李前程，郝 帥，李 爽，劉媛璞，李凡念，楊 起，張文靜

（老年營養(yǎng)與健康教育部重點實驗室（北京工商大學）北京市食品添加劑工程技術研究中心北京工商大學食品與健康學院 北京 100048）

近年來，腫瘤對于人類健康的威脅越來越明顯[1]，其發(fā)病率和死亡率呈階梯式上升，特別是在我國，肺癌的發(fā)病率和死亡率居高不下[2]，已經(jīng)嚴重威脅到人們的健康生存。肺癌的治療主要抑制是癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，因此靶向治療成為研究熱點[3]。藻藍色素（Phycocyanin，PC）是存在于螺旋藻中的一種捕光色素蛋白復合體，也是一類重要的食品功能因子，具有抗癌[4]、抗氧化[5]、抗炎[6]以及抗腫瘤[7]等多種生理活性的天然活性物質(zhì)，可以通過調(diào)節(jié)人體中多種酶的合成，抑制癌細胞的生長，被廣泛應用于功能性食品、化妝品和醫(yī)藥等領域中。前期研究發(fā)現(xiàn)藻藍色素具有抑制非小細胞肺癌細胞（Non-small cell lung cancer，NSCLC）生長、增殖、遷移以及侵襲等作用[8-10]，然而具體調(diào)控機制尚不明確。

microRNA（miRNA）是一類由22 bp 左右核苷酸組成的非編碼小分子RNA，對細胞的增殖、遷移和分化等生理過程起重要的調(diào)控作用[11]。狄奕成等[12]發(fā)現(xiàn)miR-195-5p 能夠促進IL-17 誘導的肺癌細胞增殖、遷移和侵襲過程。萬啟飛等[13]研究發(fā)現(xiàn)miR-142-3p 可靶向下游基因，從而抑制肺癌A549 細胞增殖。此外，有報道稱miR-642a-3p 在NSCLC 中具有重要的調(diào)控作用[14]。為進一步探究miR-642a-3p 是否參與藻藍色素抑制NSCLC 的過程，本研究以4 種典型的非小細胞肺癌細胞（A549、H1299、H460、LTEP-a2）為模型，通過干預miR-642a-3p 的表達水平，從細胞增殖、凋亡、遷移以及克隆形成等試驗探索miR-642a-3p對細胞活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細胞株 人類非小細胞肺癌H1299 細胞系、H460 細胞系、LTEP-a2 細胞系（以下簡稱“A2”）、A549 細胞系由本實驗室（北京市食品添加劑工程技術研究中心）保存。

1.1.2 試劑 胎牛血清，康源生物技術有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Quantitative realtime polymerase chain reaction，qPCR）相關試劑，廣州銳博生物技術有限公司、北京全式金生物技術有限公司；1%青霉素-鏈霉素，美國Corning公司；Entranster-R4000，英格恩生物公司；CCK-8試劑盒，碧云天生物技術有限公司；miRNA 模擬物（miR-642a-3p mimic），廣州銳博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

恒溫CO2細胞培養(yǎng)箱，Heraeus Eppendorf 公司；Spectra Max i3 多功能酶標儀，美國MD 公司；超凈工作臺，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；漩渦振蕩器，德國IKA 公司；BSA224S 型數(shù)字電子天平，德國Sartorius 公司；CFX96 Touch qPCR 檢測系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 將H460 細胞、H12999 細胞、A549 細胞、A2 細胞用含體積分數(shù)10%胎牛血清、質(zhì)量分數(shù)1%青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2的相對飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細胞貼壁生長。

1.3.2 細胞生長曲線測定 利用血球計數(shù)板計數(shù)，以5 000 個/100 μL 每孔的細胞量接入96 孔板中正常培養(yǎng)，37 ℃正常培養(yǎng)12 h 后用50 nmol/L的miR-642a-3p 模擬物培養(yǎng)液處理細胞，做4 個復孔，分別以不同的時間梯度進行培養(yǎng)后，加入100 μL 配制好的CCK-8 溶液，繼續(xù)孵育2～4 h 后用酶標儀于波長450 nm 處測各孔吸光度。連續(xù)測定5 d，記錄試驗數(shù)據(jù)，統(tǒng)計細胞生長情況。以橫坐標為時間，縱坐標為吸光度，繪制細胞生長曲線。

1.3.3 顯微鏡下觀察細胞形態(tài) 取生長狀態(tài)良好的細胞，37 ℃正常培養(yǎng)12 h 后加入終濃度為50 nmol/L 的miR-642a-3p 模擬物培養(yǎng)液分別處理細胞24，48 h，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化并拍照。

1.3.4 細胞劃痕試驗 將處于對數(shù)期的細胞接種于培養(yǎng)皿中，底部預先用記號筆畫出3 條平行線作為參考坐標，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)至幾乎100%匯合度。用吸頭快速垂直于培養(yǎng)皿底部劃出一道直線，用培養(yǎng)基輕輕沖洗除去細胞碎片，加入含有終濃度為50 nmol/L 的miR-642a-3p 模擬物培養(yǎng)液培養(yǎng)。分別于0，24 h 和48 h 時在固定的劃痕位置進行拍照，測量劃痕區(qū)的寬度（H）并計算細胞的遷移率（I），其中0 μmol/L 藻藍蛋白處理組為對照組，遷移率按式（1）計算。

1.3.5 細胞克隆試驗 取處于對數(shù)生長期的細胞按照2×102/孔密度鋪于六孔板中過夜培養(yǎng)，待細胞貼壁以后，將終濃度為50 nmol/L 的miR-642a-3p 模擬物培養(yǎng)液加入孔板中，處理細胞10～15 d，對照組不做處理。當六孔板中細胞的克隆集落肉眼可見時，用吉姆薩染色，將染色后的細胞集落拍照保存并進行數(shù)量統(tǒng)計。

1.3.6 qPCR 檢測miR-642a-3p 基因表達 取生長狀態(tài)良好的細胞接種在六孔板中培養(yǎng)24 h，加入終濃度為50 nmol/L 的miR-642a-3p 模擬物培養(yǎng)液處理48 h，用RNA 提取試劑盒提取總RNA，測定RNA 濃度。參照試劑盒說明進行cDNA 合成如表1 所示。

表1 RT 反應體系Table 1 RT reaction condition

以上體系混勻后，瞬時離心，RT 反應程序：42℃60 min，70 ℃10 min。參照試劑盒說明進行qPCR 反應，反應體系如表2 所示。

表2 miRNA PCR 反應體系Table 2 miRNA PCR reaction condition

1.3.7 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)處理軟件采用Microsoft Excel 2010，作圖軟件為Origin 8.5，每個試驗重復3 次。顯著性差異分析采用Student t-test 雙尾檢驗分析，其中P<0.05 為顯著性差異，P<0.01 為極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 藻藍色素對miR-642a-3p 表達的影響

藻藍色素處理細胞后，對4 種細胞內(nèi)miR-642a-3p 的表達水平進行了定量PCR 的檢測，結(jié)果如圖1 所示，細胞中的miR-642a-3p 均出現(xiàn)不同程度的顯著性上調(diào)，這表明藻藍色素具有調(diào)控NSCLC 中內(nèi)源性miR-642a-3p 表達水平的作用。

圖1 藻藍色素對miR-642a-3p 表達水平的影響Fig.1 Effects of phycocyanin on the expression level of miR-642a-3p

2.2 miR-642a-3p 過表達效果在細胞中的驗證

為進一步探究miR-642a-3p 表達水平的干預是否會對細胞表型造成影響，將miR-642a-3p的模擬物轉(zhuǎn)染至細胞中進行熒光定量分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miRNA 模擬物之后，miR-642a-3p 的表達顯著上調(diào)（圖2），結(jié)果表明miR-642a-3p 在4 種細胞中被成功干預。

圖2 miR-642a-3p 模擬物作用4 種細胞48 h 后miR-642a-3p 的qPCR 表達情況Fig.2 qPCR expression of miR-642a-3p in four types of cells treated with miR-642a-3p mimic for 48 hours

2.3 miR-642a-3p 過表達對細胞活性的影響

根據(jù)前期預試驗的摸索，終濃度為50 nmol/L的miR-642a-3p 模擬物即可達到預期的過表達效果，因此將細胞轉(zhuǎn)染終濃度設置在50 nmol/L。將miR-642a-3p mimic 轉(zhuǎn)染后的4 種細胞進行體外增殖能力檢測，如圖3 所示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-642a-3p mimic 后細胞的體外增殖能力出現(xiàn)顯著降低，表明miR-642a-3p 的過表達會抑制細胞生長。

圖3 miR-642a-3p 模擬物對4 種細胞增殖能力的影響Fig.3 Effects of miR-642a-3p mimics on the proliferation ability of four types of cells

細胞劃痕試驗發(fā)現(xiàn)過表達miR-642a-3p 后，對照組與過表達組的細胞遷移能力有著顯著差異，過表達組細胞的遷移率隨時間延長逐漸降低，遷移能力受到明顯抑制（圖4），表明miR-642a-3p 對NSCLC 細胞的體外遷移能力也有抑制效果。

圖4 miR-642a-3p 模擬物對4 種細胞遷移率的影響Fig.4 The effects of miR-642a-3p mimics on the migration rates of four types of cells

細胞克隆形成試驗能夠測定細胞的體外非錨定生長能力，如圖5 結(jié)果所示，過表達miR-642a-3p 后，4 種細胞的克隆集落形成數(shù)量均明顯少于對照組，表明miR-642a-3p 對NSCLC 細胞的體外非錨定生長能力具有顯著抑制效果。

圖5 miR-642a-3p 模擬物對4 種細胞克隆數(shù)的影響Fig.5 Effects of miR-642a-3p mimics on the number of colonies of four types of cells

綜上所述，過表達miR-642a-3p 會對細胞活性產(chǎn)生一定影響，細胞的增殖、遷移、克隆形成能力均受到抑制，這些結(jié)果與藻藍色素對細胞的影響趨勢一致，初步表明藻藍色素能夠通過上調(diào)miR-642a-3p 的表達而抑制NSCLC 細胞的活性。

2.4 miR-642a-3p 表達水平的抑制對細胞活性的影響

為了進一步探究miR-642a-3p 是否對細胞的增殖水平產(chǎn)生影響，將50 nmol/L 終濃度的miR-642a-3p 抑制劑在4 種細胞中進行了轉(zhuǎn)染并測定細胞生長曲線，結(jié)果如圖6 所示，除A549 細胞外，H460、H1299 和A2 細胞在轉(zhuǎn)染3～4 d 時生長速率出現(xiàn)了顯著增加，這一現(xiàn)象與過表達miR-642a-3p 的結(jié)果呈現(xiàn)相反趨勢，進一步表明miR-642a-3p 確實對NSCLC 細胞的生長具有明顯調(diào)控作用。

圖6 miR-642a-3p 抑制劑對4 種細胞生長的影響Fig.6 Effects of miR-642a-3p inhibitors on the proliferation of four types of cells

同樣地，本文對抑制miR-642a-3p 表達后的細胞遷移能力也進行了檢測，結(jié)果顯示，A549 和H1299 細胞在轉(zhuǎn)染miR-642a-3p 抑制劑后，細胞的遷移能力出現(xiàn)了顯著提高，然而H460 和A2 細胞卻依然表現(xiàn)出遷移能力降低的現(xiàn)象（圖7），推測在不同的非小細胞肺癌亞型細胞中，miR-642a-3p可能調(diào)控了不同的靶基因，因此對細胞遷移能力的影響會有差異。A549 和H1299 的結(jié)果雖與miR-642a-3p 過表達的趨勢相反，但也在一定程度上驗證了miR-642a-3p 會對NSCOC 細胞的遷移產(chǎn)生調(diào)控作用。

圖7 miR-642a-3p 抑制劑對4 種細胞遷移率的影響Fig.7 Effects of miR-642a-3p inhibitor on migration rate of four cell migration rates

對細胞的非錨定生長能力檢測顯示（圖8），抑制miR-642a-3p 的表達后，A549、H1299 和A2細胞的集落形成數(shù)量出現(xiàn)了顯著增加，而H460細胞的克隆數(shù)量雖有一定增加，但沒有顯著差異。這一結(jié)果也進一步說明miR-642a-3p 對NSCLC細胞的體外非錨定生長能力具有明顯的調(diào)控效應。

圖8 miR-642a-3p 抑制劑對4 種細胞克隆數(shù)的影響Fig.8 Effects of miR-642a-3p inhibitor on the number of colonies of four types of cells

綜上所述，采用抑制miR-642a-3p 的表達能夠在一定程度上顯著增加多種NSCLC 細胞的體外生長、遷移和非錨定生長能力，這些結(jié)果與miR-642a-3p 的過表達結(jié)果趨勢相反，是對miR-642a-3p 結(jié)果的進一步證實，也表明藻藍色素是能夠通過上調(diào)miR-642a-3p 的表達而抑制NSCLC 細胞的活性。

3 討論與結(jié)論

腫瘤是一種基因疾病，單核苷酸突變、拷貝數(shù)變異、插入/缺失等均會造成細胞內(nèi)DNA 序列的改變從而引發(fā)腫瘤，因此腫瘤發(fā)生、發(fā)展跟基因的改變息息相關。腫瘤的發(fā)生與死亡率與日俱增，嚴重威脅到人類健康，近年來，隨著醫(yī)學生物技術的改進，高通量測序成為搜尋腫瘤標志物的有力工具。通過細胞測序可以獲得大量信息，從而揭示腫瘤細胞與基因結(jié)構和基因表達狀態(tài)之間的特殊關系，成為腫瘤治療中新方向[15]。肺癌在我國癌癥中的發(fā)病率和死亡率居高不下，非小細胞肺癌占比約85%，對于已經(jīng)進入肺癌中晚期的患者來說傳統(tǒng)的手術和化療并不能有效提高生存率，因此靶向治療非小細胞肺癌細胞就成了突破口，探索NSCLC 進展的潛在機制，尋找潛在的預后生物標志物和治療靶點勢在必行[16]。

microRNA 是一種不編碼蛋白質(zhì)的微小RNA，在腫瘤細胞中起到關鍵調(diào)控功能，在具有廣泛配對互補的位點上，microRNA 可以通過與其靶向的mRNA 直接結(jié)合，催化mRNA 的裂解從而抑制蛋白質(zhì)的翻譯過程[17]。許多microRNA 通過靶向mRNA 參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，如增殖分化等，這一發(fā)現(xiàn)可能成為癌癥治療干預的研究新方向[18]。microRNA 的這一機制現(xiàn)已在胃癌[19]、甲狀腺癌[20]、肝癌[21]、肺癌[22]等多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，并證實其對腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在調(diào)控作用。

前期的研究通過轉(zhuǎn)錄組學篩選出一個潛在的調(diào)控因子miR-642a-5p，藻藍色素能夠上調(diào)miR-642a-5p 的表達從而抑制NSCLC 細胞的生長和遷移[23]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-642a-3p 同樣介導了藻藍色素的調(diào)控過程。miR-642a-5p 和miR-642a-3p是miRNA-642a 前體上2 個臂分別產(chǎn)生的2 條成熟miRNA，它們的堿基序列和細胞中的靶位點是不同的，因此具有不同的調(diào)控功能和機制。本研究的結(jié)果證實miR-642a-3p 和miR-642a-5p 都能夠參與藻藍色素抑制NSCLC 細胞活性的過程，這也是對藻藍色素調(diào)控機制的進一步補充和完善。

綜上所述，本研究首先在4 種NSCLC 細胞（A549、H460、H1299 以 及A2）中驗證了miR-642a-3p 的表達水平受到藻藍色素的調(diào)控，并通過在4 種細胞中過表達miR-642a-3p，測定細胞增殖能力、遷移以及體外非錨定生長能力，發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-642a-3p 的表達能夠顯著抑制細胞的活性，與藻藍色素的作用結(jié)果一致；相反，抑制miR-642a-3p 的表達也能在一定程度上增強細胞的活性。本研究表明藻藍色素能夠通過上調(diào)miR-642a-3p 的表達進而抑制NSCLC 細胞的活性，這為食品功能因子藻藍色素的深度研究和利用提供了重要的理論依據(jù)。