李閃閃，劉 哲，職蘭懿，田艷杰，3，劉紅芝，2，3，石愛民，2*，王 強，2，3

（1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點實驗室 北京100193 2 南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心 南京210023 3 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東青島 266109）

植物蛋白具可持續(xù)性、低成本、廣泛可用性和消費者可接受性等優(yōu)點，在食品和制藥行業(yè)受到越來越多的關(guān)注。目前植物蛋白被用來替代肉類（肉類類似物）、雞蛋（綠豆蛋白分離物）和其它乳制品（素食奶酪）。然而，一些植物源性蛋白質(zhì)由于其功能性（溶解性、乳化性、起泡性等）、消化率、生物活性較差等原因在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用有限[1]。因此，通過對植物蛋白進行改性修飾來提高其功能特性，對植物蛋白的應(yīng)用具有重要意義。

常用的蛋白改性方法主要有物理方法、化學(xué)方法和酶法改性?；瘜W(xué)方法工藝相對復(fù)雜，并存在一定的不安全性。宋旸等[2]使用微波輔助糖基化的方法改性大豆分離蛋白，雖然改性后的樣品乳化性及乳化穩(wěn)定性均得到提高，但是存在安全隱患，大部分化學(xué)改性還僅處于實驗室階段。酶法處理成本較高，較難實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。Shi 等[3]用酶法改性核桃分離蛋白的效果較好，然而酶價格昂貴，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。相比之下，采用物理改性方法進行植物蛋白修飾，既不會引入化學(xué)試劑也不需要較高的成本，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。然而，傳統(tǒng)的熱處理、高速攪拌、擠壓處理等用于修飾植物蛋白結(jié)構(gòu)的物理方法，會導(dǎo)致植物蛋白永久變性或者聚集，喪失蛋白質(zhì)的二、三級結(jié)構(gòu)和功能，損害蛋白質(zhì)的營養(yǎng)和感官特性[4]。新型物理處理技術(shù)如超高壓處理、超聲波、高壓微射流、微波、射頻、低溫等離子體、超微粉碎和脈沖電場等，被認為是“未來新興的高潛力新型物理改性方法”[5]。

本文綜述新型物理處理技術(shù)的改性機理及其對蛋白功能特性的影響，以期為提高植物蛋白資源的高效利用和經(jīng)濟價值提供理論依據(jù)。

1 新型物理改性技術(shù)機理

新型物理改性技術(shù)由于其在最小化營養(yǎng)損失、食品安全和能源效率方面的優(yōu)點，有望取代食品蛋白質(zhì)改性領(lǐng)域中較低能源效率和強烈的熱處理[5-6]。這些新型物理處理技術(shù)通過破壞蛋白質(zhì)分子之間的各種相互作用（疏水和靜電相互作用、氫鍵、二硫鍵和鹽橋）來改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)（二級、三級和四級），導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生功能性變化[4，7]。

1.1 電磁輻射處理

利用電場和電磁波對蛋白質(zhì)進行改性，蛋白質(zhì)極性基團能夠吸收能量產(chǎn)生自由基或引起蛋白質(zhì)的聚集和解聚是其主要原理。因為自由基的存在可以破壞蛋白質(zhì)分子之間的各種相互作用，如氫鍵、二硫鍵、范德華力、靜電和疏水相互作用等，所以可以不同程度地改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)[8]。

圖1 新型物理改性方法圖Fig.1 Diagram of new physical modification method

超聲波處理產(chǎn)生聲腔空化現(xiàn)象，進而使體系產(chǎn)生化學(xué)效應(yīng)、機械效應(yīng)和熱效應(yīng)[9]。這些效應(yīng)可以破壞氫鍵和疏水鍵等非共價鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開[10]，同時內(nèi)部的疏基和疏水基團出現(xiàn)在外部，二級結(jié)構(gòu)的α-螺旋轉(zhuǎn)變成β-折疊[11]，從而影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象，增加蛋白間的靜電排斥作用，有助于改善蛋白質(zhì)溶解度[12]。微波、射頻加熱技術(shù)都是通過電磁和熱的作用使蛋白結(jié)構(gòu)展開，電磁場輻射蛋白，引起蛋白中的極性分子發(fā)生極化運動、離子的振蕩遷移，進而產(chǎn)生能量并轉(zhuǎn)化成熱能，引起蛋白從內(nèi)到外同時加熱，加快了升溫速度[13]，將疏水基團暴露出來，產(chǎn)生分子間的相互作用，改變蛋白質(zhì)空間構(gòu)象，從而引起理化性質(zhì)和功能特性的改變[14]。兩者原理雖然相類似，但是射頻加熱的優(yōu)點在于設(shè)備價格低廉且穿透能力強，在蛋白質(zhì)改性應(yīng)用中擁有一定的市場潛力。

還有部分研究提出[15]脈沖電場首先使蛋白質(zhì)分子在低脈沖電場強度下極化，隨著電場強度的增加，疏水性氨基酸暴露在溶劑中。最終，未折疊的蛋白質(zhì)可以變成由弱鍵連接的聚集體，在相對較高場強下的共價鍵和非共價鍵。在一定的脈沖電場強度以上，電弧引起的熱效應(yīng)將在熱敏蛋白的變性和聚集中起主要作用[16]。紫外線照射（UVC）作為一種新興的物理技術(shù)，也可以改變蛋白質(zhì)的二、三級結(jié)構(gòu)[17]。

1.2 高壓處理技術(shù)

高壓微射流處理技術(shù)（HPM）是一種綜合了強剪切、氣穴、壓力瞬時釋放和高速撞擊等一系列作用力的新興改性技術(shù)，主要適用于流體混合物料的膨化、破碎和均質(zhì)等。此項處理技術(shù)在壓力作用下物料可以瞬時通過，壓力變化速率較大，產(chǎn)生巨大的壓力差，同時物料在通過處理腔時會受到剪切、粉碎等一系列機械力的作用。對物料分子間的結(jié)合方式也可能有影響，導(dǎo)致鍵的破壞和重組，進而對物料的理化性質(zhì)或結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，從而使食品的功能特性發(fā)生變化[18-19]。超高壓技術(shù)（UHP）是一種非熱處理技術(shù)，在超高壓處理過程中，基于液體介質(zhì)的作用，把物料體積進行壓縮，而由超高壓所形成的極高靜壓[20]，不僅對細胞形態(tài)造成影響，還會作用于物料的非共價鍵，如疏水鍵、離子鍵、氫鍵等，改變蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，引起蛋白質(zhì)變性。由于UHP 對共價鍵沒有破壞作用，所以其能夠較好地保留食品中原有的營養(yǎng)成分，也能夠更好地保留食品的質(zhì)構(gòu)和口感[21]，在食品加工領(lǐng)域方面具有良好的應(yīng)用前景。

1.3 其它新型物理處理技術(shù)

除了上述提到的改性方法，還有低溫等離子體、超溫粉碎、電離輻射、臭氧（O3）處理等新型物理改性方法。低溫等離子體可利用不同載氣系統(tǒng)，經(jīng)輝光放電、滑動電弧放電和介質(zhì)阻擋放電等不同方式放電產(chǎn)生[22]。在低溫等離子體體系中，帶電粒子可以一直擁有能量，與物料發(fā)生碰撞并蝕刻物料，能夠使大量活性基團暴露，誘導(dǎo)蛋白的結(jié)構(gòu)由致密變松散，進而修飾改善食品的功能特性[23]。低溫等離子體的優(yōu)勢在于它能夠在低溫范圍內(nèi)工作，而不會對熱敏性食品材料造成重大變化[24-25]，最大限度地減少營養(yǎng)和感官特性退化[26]。目前在食品加工領(lǐng)域中，介質(zhì)阻擋放電、輝光放電和電暈放電放電方式較為常見。

超微粉碎是指一項利用機械或流體動力克服固體本身內(nèi)部存在的聚集力使之發(fā)生破碎，從而將固體顆粒粉碎到10～25 μm 之間，甚至可達到1 μm 的處理技術(shù)[27]。超微粉碎能把物料顆粒進行微細化處理，導(dǎo)致物料產(chǎn)生較大的孔隙，同時也增加了其表面積，經(jīng)過超微粉碎的粉體具有更加良好的理化性質(zhì)，比如超微粉體具有更好的吸附性和溶解性等。電離輻射在可控條件下將食品暴露于放射性同位素（Co-60 或Cs-137）產(chǎn)生的X 射線、γ 射線和高能電子束來破壞其中可能存在的微生物，同時它可以通過產(chǎn)生羥基和超氧陰離子自由基破壞蛋白質(zhì)的一級、二級和三級結(jié)構(gòu)[28]。此外，Davies 等[28]提出，這些羥基和超氧陰離子自由基可以改變蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)并顛覆α-螺旋結(jié)構(gòu)，從而自然影響空間結(jié)構(gòu)。臭氧（O3）是一種高活性、強氧化劑，其可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的多肽氧化、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交聯(lián)、肽鍵斷裂，以及與蛋白質(zhì)反應(yīng)時氨基酸基團的修飾[29]。

2 新型物理改性處理對植物蛋白溶解性的影響

溶解性是蛋白質(zhì)的最基本的物理性質(zhì)，也是蛋白質(zhì)其它功能特性的先決條件，溶解性體現(xiàn)了蛋白質(zhì)與水分子的相互作用能力，蛋白質(zhì)水合能力越強溶解性越好[30]。影響蛋白質(zhì)溶解性的因素包括內(nèi)部因素和外部因素，如蛋白質(zhì)的非共價相互作用、蛋白質(zhì)間的疏水相互作用及鹽橋等都會影響蛋白質(zhì)溶解性[31]。此外，蛋白質(zhì)的粉體粒度和表面成分等也會影響蛋白質(zhì)的溶解性[32]，粉體粒度越小，比表面積就越大，蛋白質(zhì)越易結(jié)塊[33]，表面成分的疏水性也會影響蛋白質(zhì)的水化作用，這兩者都不利于粉末的潤濕。蛋白質(zhì)溶解性也與溶液的環(huán)境因素有關(guān)，例如溶液的pH 值、溫度和離子強度等都會影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)從而影響其溶解性[34-35]。對于溶解性高低的判斷，表征值有氮溶指數(shù)、蛋白分散指數(shù)，通過這些值來對比改性前、后的溶解性，再進一步利用傅里葉紅外光譜檢測等方法檢測對比蛋白質(zhì)的分子的結(jié)構(gòu)和化學(xué)鍵變化，來說明溶解性改變的機理。

物理改性使蛋白質(zhì)分子發(fā)生解聚和亞基伸展，更大程度地暴露蛋白質(zhì)內(nèi)部的極性基團和疏水基團，增強蛋白質(zhì)分子的表面電荷，有助于蛋白質(zhì)的水合作用，從而提高蛋白質(zhì)的溶解性[36]。通常，蛋白質(zhì)在等電點附近溶解度最低，其原因是在等電點處，蛋白質(zhì)的凈電荷為零，由于分子間靜電斥力減小，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用有利于分子聚集。當體系的pH 值偏離等電點，它們的溶解度通常會增強[37-38]。不同的蛋白質(zhì)有其獨特的溶解機制，因此需要進行深入研究，從而確定其在食品中的潛在應(yīng)用。

2.1 電磁輻射處理對蛋白溶解性的影響

電磁輻射會使蛋白質(zhì)之間發(fā)生靜電相互作用，隨著處理強度和處理時間的增加，蛋白質(zhì)的溶解性呈先增加后降低的趨勢，這是由于大量疏水基團的暴露使蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，表面疏水性降低，同時，在電場的作用下更易產(chǎn)生二硫鍵（S-S），所以處理后的蛋白質(zhì)表面疏水性高于直接水浴加熱后的蛋白質(zhì)[39]。

Yang 等[40]和田然等[41]分別研究了超聲處理球蛋白、米渣蛋白，發(fā)現(xiàn)蛋白的水溶性均有一定程度的提高。超聲處理使蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)變得松散，分子間作用力減弱、蛋白從較為有序的狀態(tài)變?yōu)闊o序的狀態(tài)，表面疏水性增加，溶解性增加。蘇巧艷[42]利用微波處理藜麥蛋白發(fā)現(xiàn)，溶解度隨著微波時間呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，可能是微波處理破壞了藜麥蛋白的次級鍵，β-折疊和α-螺旋發(fā)生改變，從而水分子更易進入球蛋白的內(nèi)部，與其分子發(fā)生水和作用。郭超凡等[43]研究了射頻對大豆分離蛋白溶解性的影響，發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白的溶解度從未處理的22.48%提高至73.47%，與微波加熱原理類似，射頻處理導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)的二硫鍵、氫鍵以及靜電相互作用作用被打破，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，蛋白分子與水的相互作用增強，導(dǎo)致溶解度提高。然而，Ling 等[44]表示，射頻誘導(dǎo)加熱對溶解度有負面影響，他們認為由于三級結(jié)構(gòu)的改變，表面疏水性的改善和色氨酸熒光的下降可以證明他們的結(jié)論。Li[45]指出脈沖電場對食物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，脈沖電場可以提高大豆分離蛋白中β-折疊的比例，這種現(xiàn)象最終歸因于β-折疊片層結(jié)構(gòu)之間出現(xiàn)氫鍵而導(dǎo)致的蛋白質(zhì)聚集。通過二硫鍵振動峰強度和酪氨酸振動頻率的變化，還可以觀察到巰基和疏水性的顯著變化。

2.2 高壓處理蛋白溶解性的影響

有關(guān)學(xué)者研究表明，高壓處理會改變蛋白質(zhì)的溶解性，這是因為高壓處理會破壞蛋白質(zhì)之間的氫鍵、疏水相互作用等非共價鍵，使其分子結(jié)構(gòu)進一步折疊或展開[46]。高壓微射流處理破壞分子間的強氫鍵，導(dǎo)致結(jié)晶度下降，并使結(jié)構(gòu)從松散的團簇變?yōu)樗缮⒌木奂w和不規(guī)則的鏈，從而使其更容易溶于水[47]。敬思群等[48]研究發(fā)現(xiàn)動態(tài)高壓微射流處理大豆分離蛋白，可以使溶解度從20%提升至80%，徐雨佳[49]同樣采用高壓微射流處理大米谷蛋白，在中性條件下，80 MPa 處理的蛋白溶解性最高，比原大米谷蛋白的溶解度增長76.46%。蘇茜[50]研究發(fā)現(xiàn)，超高壓處理技術(shù)可以使小米蛋白的溶解度提升100%，林素麗[51]同樣采取超高壓處理技術(shù)處理米糠蛋白使溶解性從22%提升至55%，可能是經(jīng)過超高壓處理后，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，從而進行更好的水合作用。同時，蛋白的溶解度與表面疏水性的降低和二級結(jié)構(gòu)的變化有關(guān)[52]。

2.3 其它新型物理改性對蛋白溶解性的影響

低溫等離子體處理會釋放更多的自由基和活性基團，從而增加了蛋白質(zhì)聚集體之間的相互作用[53]。Mahdavian Mehr 等[54]分析了等離子體處理對草豆分離蛋白溶解性的影響，蛋白質(zhì)溶解度的增加，可能與蛋白質(zhì)表面電荷的增加和蛋白質(zhì)粒徑的減小有關(guān)；Ji 等[55]研究發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過低溫等離子體處理后，豌豆分離蛋白的溶解度增加了12.17%，可能是由于等離子體處理后蛋白質(zhì)中的結(jié)合更松散，表面更粗糙，導(dǎo)致了豌豆分離蛋白的比表面積和表面活性位點的增加；超微粉碎主要通過改變蛋白質(zhì)的粒徑大小，從而影響其溶解性的變化，吳長玲等[56]研究低溫超微粉碎對豆渣蛋白的溶解性的影響發(fā)現(xiàn)，溶解度從23.6%提升至27.5%。Liu 等[57]在球磨處理大豆分離蛋白中的研究發(fā)現(xiàn)，球磨增加了溶解性和水分分散性，構(gòu)象結(jié)構(gòu)和顆粒大小的變化可能會影響蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)。

表1 不同改性方法對蛋白溶解性的影響Table 1 Influence of different modification methods on protein solubility

雖然大部分改性方法可以使植物蛋白的溶解性得到一定程度的提升，但是同一物理改性提升的效果針對不同的植物蛋白效果也不同。比如：鄧愛華等[58]超聲處理葵花籽蛋白，溶解度增加了57.9%，而鄭麗慧等[59]同樣采取超聲處理米糠蛋白，其溶解度只增加了11.79%。此外郭超凡等[43]研究了射頻對大豆分離蛋白溶解性的影響，發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白的溶解度提高了200%，而Ling 等[44]表示，射頻誘導(dǎo)加熱對米糠蛋白溶解度會產(chǎn)生負面影響。

3 新型物理改性對植物蛋白其它功能特性的影響

3.1 乳化性和乳化穩(wěn)定性

乳化性是指油相和水相混合形成乳狀液的能力。蛋白質(zhì)的一部分與界面接觸后，疏水性氨基酸殘基伸向油相部分，同時在界面吸附，可以使液滴產(chǎn)生不易聚集的流變學(xué)性質(zhì)，從而達到乳化的作用。葛艷爭等[60]采用超聲處理花生分離蛋白發(fā)現(xiàn)，花生分離蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性隨超聲時間均呈先增加后降低的趨勢，可能原因是超聲暴露了更多的疏水性基團，從而導(dǎo)致了蛋白質(zhì)與油的相互作用增強，而超聲時間過長，蛋白質(zhì)的重聚現(xiàn)象嚴重而不利于疏水基團的暴露，導(dǎo)致乳化性及乳化穩(wěn)定性有所降低。蘇巧艷[42]采用微波分別處理藜麥蛋白，乳化性及其乳化穩(wěn)定性也得到了提高?？赡苁堑鞍捉Y(jié)構(gòu)展開使更多疏水性基團暴露出來，更易與油脂結(jié)合，而極性部分與水相結(jié)合，從而使其乳化性及乳化穩(wěn)定性提高。

3.2 起泡性和起泡穩(wěn)定性

蛋白質(zhì)分子具有兩親性，在攪打的過程中，蛋白質(zhì)的親水基團、疏水基團分別向液相、氣相部分移動。由于疏水基團吸附在氣液界面上，降低了表面張力，此外由于在界面處蛋白存在非共價相互作用，會形成一層具有張力的薄膜，有利于泡沫的形成和穩(wěn)定[61]。郭超凡等[43]研究發(fā)現(xiàn)射頻加熱可以提高大豆分離蛋白起泡能力；戴彩霞等[62]采用超高壓技術(shù)處理菜籽蛋白，其起泡性和起泡穩(wěn)定性均得到了提高，分析原因可能是經(jīng)超高壓的蛋白質(zhì)分子鏈展開，促使疏水基團充分暴露，鏈的柔性增加，改善起泡性，其在空氣-水界面展開形成致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，提高蛋白質(zhì)和空氣結(jié)合的能力，從而提高其泡沫穩(wěn)定性。

3.3 吸水性與吸油性

蛋白質(zhì)的吸水性與蛋白質(zhì)-水相互作用位點中極性氨基酸的位置有關(guān)，吸油性與蛋白質(zhì)-油相相互作用位點中非極性氨基酸的位置有關(guān)[37]，吸水性和吸油性有助于減少水分流失，從而提供食品所需要的質(zhì)地并起到改善口感的作用。Hassan等[63]證明，即使在60 ℃的較低溫度下加熱，射頻處理也能提高玉米蛋白的吸油、吸水能力，可能是非共價鍵斷裂導(dǎo)致的蛋白質(zhì)部分折疊。He 等[64]研究發(fā)現(xiàn)超高壓處理可以顯著提高花生分離蛋白的吸油性。

3.4 凝膠特性

蛋白質(zhì)分子聚集并形成有序的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的過程稱為凝膠作用。物理處理凝膠類蛋白質(zhì)會使其分子發(fā)生變性而解析折疊和聚集，進而形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。Qin 等[65]報道稱微波可以使TG 酶誘導(dǎo)的大豆蛋白/小麥面筋蛋白凝膠的凝膠強度顯著提高，而且凝膠具有更致密、更均勻的顯微結(jié)構(gòu)。Boreddy 等[66]使用射頻輔助熱風(fēng)處理蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其處理能夠在更短的時間內(nèi)增強蛋白質(zhì)的凝膠特性。Zhang 等[67]報道稱用低溫等離子體處理的花生蛋白可以形成具有更大持水能力和機械性能的凝膠，這種凝膠化過程的增強可能歸因于表面疏水性和自由巰基的增加。

植物蛋白的功能性質(zhì)與其理化性質(zhì)（分子外觀、氨基酸的順序及組成、電荷分布以及分子內(nèi)與分子間的相互作用、疏水相互作用等）密切相關(guān)，同時，還受多種因素的影響，如植物蛋白的凝膠性還與溫度、pH 值、離子強度等因素有關(guān)。不同的改性方法對植物蛋白的各種功能特性有不同程度的改善，在食品領(lǐng)域加工過程中，針對所需要改善的植物蛋白功能特性，可以選擇合適的物理改性方法。

4 結(jié)語與展望

作為新興和有前途的技術(shù)，高壓微射流、超微粉碎、低溫等離子體等新型物理改性技術(shù)在改變蛋白質(zhì)產(chǎn)品的物理和化學(xué)功能方面顯示了它們的優(yōu)點，成為揭示食品蛋白質(zhì)改性領(lǐng)域的一種有效的輔助手段，有望在未來食品的加工和生產(chǎn)中發(fā)揮重要的作用。想要制造滿足消費者精準需求的未來食品，可采用擠壓剪切、3D 打印、納米組裝[68]等工程化食品加工技術(shù)，結(jié)合大數(shù)據(jù)和個性化設(shè)計。此外，以蛋白質(zhì)為原料的3D 打印技術(shù)在食品領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用，通過物理手段處理后的植物蛋白性質(zhì)發(fā)生改變，從而有助于改善打印材料的流變性質(zhì)的效果。

為了促進物理加工在植物蛋白中的應(yīng)用，還有存在一些問題亟需解決。首先，最突出的挑戰(zhàn)是了解物理改性處理后的蛋白質(zhì)中實際發(fā)生的變化，為未來開發(fā)新產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)；其次，需要了解改性蛋白質(zhì)食品與其感官特征之間可能存在的相關(guān)性，從而預(yù)測消費者的可接受性；同時需要加強相關(guān)的優(yōu)化研究，以便以可控的方式將植物蛋白修飾到所需的程度。此外，目前這些技術(shù)目前僅在中試或?qū)嶒炇乙?guī)模上使用，迫切需要工業(yè)化應(yīng)用相關(guān)的研究。對上述存在的問題，未來需要進行大量的研究了解新型改性技術(shù)及其對植物蛋白結(jié)構(gòu)的影響。