李娜,徐錚*,韓子鈺,徐虹,李古月,夏洪志,牛堃

1(南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院,江蘇 南京,211816)2(南通勵(lì)成生物工程有限公司,江蘇 南通,226010)

人乳寡糖(human milk oligosaccharide, HMO)是在母乳中占比僅次于乳糖和脂類的固體物質(zhì),也是母乳區(qū)別于牛、羊奶的獨(dú)特成分。臨床和流行病學(xué)研究數(shù)據(jù)表明,喂養(yǎng)母乳可以預(yù)防感染、維持免疫穩(wěn)態(tài)和培育健康的腸道微生物菌群[1]。最新報(bào)道指出這些作用可能使HMO在新型冠狀病毒肺炎感染過程中作為受體誘餌、免疫調(diào)節(jié)劑、黏膜信號劑和益生元,對新型冠狀病毒肺炎的治療有積極效果[2]。其中,2′-巖藻糖基乳糖(2′-fucosyllactose, 2′-FL)是由乳糖和L-巖藻糖結(jié)合而成的三糖,是HMO中含量最多的組分[3]。大量研究證實(shí)2′-FL有助于提高嬰幼兒免疫力、調(diào)節(jié)腸道菌群、促進(jìn)大腦發(fā)育等作用[4-6],是新一代的母乳概念配方奶粉添加劑,有著巨大的市場潛力。2′-FL可通過化學(xué)和生物合成方法獲得,其中生物合成方法更加綠色環(huán)保,反應(yīng)副產(chǎn)物少,有利于規(guī)模化推廣應(yīng)用。

截止目前,2′-FL的生物合成分別由大腸桿菌[7-8]、釀酒酵母[9-10]、解脂耶氏酵母[11]、枯草芽胞桿菌[12]等底盤微生物實(shí)現(xiàn)。大腸桿菌作為基因工程操作成功率最高的模式生物,一直是研究的熱點(diǎn)。它主要通過從頭合成途徑和補(bǔ)救合成途徑生產(chǎn)GDP-L-巖藻糖,在外源α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下生成產(chǎn)物,如圖1所示。然而由于從頭合成途徑較長,涉及基因較多,研究具有一定難度;而通過研究補(bǔ)救途徑探索2′-FL合成的影響因素更為方便。該途徑中巖藻糖到2′-FL的摩爾轉(zhuǎn)化率是影響生產(chǎn)成本的關(guān)鍵因素,WAN等[13]通過敲除EscherichiacoliBL21(DE3)菌株的多個(gè)基因(lacZ、fucI、fucK、araA、rhaA和wcaJ),阻止底物和關(guān)鍵中間體的降解和分流;將Fkp和FutC2通過短肽對(RIAD-RIDD)在體內(nèi)形成自組裝多酶復(fù)合物,過表達(dá)gsk和gmk從而平衡代謝過程中的輔因子以及氧化還原通量,最終在補(bǔ)料分批發(fā)酵64 h后胞外2′-FL累積量達(dá)到30.5 g/L,轉(zhuǎn)化率為0.66 mol/mol巖藻糖。其次,提高底物攝入和產(chǎn)物由胞內(nèi)運(yùn)出的效率,也會(huì)對2′-FL的產(chǎn)量提升有促進(jìn)作用,而促進(jìn)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白均為膜結(jié)合,在高拷貝數(shù)質(zhì)粒上表達(dá)會(huì)對宿主造成細(xì)胞毒性。首爾大學(xué)的PARK等[14]通過對宿主本底的乳糖操縱子進(jìn)行編輯,使得乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LacY可正常工作但不對宿主產(chǎn)生影響。最后,作為反應(yīng)最終步驟的α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的選擇和可溶表達(dá)也是提高轉(zhuǎn)化率的重要手段,為了提高α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的可溶性表達(dá),CHIN等[15]在從頭合成途徑中將FucT2蛋白的N端加上3個(gè)天冬氨酸,使得2′-FL產(chǎn)量提升到了6.4 g/L。盡管有研究表明可利用低溫促進(jìn)FucT2的可溶性表達(dá),但菌體生長和產(chǎn)物合成水平也會(huì)降低[16]。融合標(biāo)簽的使用也提高了α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的可溶性表達(dá),例如three aspartate tag[15]和SUMO標(biāo)簽[11]的使用具有一定效果。

圖1 重組大腸桿菌合成2′-FL的代謝途徑

本研究以不同株系的大腸桿菌JM109(DE3)、BL21(DE3)、C41(DE3)作為底盤微生物,通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)對它們進(jìn)行基因編輯(敲除lacZ、wcaJ、lacA基因)使得底物和中間體不被分支途徑消耗,利用質(zhì)粒對Fkp酶和不同來源的α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶共表達(dá)從而搭建出補(bǔ)救途徑。通過分析不同重組菌株發(fā)酵液中2′-FL的含量,并對底物和產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行表達(dá)調(diào)控,最終通過發(fā)酵條件優(yōu)化在搖瓶中進(jìn)一步提高了2′-FL在胞外的累積,質(zhì)量濃度達(dá)到2.67 g/L,2′-FL的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.82 mol/mol巖藻糖,為2′-FL的生物合成研究提供了借鑒。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌株

本實(shí)驗(yàn)所使用菌株和質(zhì)粒見表1。

表1 質(zhì)粒和菌株信息

1.2 底盤微生物的選擇和改造

1.2.1 對底盤微生物的分析

JM109(DE3)是缺失乳糖水解能力的大腸桿菌[15],這有助于其合成2′-FL。BL21(DE3)是廣泛使用的表達(dá)宿主,研究表明經(jīng)改造的BL21(DE3)具備從頭途徑合成2′-FL的能力;C41(DE3)菌株來源于BL21(DE3),該菌株多個(gè)基因發(fā)生突變,尤其大幅降低了T7 RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄水平,在很大程度上解決了外源蛋白表達(dá)形成包涵體的難題;目前已有研究將C41(DE3)作為2′-FL從頭合成途徑的宿主[8],但補(bǔ)救途徑合成2′-FL的情況未見報(bào)道。

1.2.2 底盤微生物的改造

由于大腸桿菌本身存在多條分支代謝途徑會(huì)對合成底物和中間體產(chǎn)生消耗,嚴(yán)重影響了產(chǎn)物合成。本研究采用CRISPR-Cas9作為基因編輯工具對宿主相關(guān)基因lacZ、wcaJ、lacA進(jìn)行敲除,以BL21(DE3)菌株敲除lacZ基因?yàn)槔?所使用引物見表2。首先通過CHOPCHOP(https://chopchop.cbu.uib.no/)在線設(shè)計(jì)N20序列,合成引物lacZ-N20-F/R后加入包含T4 DNA連接酶緩沖液的反應(yīng)體系中。將PCR反應(yīng)程序設(shè)定為95 ℃解鏈5 min,梯度退火即可獲得lacZ-N20雙鏈DNA。將其稀釋后與pEcgRNA載體混合,加入BsaI酶和T4 DNA連接酶37 ℃反應(yīng)1 h。將反應(yīng)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞,即可得到攜帶lacZ靶點(diǎn)的pEcgRNA-lacZ-N20重組質(zhì)粒。以BL21(DE3)的基因組DNA為模板,分別PCR得到lacZ基因上下游的同源臂片段u-lacZ和d-lacZ,再經(jīng)重疊PCR獲得同源臂片段u/d-lacZ并純化回收;將100 ng的pEcgRNA-lacZ-N20重組質(zhì)粒和400 ng的u/d-lacZ片段混合,電轉(zhuǎn)化至含有pEcCas載體的BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,涂布LB平板(含50 mg/L卡那霉素和50 mg/L壯觀霉素)在37 ℃過夜培養(yǎng);挑取平板單菌落使用PCR鑒定敲除是否成功,電轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒消除等實(shí)驗(yàn)步驟詳見參考文獻(xiàn)[17]。

表2 本研究中使用的引物

1.3 補(bǔ)救途徑的構(gòu)建和優(yōu)化

1.3.1 2′-FL生產(chǎn)菌株的構(gòu)建

委托通用生物公司全合成脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)來源的fkp編碼基因,并克隆到了pRSF-Duet-1載體MCS1區(qū)域的NcoI-BamH I處,獲得重組質(zhì)粒pRSF-F。使用NdeI和XhoI對pRSF-F進(jìn)行雙酶切,通過試劑盒ClonExpress II One Step Cloning Kit(南京諾唯贊生物科技公司)將線性化的質(zhì)粒和α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因連接(引物見表2),通過測序驗(yàn)證是否正確并轉(zhuǎn)化至相應(yīng)感受態(tài)細(xì)胞獲得2′-FL的生產(chǎn)菌株。

1.3.2 巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的選擇

委托通用生物公司全合成野生型或按照大腸桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的幽門螺桿菌(Helicobacterpylori26695)來源的fucT2、脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)來源的wcfB、大腸桿菌O126來源的wbgL3種巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因。使用對應(yīng)引物(如表2所示)進(jìn)行PCR,所得片段經(jīng)純化后連接到使用NdeI和XhoI雙酶切的pRSF-F載體上,再轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。比較攜帶不同來源巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶菌株的生產(chǎn)能力,同時(shí)通過添加助溶標(biāo)簽SUMO來提高FucT的可溶性[11]。

1.3.3 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)優(yōu)化

LacY是一種膜結(jié)合蛋白,過量表達(dá)會(huì)帶來細(xì)胞毒性。本研究首先選用拷貝數(shù)較低的pACYCDuet-1載體進(jìn)行表達(dá),以lacY-F/R為引物從E.coliBL21(DE3)中擴(kuò)增出lacY基因,連接到pACYCDuet-1載體的多克隆位點(diǎn)MCS1處(NcoⅠ和BamHⅠ位點(diǎn)之間),得到重組質(zhì)粒pACYC-Y。為進(jìn)一步降低表達(dá)量,以pUC19質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出Lac啟動(dòng)子片段來替換pACYC-Y上MCS1位點(diǎn)原有的T7啟動(dòng)子,獲得重組質(zhì)粒pACYC(Plac)-Y。糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因tpyb由通用生物公司合成并組裝在lacY基因的終止密碼子之后,兩基因之間通過RBS序列連接得到重組質(zhì)粒pACYC(Plac)-YT。使用同樣的方法可以獲得攜帶有糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因setA的重組質(zhì)粒pACYC(Plac)-YS。所得質(zhì)粒均經(jīng)過測序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化至相應(yīng)宿主,通過細(xì)胞干重(dry cell weight, DCW)和2′-FL產(chǎn)量來比較轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的影響。

1.4 搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

將平板單菌落挑取至含有對應(yīng)抗生素的5 mL LB液體培養(yǎng)基,于37 ℃培養(yǎng)過夜。吸取1 mL菌液接種于50 mL含10 g/L甘油的LB培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)至菌體OD600值達(dá)到0.6～0.8時(shí)添加0.1 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)誘導(dǎo)重組質(zhì)粒表達(dá)。此時(shí)各加入2 g/L的L-巖藻糖和乳糖,25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h并定時(shí)取樣,通過HPLC檢測2′-FL的含量。分別考察了不同表達(dá)溫度(20、25、30、35、37 ℃),不同IPTG濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L),不同乳糖添加量(1、3、5、7、9 g/L)對發(fā)酵合成2′-FL的影響。

1.5 分析方法

生物量的測定方法:發(fā)酵液離心棄上清液,烘干稱重得到DCW數(shù)據(jù)。甘油、L-巖藻糖、乳糖、2′-FL在發(fā)酵液中的濃度通過HPLC測定,取1 mL發(fā)酵液,12 000 r/min離心1 min,將上清液用0.22 μm水系濾膜過濾后使用安捷倫HPLC系統(tǒng)和Carbohydrate Analysis(Rezex ROA-Organic Acid H+)色譜柱對樣品進(jìn)行分析,其中流動(dòng)相為0.5 mmol/L硫酸溶液,流速0.6 mL/min,柱溫60 ℃,進(jìn)樣量20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 宿主選擇及基因敲除對2′-FL合成的影響

含有β-半乳糖苷酶的大腸桿菌可將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖并用于細(xì)胞生長,而不是和GDP-L-巖藻糖結(jié)合為2′-FL。如圖2所示,含有補(bǔ)救途徑但不能水解乳糖的JM-V1菌株可合成0.53 g/L的2′-FL,而可水解乳糖的菌株BL-V1和C41-V1分別只能合成0.23、0.05 g/L的2′-FL。我們通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除了編碼β-半乳糖苷酶的基因lacZ,敲除后的B1-V1和C1-V1菌株相比敲除前產(chǎn)量提高約2倍。GDP-L-巖藻糖是大腸桿菌克拉酸合成途徑的重要中間體[18],克拉酸合成會(huì)造成GDP-L-巖藻糖的大量消耗,因此需要敲除其合成途徑的關(guān)鍵基因wcaJ。敲除后得到了菌株J1-V1、B2-V1、C2-V1,2′-FL產(chǎn)量分別為0.21、0.62、0.15 g/L。值得注意的是J1-V1的生物量和產(chǎn)量較出發(fā)菌株下降60%,即wcaJ的敲除對菌體生長產(chǎn)生顯著的負(fù)面影響,說明該基因?qū)M109(DE3)有較為重要的作用而不宜被敲除。而B2-V1與出發(fā)菌株相比產(chǎn)量提升2.67倍,DCW相較之前略微下降。C2-V1產(chǎn)量仍較低,這可能是由于該菌株對T7啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄能力較弱導(dǎo)致。在上述工作的基礎(chǔ)上我們進(jìn)一步將β-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶基因(lacA)進(jìn)行敲除并構(gòu)建出J2-V1、B3-V1、C3-V1菌株,以期能進(jìn)一步提高乳糖的利用率。由圖2可知,敲除lacA的菌株2′-FL產(chǎn)量均得到進(jìn)一步提高,其中J2-V1菌株產(chǎn)量最高達(dá)到0.86 g/L,是出發(fā)菌株的1.61倍。以上結(jié)果表明,在3株候選菌株中l(wèi)acZ和lacA基因的敲除均使得2′-FL胞外濃度提升;wcaJ的敲除對JM109(DE3)影響很大,導(dǎo)致菌株無法正常生長,但該基因?qū)L21(DE3)及C41(DE3)的生物量卻無顯著影響。

圖2 不同重組菌株的2′-FL產(chǎn)量

2.2 巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的選擇與優(yōu)化

巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶作為關(guān)鍵酶催化2′-FL合成的最后一步反應(yīng),它的表達(dá)以及活力高低對于產(chǎn)量是至關(guān)重要的。對不同來源的α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FucT2、WcfB、WbgL)編碼基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化,再與雙功能酶Fkp一起克隆到pRSFDuet-1載體上,分別轉(zhuǎn)化JM109(DE3)ΔlacA、BL21(DE3)ΔlacZΔwcaJΔlacA、C41(DE3)ΔlacZΔwcaJΔlacA等菌株。經(jīng)搖瓶發(fā)酵后測定胞外2′-FL的濃度發(fā)現(xiàn)脆弱擬桿菌來源的wcfB在3個(gè)宿主中產(chǎn)量均較低,密碼子優(yōu)化也沒有提升其生產(chǎn)性能(圖3-a)。WbgL源于致病型大腸桿菌E.coliO126,仍含有約41%的稀有密碼子,經(jīng)密碼子優(yōu)化后2′-FL在表達(dá)宿主中產(chǎn)量得到了進(jìn)一步的提升,其中J2-V3提高了5.1%,產(chǎn)量為0.84 g/L;B3-V3提升了7.7%,產(chǎn)量為0.62 g/L。來源于幽門螺桿菌的fucT2密碼子優(yōu)化前后雖未有較明顯提升,但與WcfB和WbgL相比產(chǎn)量最高,因此含有fucT的J2-V1和B3-V1是首選的2′-FL生產(chǎn)菌株。

a-不同來源巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因密碼子優(yōu)化對2′-FL合成的影響(WT:原始基因序列,OP:經(jīng)過密碼子優(yōu)化的序列);b-fucT2連接SUMO標(biāo)簽對2′-FL產(chǎn)量的影響

在本研究的后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,我們將密碼子優(yōu)化的fucT2作為選定的α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因。由于該酶在大腸桿菌中的可溶性較差,參考HOLLANDS等[11]的工作將fucT基因與SUMO標(biāo)簽融合表達(dá)。通過測定J2-V4,B3-V4,C3-V4的胞外2′-FL濃度,我們發(fā)現(xiàn)帶有標(biāo)簽的相應(yīng)菌株產(chǎn)量均獲提升,其中J2-V4產(chǎn)量為1.13 g/L(圖3-b),表明該標(biāo)簽的使用對FucT2的可溶性表達(dá)起到促進(jìn)作用。

2.3 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過表達(dá)

為進(jìn)一步提高乳糖在胞內(nèi)的利用率,過表達(dá)乳糖透過酶LacY來增強(qiáng)乳糖向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)。由于LacY是一個(gè)膜蛋白,大量表達(dá)具有細(xì)胞毒性,因此選擇了拷貝數(shù)很低的pACYCDuet-1表達(dá)載體。發(fā)酵結(jié)束后測定生物量發(fā)現(xiàn)表達(dá)LacY的菌株J2-V5、B3-V5與對照組相比均下降了2/3左右,產(chǎn)物合成也被抑制(圖4-a),而C3-V5的生物量也下降了1/2。為降低lacY表達(dá)的細(xì)胞毒性,將pACYCDuet-1上的T7強(qiáng)啟動(dòng)子替換為Lac啟動(dòng)子,得到新菌株J2-V6、B3-V6、C3-V6。經(jīng)發(fā)酵驗(yàn)證更換啟動(dòng)子后LacY的表達(dá)不僅沒有對菌體生長造成毒害,還如預(yù)期對2′-FL的合成起到了促進(jìn)作用。如圖4-b所示,J2-V6相較沒有過表達(dá)LacY的J2-V4產(chǎn)量提升了47.7%,2′-FL的胞外質(zhì)量濃度為1.67 g/L,B3-V6的2′-FL胞外質(zhì)量濃度也提升至1.47 g/L,C3-V6產(chǎn)量也有提高但遠(yuǎn)低于J2-V6和B3-V6。為促進(jìn)胞內(nèi)2′-FL分泌到胞外,過表達(dá)伯氏耶爾森菌(Yersiniabercovieri)的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Tpyb或大腸桿菌來源的的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SetA。結(jié)果如圖4-b所示,過表達(dá)Tpyb(V7菌株)或SetA(V8菌株)后胞外2′-FL濃度提高且在不同宿主內(nèi)SetA的轉(zhuǎn)運(yùn)效果均優(yōu)于Tpyb,其中濃度最高的J2-V8達(dá)到2.21 g/L,生物量未受明顯影響。

a-T7啟動(dòng)子過表達(dá)lacY對2′-FL合成的影響;b-Lac啟動(dòng)子過表達(dá)lacY、tpyb、setA對2′-FL合成的影響

2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

通過前期的菌株構(gòu)建和途徑優(yōu)化工作,我們獲得了可用于補(bǔ)救途徑生產(chǎn)2′-FL的重組菌株J2-V8。進(jìn)一步對誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度以及乳糖的添加量進(jìn)行了優(yōu)化,測定了發(fā)酵條件下2′-FL的胞外濃度。由圖5-a可知,IPTG為0.2 mmol/L時(shí),2′-FL產(chǎn)量最高,達(dá)到2.27 g/L。當(dāng)IPTG濃度超過0.6 mmol/L后產(chǎn)量反而下降,這可能是由于過表達(dá)導(dǎo)致了胞內(nèi)代謝不平衡,故0.2 mmol/L應(yīng)為最適的誘導(dǎo)劑濃度。誘導(dǎo)溫度不僅會(huì)影響蛋白表達(dá)折疊也決定了菌體的生長速度,溫度過低,宿主生長較差不利于產(chǎn)物生成,溫度過高菌體生長過快,易引起蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊而形成包涵體。如圖5-b所示,分別測定了20、25、30、35、37 ℃下菌株合成2′-FL的差異,結(jié)果表明25 ℃時(shí)最優(yōu),2′-FL胞外質(zhì)量濃度為2.3 g/L,轉(zhuǎn)化率為0.71 mol/molL-巖藻糖。

由于乳糖濃度可能對2′-FL合成產(chǎn)生影響,本研究中我們采用終質(zhì)量濃度為1、3、5、7、9 g/L的乳糖作為底物搖瓶發(fā)酵。分析圖5-c可得,當(dāng)乳糖由1 g/L提升至3 g/L時(shí),產(chǎn)量大幅提升,此時(shí)2′-FL的胞外質(zhì)量濃度達(dá)到2.67 g/L,轉(zhuǎn)化率為0.82 mol/mol巖藻糖。當(dāng)乳糖質(zhì)量濃度高于3 g/L時(shí)產(chǎn)量不再明顯提升,乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)已經(jīng)達(dá)到飽和,因此將終質(zhì)量濃度3 g/L乳糖作為最適添加濃度。利用HPLC檢測發(fā)酵液中2′-FL含量如圖5-d所示大腸桿菌通過補(bǔ)救途徑生產(chǎn)2′-FL的相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較如表3所示。

表3 補(bǔ)救途徑合成2′-FL的結(jié)果比較

3 結(jié)論

本研究構(gòu)建了利用補(bǔ)救途徑合成2′-FL的重組大腸桿菌菌株,通過篩選不同來源的α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因并經(jīng)過密碼子優(yōu)化,添加SUMO標(biāo)簽促進(jìn)了酶的可溶性表達(dá)。通過替換弱啟動(dòng)子對乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LacY和產(chǎn)物運(yùn)出蛋白Tpyb及SetA進(jìn)行了過表達(dá)試驗(yàn),獲得1株2′-FL胞外質(zhì)量濃度為2.21 g/L的重組大腸桿菌J2-V8。在搖瓶水平進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化,得到最優(yōu)發(fā)酵條件:誘導(dǎo)劑IPTG濃度為0.2 mmol/L,誘導(dǎo)溫度25 ℃,誘導(dǎo)同時(shí)加入2 g/L的L-巖藻糖和3 g/L乳糖。通過HPLC測定48 h時(shí)發(fā)酵液中2′-FL質(zhì)量濃度提高到2.67 g/L,轉(zhuǎn)化率為0.82 mol/molL-巖藻糖。L-巖藻糖作為發(fā)酵過程中成本較高的底物,通過LacY和SetA的表達(dá)增強(qiáng)了乳糖向胞內(nèi)的輸入以及2′-FL向胞外的輸出,有助于充分利用L-巖藻糖合成產(chǎn)物,可為2′-FL的生物合成深入研究提供一定借鑒。