潘毅,陳軍喜,夏至輝,閆智杰（南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院,江西 南昌 330002）

膿毒癥（Pyohemia）是一種由全身感染引起的危及生命的疾病，其伴隨著嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)以及免疫反應(yīng)失調(diào)等特征，導(dǎo)致器官功能衰竭[1]。肝臟是調(diào)節(jié)宿主代謝以及免疫防御的主要器官，而肝衰竭和功能障礙是膿毒癥的并發(fā)癥之一，也是死亡率較高的原因之一[2]。低分子肝素（Low Molecular Weight Heparin，LMWH）是臨床抗凝的常用藥物，在臨床防治膿毒癥肝損傷上取得了良好的療效。唐勇[3]等人采用Meta分析研究探索了低分子肝素對(duì)中國人群膿毒癥療效，結(jié)果顯示LMWH治療膿毒癥可以降低病死率和APACHEⅡ評(píng)分。本課題組既往采用經(jīng)典的大鼠盲腸結(jié)扎穿孔膿毒癥模型證實(shí)LMWH能顯著降低膿毒癥大鼠肝的損害、抑制炎癥因子的釋放[4]。本研究擬進(jìn)一步采用LPS誘導(dǎo)體外培養(yǎng)肝細(xì)胞損傷及炎癥模型，探索LMWH防治膿毒癥肝損傷的機(jī)制，為LMWH治療膿毒癥肝損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 LMWH購自河北常山生化藥業(yè)有限公司（批號(hào)：F402160906）；谷胱甘肽（GSH）購自碧云天生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)：S0073）；TUNEL染色試劑盒購自美國羅氏生物（貨號(hào)：11684795910）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）Elisa試劑盒購自武漢博士德生物工程公司（貨號(hào)：EK0525、EK0410）；LPS購自美國Sigma公司（貨號(hào)：L2630）；MTS檢測試劑盒購自美國Promega公司（貨號(hào)：G3582）；乳酸脫氫酶（LDH）細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自碧云天生物（貨號(hào)：C0016）；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibco公司（貨號(hào)：10099133、11965092）；兔抗NF-κBp65、p-NF-κBp65、GAPDH抗體購自美國CST公司（貨號(hào)：8242、3033、5147）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 Lo2人正常肝細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將Lo2細(xì)胞分為以下幾組：對(duì)照組：給予等體積的溶劑；LPS組：加入20ng/mlLPS；LMWH低、中、高劑量組：分別給予100U/L、200U/L、400U/L的LMWH；GSH組給予20μMGSH處理24h。

1.3 MTS細(xì)胞活力檢測 按照4×103/孔，將Lo2細(xì)胞接種于96孔板，按實(shí)驗(yàn)分組給予不同的處理。24h后，棄去培養(yǎng)液，加入新鮮的DMEM培養(yǎng)基（100μl）和MTS檢測液（10μl）孵育2h后，用酶標(biāo)儀（美國伯騰公司，Epoch）檢測波長490nm處吸光度（OD值）。細(xì)胞活力=（干預(yù)組OD-空白孔OD）/（對(duì)照組OD-空白孔OD）×100%。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，取其平均值。

1.4 TUNEL染色 TUNEL染色按試劑盒說明書進(jìn)行操作。TUNEL用于標(biāo)記凋亡細(xì)胞，陽性凋亡細(xì)胞呈綠色，DAPI用于標(biāo)記細(xì)胞核，呈藍(lán)色。每孔隨機(jī)觀察5個(gè)200倍視野，分別計(jì)數(shù)細(xì)胞核總數(shù)（標(biāo)記藍(lán)色熒光）和凋亡細(xì)胞數(shù)（標(biāo)記綠色熒光）計(jì)算凋亡指數(shù)（Apoptosis Index%）。Apoptosis Index（%）=凋亡陽性細(xì)胞核數(shù)÷總計(jì)數(shù)的細(xì)胞核×100%。

1.5 Elisa檢測 將Lo2細(xì)胞接種于24孔板，按實(shí)驗(yàn)分組給予不同的處理，每組6個(gè)副孔。24h后，收集細(xì)胞上清，根據(jù)Elisa試劑盒說明書檢測TNF-α、IL-6含量。

1.6 Western blot檢測 不同刺激處理Lo2細(xì)胞24小時(shí)后，PBS洗1次，加入適量的RIPA裂解液（碧云天生物）裂解，提取總蛋白用BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物）定量，樣品加入緩沖液，100℃、5min變性，總蛋白上樣量為10μg，用10%的SDS-PAGE電泳在蛋白電泳儀（美國Bio-Rad公司，Mini-PROTEANTetra）分離，半干電轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉37℃封閉1h后，分別用相應(yīng)的1抗（1∶1000）在4℃過夜，TBST洗膜3次后用2抗（CST公司，1∶5000稀釋）在室溫孵1h，TBST洗膜3次后用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白條帶，用GAPDH蛋白條帶作為內(nèi)參，計(jì)算目的條帶和內(nèi)參條帶的灰度值之比。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（MeanSD）表示，One-way ANOVA方差分析用于多重比較，方差齊性采用LSD進(jìn)行兩兩比較，方差不齊性的采用Dunnetts T3進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LMWH對(duì)LPS誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的影響MTS結(jié)果如圖1A所示，LPS處理Lo2細(xì)胞24h后，Lo2細(xì)胞的細(xì)胞活力顯著降低，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。LMWH與LPS共同處理Lo2細(xì)胞24h后，LMWH能劑量依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低（P均＜0.05）。LDH檢測結(jié)果如圖1B所示，LPS處理Lo2細(xì)胞24h后，Lo2細(xì)胞LDH釋放顯著升高，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），LMWH與LPS共同處理Lo2細(xì)胞24h后，LMWH能劑量依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)的LDH釋放增加（P均＜0.05）。GSH能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞活力降低和LDH釋放顯著升高，與LPS組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。GSH組的細(xì)胞活力、LDH含量與LMWH高劑量組比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 LMWH對(duì)LPS誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL染色結(jié)果如圖2所示，LPS處理Lo2細(xì)胞24h后，Lo2細(xì)胞的凋亡指數(shù)顯著升高，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。LMWH與LPS共同處理Lo2細(xì)胞24h后，LMWH能劑量依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)的凋亡指數(shù)升高，與LPS組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。GSH能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，與LPS組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。GSH組的凋亡率與LMWH高劑量組比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 LMWH對(duì)LPS誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的影響。注：A：TUNEL凋亡染色圖像；B：凋亡指數(shù)（n=3）。與LPS組比較，*P＜0.05；與GSH組比較，#P＜0.05

2.3 LMWH對(duì)LPS誘導(dǎo)肝細(xì)胞炎癥的影響 TNF-α、IL-6結(jié)果如圖3所示，LPS處理Lo2細(xì)胞24h后，Lo2細(xì)胞的TNF-α、IL-6的含量顯著升高，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。LMWH與LPS共同處理Lo2細(xì)胞24h后，LMWH能劑量依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6含量升高，與LPS組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。GSH能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6升高，與LPS組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。GSH組的TNF-α、IL-6含量與LMWH高劑量組比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 LMWH對(duì)LPS誘導(dǎo)肝細(xì)胞炎癥的影響。注：A：TNF-α含量（n=6）；B：lL-6含量（n=6）。與LPS組比較，*P＜0.05；與GSH組比較，#P＜0.05

2.4 LMWH對(duì)LPS誘導(dǎo)NF-κB激活的影響 Western blot結(jié)果如圖4所示，LPS處理Lo2細(xì)胞24h后，Lo2細(xì)胞中p-p65的含量顯著升高，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。LMWH與LPS共同處理Lo2細(xì)胞24h后，LMWH能劑量依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)的p-p65含量升高，與LPS組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。GSH能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB激活，與LPS組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。GSH組的p-P65含量與LMWH高、中劑量組比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，膿毒癥導(dǎo)致肝功能障礙甚至肝功能衰竭[5]。LPS是膿毒癥引起肝損傷的重要機(jī)制，膿毒癥早期，腸黏膜通透性增高，腸道細(xì)菌或LPS通過門靜脈移位至肝臟，引起肝細(xì)胞的凋亡和炎癥[6]。目前，恢復(fù)肝功能已經(jīng)成為降低膿毒癥死亡率的重要途徑[7-8]。LMWH由普通肝素經(jīng)化學(xué)或酶學(xué)方法解聚而成，相對(duì)分子質(zhì)量為45000D，是一種臨床上常用的抗凝藥物。目前已證實(shí)，LMWH能夠抑制膿毒癥患者炎性介質(zhì)和氧自由基的釋放，抑制細(xì)胞黏附和激活、補(bǔ)體系統(tǒng)的激活，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的連續(xù)性和完整性，從而改善膿毒癥患者微循環(huán)功能[9]。本研究針對(duì)LMWH對(duì)LPS誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制進(jìn)行探索。

本研究采用20ng/ml的LPS刺激肝細(xì)胞，制備LPS誘導(dǎo)Lo2肝細(xì)胞損傷模型，結(jié)果顯示LPS顯著降低肝細(xì)胞的細(xì)胞活性、增加LDH釋放，這提示LPS誘導(dǎo)了肝細(xì)胞的損傷，表明了膿毒癥大鼠模型建立成功，與既往的研究[10]結(jié)果一致。本研究在該模型上探索LMWH對(duì)LPS誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的影響，發(fā)現(xiàn)LMWH能劑量依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷，提示LMWH具有肝細(xì)胞保護(hù)作用。凋亡是細(xì)胞死亡的重要方式之一，研究證實(shí)LPS可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡[11]。本研究進(jìn)一步探索了LMWH對(duì)LPS誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示LMWH能劑量依賴性地抑制LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。該研究提示LMWH可能通過抑制細(xì)胞凋亡發(fā)揮肝細(xì)胞保護(hù)作用。既往研究發(fā)現(xiàn)肝素對(duì)體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用[12]。筆者既往的研究在動(dòng)物層面上證實(shí)了LMWH能防治膿毒癥肝臟引起的肝損害，而本研究第一次在細(xì)胞層面上證實(shí)了LMWH具有肝細(xì)胞保護(hù)作用。

炎癥因子的釋放在膿毒癥肝損傷中起重要作用。LPS可誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-6等，這些炎癥因子進(jìn)一步通過炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)生成大量氧自由基和過氧化反應(yīng)產(chǎn)物，引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，破壞肝細(xì)胞膜及線粒體膜完整性，引起肝細(xì)胞凋亡[13-14]。因此，本研究進(jìn)一步探索了LMWH對(duì)LPS誘導(dǎo)肝細(xì)胞釋放炎癥因子的影響。結(jié)果顯示，LMWH能劑量依賴性地抑制炎癥因子TNF-α、IL-6的釋放，這提示LMWH可能通過LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)抑制肝細(xì)胞的凋亡。

NF-κB是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，幾乎所有類型細(xì)胞都存在NF-κB[15]。NF-κB能被多種細(xì)胞刺激所激活，包括LPS、氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子、紫外線照射等。既往研究證實(shí)LPS能通過激活NF-κB誘導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡[16]。NF-κB p65是NF-κB轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的重要組成部分之一，NF-κB p65的Ser536位點(diǎn)被磷酸化是NF-κB被激活的標(biāo)志[17-18]。為了觀察LMWH對(duì)LPS誘導(dǎo)NF-κB激活的影響，筆者檢測了Lo2細(xì)胞中NF-κB p65的磷酸化水平。結(jié)果顯示LMWH能劑量依賴性地抑制p65的磷酸化，這提示LMWH可能通過抑制NF-κB抑制LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究顯示，LMWH能夠改善LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡，一定程度上可緩解LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥水平。同時(shí)，LMWH能夠抑制LPS誘導(dǎo)NF-κB的激活，提示LMWH可能通過抑制NF-κB發(fā)揮其肝細(xì)胞保護(hù)作用。