醇激酶;ispF:2C-甲基-D-紅細(xì)胞-2,4-環(huán)二磷酸合酶;ispG:1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶;ispH:1-羥基-2-甲基-2(E)-丁烯基-4-二磷酸還原酶;idi:焦磷酸異戊烯異構(gòu)酶;DXP:1-脫氧-D-酮糖-5-磷酸鹽;MEP:2-C-甲基-D-赤蘚糖醇4-磷酸;DPCME:4-二磷酸胞苷-2-甲基-D-赤蘚糖醇;DPCMEP:2-磷酸-4-二磷酸胞苷-2-甲基-D-赤蘚糖醇;MECDP:2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-2,4-環(huán)二磷酸;HMBDP:1-羥基-2-甲基丁烯基-4-二磷酸;AtIPK:來(lái)自擬南芥的異戊烯基激酶;ScCK:來(lái)自釀酒酵母的膽堿激酶;F8DT:異戊烯基轉(zhuǎn)移酶;IPP: 異戊烯基二磷酸;DMAPP:二甲基烯丙基二磷酸;IP:異戊烯基一磷酸;DMAP:一磷酸二甲基烯丙基。

針對(duì)上述問(wèn)題,本文在EkF8DT游離表達(dá)的基礎(chǔ)上,引入IUP途徑,以提高DMAPP的供給;然后通過(guò)在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)EkF8DT的結(jié)構(gòu),選取了8個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行截短,驗(yàn)證了其對(duì)8-pk合成的影響;最后,通過(guò)在N端融合蛋白質(zhì)標(biāo)簽以及對(duì)質(zhì)粒載體拷貝數(shù)、發(fā)酵溫度、異丙基-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-D-thiogalactoside,IPTG)濃度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)以及底物Kae的添加量?jī)?yōu)化,進(jìn)一步提高8-pk的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

EscherichiacoliJM109用于質(zhì)粒構(gòu)建與擴(kuò)增。EscherichiacoliBL21(DE3)用于蛋白的表達(dá)。基因(EkF8DT,登錄號(hào)QXN66318.1;Scck,登錄號(hào)CP046092.1;Atipk,登錄號(hào)NP_173986.2)由上海生工合成。質(zhì)粒表達(dá)載體由實(shí)驗(yàn)室保藏。文中所使用的菌株列于表1。

表1 本實(shí)驗(yàn)所使用的菌株和質(zhì)粒

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(TB+葡萄糖)(g/L):甘油5、蛋白胨12、酵母提取物24、KH2PO42.31、K2HPO416.37、葡萄糖10。

5 L發(fā)酵罐:種子液按照4%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種于含有2.5 L TB培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中。初始攪拌速度300 r/min,空氣流速2 vvm,溫度37 ℃。發(fā)酵10 h后,將補(bǔ)料培養(yǎng)基以5 mL/h的流速加入發(fā)酵罐中,共加入500 mL。用氨水調(diào)控pH為7,設(shè)置攪拌槳轉(zhuǎn)速300～600 r/min。補(bǔ)料培養(yǎng)基:500 g/L甘油。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 質(zhì)粒和菌株的構(gòu)建

所有片段均由高保真DNA聚合酶擴(kuò)增,使用上海生工即用型無(wú)縫克隆試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建。用引物對(duì)pACYC-F/pACYC-R構(gòu)建質(zhì)粒pACYCDuet的線性化載體,用引物對(duì)IDI-F/IDI-R,并以E.coli基因組為模板,擴(kuò)增idi基因片段,通過(guò)Gibson構(gòu)建質(zhì)粒pACYCDuet-F8DT-idi。其他質(zhì)粒的構(gòu)建方法同上。本試驗(yàn)所用引物見表2。

表2 本實(shí)驗(yàn)所引用的引物

1.2.2 培養(yǎng)條件

采用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)種子液。用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)8-pk。挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子于裝有5 mL LB(添加相應(yīng)抗性)的50 mL搖瓶中,220 r/min、37 ℃培養(yǎng)8～12 h。將種子液按照2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種于裝有25 mL搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中,220 r/min,37 ℃培養(yǎng),當(dāng)OD600達(dá)到0.8～1時(shí),加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG,溫度調(diào)至25 ℃,誘導(dǎo)10 h后加入終質(zhì)量濃度為250 mg/L的Kae,繼續(xù)發(fā)酵36 h。

1.2.3 樣品處理及液相分析條件

發(fā)酵結(jié)束后,取500 μL發(fā)酵液于1.5 mL離心管中并加入同體積的甲醇,劇烈振蕩混勻后,12 000 r/min離心2 min,取上清液后用0.22 μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾后使用島津LC-20AT高效液相色譜儀進(jìn)行產(chǎn)物檢測(cè)。采用Thermo Fisher C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)進(jìn)行色譜分離;柱溫箱溫度40 ℃;進(jìn)樣量10 μL;流速1.0 mL/min。流動(dòng)相分別為:A相為超純水(加入0.1%三氟乙酸),B相為乙腈(加入0.1%三氟乙酸);使用以下梯度實(shí)現(xiàn)分離:0～10 min(10%～40%B)、10～35 min(40%～80%B)、35～37 min(80%～10%B)、37～40 min(10%B)。在350 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)產(chǎn)物8-pk。

2 結(jié)果與分析

2.1 異戊烯醇利用途徑(IUP途徑)增加DMAPP的供給

將pACYCDuet-EkF8DT轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3),37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí)加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG,30 ℃、220 r/min誘導(dǎo)表達(dá)10 h后加入250 mg/L的Kae發(fā)酵60 h。然而,HPLC檢測(cè)發(fā)酵液顯示無(wú)8-pk的產(chǎn)生。推測(cè)可能的原因是異戊烯基前體供應(yīng)不足,進(jìn)行前體合成途徑強(qiáng)化的研究。如圖1所示,引入IUP途徑,表達(dá)釀酒酵母來(lái)源的Scck和擬南芥來(lái)源的Atipk,并且共表達(dá)E.coli內(nèi)源的idi以促進(jìn)IPP生成DMAPP。最終,在E.coliBL21(DE3)中表達(dá)構(gòu)建的pACYCDuet-EkF8DT-idi-Scck-Atipk質(zhì)粒,并在發(fā)酵過(guò)程中終濃度為25 mmol/L的3-甲基-3-丁烯-1-醇。以攜帶pACYC空質(zhì)粒的E.coliBL21作為對(duì)照1,以僅引入Scck和Atipk,不過(guò)表達(dá)E.coli內(nèi)源的idi,添加3-甲基-2-丁烯-1-醇作為對(duì)照2,以僅過(guò)表達(dá)E.coli內(nèi)源的idi來(lái)強(qiáng)化MEP途徑作為對(duì)照3。如圖2所示,通過(guò)上述途徑構(gòu)建策略,發(fā)酵36 h時(shí),重組菌中8-pk產(chǎn)量最高可達(dá)到2.14 mg/L,而在對(duì)照1、對(duì)照2和對(duì)照3中均未檢測(cè)到8-pk。

圖2 引入IUP途徑菌株EI02生物合成8-pk的過(guò)程

上述結(jié)果表明,E.coliBL21本身無(wú)8-pk合成能力。實(shí)驗(yàn)組能夠檢測(cè)到8-pk的原因可能是3-甲基-3-丁烯-1-醇作為底物時(shí)酶的kcat/Km要大于3-甲基-2-丁烯-1-醇[14],更好地增加了異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的前體DMAPP在體內(nèi)的合成量,進(jìn)而產(chǎn)生更多的8-pk。而僅過(guò)表達(dá)E.coli內(nèi)源的idi來(lái)強(qiáng)化MEP途徑不能夠?yàn)榇呋磻?yīng)提供較多的DMAPP,因此推測(cè)DMAPP供應(yīng)不足是8-pk合成的關(guān)鍵限制因素。

2.2 異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的截短表達(dá)

根據(jù)http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/網(wǎng)站的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,EkF8DT是具有至少7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的膜內(nèi)源性蛋白(圖3-a)。膜蛋白的大量表達(dá)可能會(huì)對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生損害,影響蛋白的可溶性表達(dá)[15],降低其催化活性甚至失活。而截短N(yùn)端信號(hào)肽可以提高酶的催化活性[12]。將EkF8DT的氨基酸序列輸入TargetP 2.0在線工具,對(duì)EkF8DT的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖3-b),峰的高度代表了信號(hào)肽的可能性。結(jié)果顯示EkF8DT的轉(zhuǎn)運(yùn)肽在第49位氨基酸。并利用在線網(wǎng)站(https://drug.ai.tencent.com/)對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示EkF8DT由10個(gè)α-螺旋的主體骨架和一個(gè)長(zhǎng)側(cè)鏈組成。長(zhǎng)側(cè)鏈的存在可能會(huì)對(duì)酶的結(jié)構(gòu)造成影響。因此構(gòu)建了8個(gè)N端氨基酸被截短的菌株,分別為截短40(EI04)、49(EI05)、56(EI06)、60(EI07)、64(EI08)、82(EI09)、96(EI10)和100(EI11)個(gè)氨基酸(圖4-a)。如圖4-b所示,菌株EI06、EI07和EI08可分別提高2、3和2.9倍的8-pk產(chǎn)量。菌株EI07的產(chǎn)量提高最明顯(6.46 mg/L)?？赡苁乔?0個(gè)氨基酸為定位信號(hào)肽,當(dāng)其被截掉時(shí),該酶無(wú)法定位到細(xì)胞膜上,同時(shí)酶的催化能力提高。菌株EI04、EI05、EI09和EI11在合成8-pk的能力上明顯下降。

a-跨膜結(jié)構(gòu)域;b-信號(hào)肽

a-EkF8DT二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及截短位點(diǎn);b-N端不同位點(diǎn)截短菌株發(fā)酵產(chǎn)量圖

2.3 蛋白質(zhì)標(biāo)簽改造異戊烯基轉(zhuǎn)移酶

添加蛋白溶解度標(biāo)簽可提高外源蛋白的可溶性表達(dá)[16]。SUMO蛋白標(biāo)簽融合到N端時(shí),SAM表達(dá)菌株的可溶性蛋白表達(dá)量顯著提高[17]。LAI等[18]發(fā)現(xiàn)融合GST的蛋白在E.coliBL21(DE3)中的表達(dá)水平顯著提高。NusA標(biāo)簽與乙醛脫氫酶融合,使得酶活性得到了提高[19]。因此我們選擇了GST、NusA和SUMO增強(qiáng)EkF8DT的可溶性表達(dá)。如圖5所示,菌株EI12的8-pk的產(chǎn)量較菌株EI07提高了2倍(12.92 mg/L)。而菌株EI17的產(chǎn)量是EI07的7.5%。結(jié)果證明SUMO標(biāo)簽增強(qiáng)了重組蛋白的表達(dá)和溶解度[20],而NusA和GST標(biāo)簽起到了負(fù)作用,這與之前的研究結(jié)果一致[21]。N端融合蛋白標(biāo)簽?zāi)軌蛱岣逧kF8DT的催化能力,提高8-pk的產(chǎn)量,同時(shí)也證明蛋白質(zhì)標(biāo)簽的使用具有較強(qiáng)的選擇性。

圖5 N端連接不同的蛋白質(zhì)標(biāo)簽對(duì)8-pk生物合成的影響

使用抗性基因的前導(dǎo)序列作為助溶標(biāo)簽?zāi)軌蛟鰪?qiáng)膜蛋白的表達(dá),如在生產(chǎn)香葉醇的研究中,將Sm抗性基因的前25個(gè)前導(dǎo)序列和KANA的前34個(gè)前導(dǎo)序列融合到香葉醇合酶的N末端,前者使得香葉醇的產(chǎn)量提高了1.3倍,后者與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異[22]。因此,將Sm和Kana的前導(dǎo)序列融合在EkF8DT的N端,測(cè)試結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株EI15和菌株EI16的8-pk產(chǎn)量為菌株EI07的97%和65%,證明該方法,無(wú)法有效提高EkF8DT的可溶性表達(dá),降低了8-pk的合成。

2.4 質(zhì)粒拷貝數(shù)對(duì)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)以及8-pk合成的影響

研究表明質(zhì)?？截悢?shù)對(duì)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)以及產(chǎn)物合成有明顯影響[23]。通過(guò)更換不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體來(lái)驗(yàn)證拷貝數(shù)對(duì)8-pk產(chǎn)量的影響。結(jié)果如圖6所示,替換為質(zhì)粒載體pCDFDuet、pETDuet和pRSFDuet后,8-pk產(chǎn)量分別為pACYCDuet為質(zhì)粒載體(EI12)的63%、62%和55%,OD600分別為原菌株(EI12)54%、200%和59%。

a-不同基因拷貝數(shù)質(zhì)粒構(gòu)建圖;b-不同拷貝數(shù)質(zhì)粒菌株發(fā)酵產(chǎn)量圖

上述研究結(jié)果表明,質(zhì)粒載體拷貝數(shù)對(duì)基因表達(dá)的影響較大,雖然中拷貝質(zhì)粒載體pETDuet能夠使菌株菌體濃度得到較好提升,但是產(chǎn)量卻大幅度下降,說(shuō)明產(chǎn)量與細(xì)胞生長(zhǎng)不呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系?？赡苁怯捎谥懈呖截愘|(zhì)粒使得EkF8DT被表達(dá)的速度過(guò)快,出現(xiàn)錯(cuò)誤的折疊方式,導(dǎo)致EkF8DT可溶性降低。而低拷貝質(zhì)粒載體pACYCDuet會(huì)降低基因復(fù)制速度,從而降低EkF8DT折疊時(shí)的錯(cuò)誤率,提高EkF8DT的可溶性表達(dá)量。同時(shí)對(duì)于異戊烯基轉(zhuǎn)移酶膜蛋白來(lái)說(shuō),中高拷貝質(zhì)粒載體使得其表達(dá)量增高,更易錨定于細(xì)胞膜上導(dǎo)致其活性降低,并影響菌株的生長(zhǎng),無(wú)法更好地行使其催化功能。

ZHANG等[24]研究發(fā)現(xiàn)Scck受質(zhì)?？截悢?shù)的影響較為顯著,高拷貝的質(zhì)粒pRSFDuet更適合該基因在大腸桿菌中的表達(dá)及應(yīng)用,因此,將IUP途徑上的3個(gè)基因idi、Scck和Atipk共同構(gòu)建到質(zhì)粒載體pRSFDuet上,將其和pACYCDuet-SUMOEkF8DT60共同轉(zhuǎn)入E.coliBL21中,得到菌株EI20,結(jié)果顯示,8-pk產(chǎn)量?jī)H3.60 mg/L。

2.5 8-pk合成過(guò)程的優(yōu)化

在發(fā)酵過(guò)程中,誘導(dǎo)溫度是影響細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)的重要因素,尤其是對(duì)膜蛋白來(lái)說(shuō),在較高溫度誘導(dǎo)表達(dá),微生物生長(zhǎng)速度較快,酶的合成速度也隨之較快,容易形成包涵體。反之,降低誘導(dǎo)溫度,有利于酶的正確折疊,但是細(xì)胞生長(zhǎng)可能受影響。對(duì)菌株EI12進(jìn)行發(fā)酵溫度優(yōu)化,在不同的誘導(dǎo)溫度下(16、20、25、30 ℃)發(fā)酵36 h,檢驗(yàn)8-pk產(chǎn)量,結(jié)果如圖7-a所示,在誘導(dǎo)溫度為25 ℃時(shí),菌株EI12發(fā)酵生產(chǎn)8-pk的產(chǎn)量最高,為21.5 mg/L,是16、20和30 ℃發(fā)酵條件下8-pk產(chǎn)量的2.82、1.55和1.6倍。說(shuō)明誘導(dǎo)EkF8DT表達(dá)的最適溫度為25 ℃。

a-誘導(dǎo)溫度;b-IPTG濃度;c-誘導(dǎo)時(shí)機(jī);d-底物濃度

T7啟動(dòng)子的表達(dá)系統(tǒng)利用IPTG誘導(dǎo)蛋白的表達(dá),但較高濃度的IPTG對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有負(fù)面影響[25]。在250 mL搖瓶中培養(yǎng)菌株EI12至OD600=0.6～0.8時(shí),分別加入終濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mmol/L的IPTG,以測(cè)試不同IPTG濃度對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)的影響。結(jié)果如圖7-b所示,當(dāng)IPTG終濃度為0.20 mmol/L時(shí),8-pk的積累量是當(dāng)IPTG終濃度為0.05、0.10、0.15、0.25 mmol/L時(shí)的5.12、2.7、1.6、1.3倍。導(dǎo)致該結(jié)果的原因可能是低濃度的IPTG會(huì)導(dǎo)致誘導(dǎo)不完全,蛋白表達(dá)量不夠高,影響了8-pk的合成。而過(guò)高濃度的IPTG會(huì)使得轉(zhuǎn)錄和翻譯進(jìn)行的較快,增加了蛋白折疊的錯(cuò)誤率,催化能力降低,從而影響8-pk的合成。

將種子液按照2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種于裝有25 mL搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中,分別在OD600為0.3、0.6、0.9、1.2和1.5時(shí)加入終濃度為0.2 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG,來(lái)驗(yàn)證不同的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)8-pk合成的影響。結(jié)果如圖7-c所示,在OD600為0.9時(shí)加誘導(dǎo)劑8-pk的產(chǎn)量最高,為21.54 mg/L,是OD600為0.3、0.6、1.2、1.5時(shí)添加IPTG的3.9、1.4、1.2、1.9倍。

類黃酮使得E.coli的形態(tài)產(chǎn)生變化,損害細(xì)胞膜[26]。為確定最佳底物濃度,在添加IPTG 10 h后分別添加50、100、150、200、250 mg/L的Kae。結(jié)果如圖7-d所示,底物最適質(zhì)量濃度為150 mg/L,8-pk產(chǎn)量進(jìn)一步提高至24.28 mg/L。

2.6 5-L發(fā)酵罐發(fā)酵8-pk水平驗(yàn)證

使用5 L發(fā)酵罐對(duì)生產(chǎn)菌株進(jìn)行驗(yàn)證,探究其合成8-pk的最大潛力。進(jìn)行流加補(bǔ)料發(fā)酵,接種5 h后開始流加補(bǔ)料,補(bǔ)料速度為5 mL/h,共補(bǔ)料500 mL。在OD600=29時(shí)添加終濃度為0.2 mmol/L的IPTG,誘導(dǎo)8 h后添加終質(zhì)量濃度為250 mg/L的Kae溶液和終濃度為25 mmol/L的3-甲基-3-丁烯-1-醇溶液。結(jié)果如圖8所示,發(fā)酵108 h后,8-pk的產(chǎn)量達(dá)到44.33 mg/L。

圖8 5 L發(fā)酵罐中EI12菌株生物合成8-pk的過(guò)程

3 討論

8-pk是一種具有高附加值的異戊烯基黃酮類化合物,其應(yīng)用價(jià)值近年來(lái)逐漸被挖掘[27]。隨著國(guó)家雙碳戰(zhàn)略的提出,綠色生物合成在8-pk合成中展現(xiàn)出極好的應(yīng)用前景。關(guān)于8-pk合成的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少,植物來(lái)源的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶至少存在7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,使其難以進(jìn)行可溶性表達(dá),以及DMAPP供應(yīng)不足,這都是限制8-pk產(chǎn)量提高的障礙。MEP途徑合成DMAPP有許多限制因素,例如G3P和丙酮酸供應(yīng)的不平衡[28]和鐵硫酶IspG和IspH對(duì)氧敏感而容易失活等問(wèn)題[29],且MEP途徑因需要輔因子的參與會(huì)與其他途徑競(jìng)爭(zhēng)資源,這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)使得該途徑提高DMAPP供應(yīng)存在很多阻礙。因此,選擇引入代謝途徑更為簡(jiǎn)短且高效的IUP途徑,可解決在E.coli中MEP途徑所生產(chǎn)的DMAPP供應(yīng)不足的問(wèn)題。針對(duì)異戊烯基轉(zhuǎn)移酶是膜蛋白具有定位信號(hào)肽的問(wèn)題,我們采取了N端氨基酸截短的方式來(lái)解決。通過(guò)在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)了信號(hào)肽位置和EkF8DT的二級(jí)結(jié)構(gòu),并根據(jù)預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)選取了8個(gè)代表性的位點(diǎn)進(jìn)行截短。發(fā)現(xiàn)不同位置的截短會(huì)對(duì)8-pk合成產(chǎn)生不同效果,相比于根據(jù)預(yù)測(cè)信號(hào)肽的位置進(jìn)行截短,根據(jù)AlphaFold2所預(yù)測(cè)的酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行截短具有更高的可信度。因此,根據(jù)酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)選擇位點(diǎn)截短并尋找規(guī)律,來(lái)細(xì)化截短的位置是最好的選擇。最后,通過(guò)融合表達(dá)蛋白質(zhì)標(biāo)簽、優(yōu)化質(zhì)?？截悢?shù)和優(yōu)化發(fā)酵條件,8-pk在5 L發(fā)酵罐的產(chǎn)量達(dá)到44.33 mg/L,本研究為細(xì)菌中8-pk的高效生物合成提供了一定的參考。鑒于異戊烯基轉(zhuǎn)移酶具有較高的底物特異性,后期研究中通過(guò)篩選不同的酶,并結(jié)合本研究的策略可以有效地提高異戊烯基化的類黃酮類化合物的合成。