孫 煒,王俊文,李 然,黃逸民,張 卓,雷 霆（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北 武漢 430030）

垂體腺瘤（pituitary adenoma，PA）起源于垂體前葉，是第三大常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，是蝶鞍最常見(jiàn)的病變，占所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的10%[1-2]。大多數(shù)PA 為散發(fā)，且65%以上為功能性PA 或激素分泌型PA，即使沒(méi)有發(fā)生轉(zhuǎn)移，也會(huì)導(dǎo)致激素分泌過(guò)多或分泌不足、視覺(jué)缺陷以及其他殘疾等[3]。功能性生長(zhǎng)激素垂體腺瘤（functional growth hormone-secreting pituitary adenoma，fGH-PA）是PA 最重要的一種形式，其分泌生長(zhǎng)激素和生長(zhǎng)激素釋放激素，引起生長(zhǎng)激素細(xì)胞增生和生長(zhǎng)激素過(guò)量釋放[4]。成年人生長(zhǎng)激素過(guò)量會(huì)導(dǎo)致肢端肥大癥；年輕人若在骨骺尚未閉合時(shí)開(kāi)始發(fā)病，會(huì)導(dǎo)致身材高大或巨人癥。

細(xì)胞周期檢查點(diǎn)失調(diào)、細(xì)胞發(fā)生持續(xù)增殖是PA生長(zhǎng)的主要驅(qū)動(dòng)因素，高達(dá)80%的PA 存在G1/S 期檢查點(diǎn)失調(diào)[5]。cAMP 直接激活的交換蛋白1（exchange protein 1 directly activated by cAMP，Epac1）是一種新發(fā)現(xiàn)的cAMP 效應(yīng)器蛋白，在癌癥中具有雙重功能，可促進(jìn)或抑制癌癥的形成和進(jìn)展[6]。cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element-binding protein，CREB）是一種具有cAMP 響應(yīng)元件的轉(zhuǎn)錄因子，可通過(guò)下游多種通路改變細(xì)胞周期進(jìn)程。本研究通過(guò)測(cè)定PA 組織臨床樣本中Epac1 的表達(dá)水平和體外實(shí)驗(yàn)，探討Epac1通過(guò)磷酸化CREB引起細(xì)胞周期檢查點(diǎn)失調(diào)、促進(jìn)PA細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

大鼠視網(wǎng)膜永生化細(xì)胞系RGC-5 細(xì)胞、大鼠泌乳素瘤細(xì)胞系MMQ 細(xì)胞、大鼠垂體瘤細(xì)胞系GH3 細(xì)胞、Ham's F-12K 培養(yǎng)液購(gòu)自武漢普諾賽生物科技有限公司。TRIzol 裂解緩沖液（批號(hào)：2792739）、RIPA 裂解和提取緩沖液（批號(hào)：YJ378720）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS；批號(hào)：2831969RP）、DMEM 培養(yǎng)液（批號(hào)：2797239）、Lipofectamine 3000 脂質(zhì)體（批號(hào)：2754186）購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司。馬血清購(gòu)自上海酶研生物科技有限公司。FastKing RT Kit（批號(hào)：116502396）、SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) Kit（批號(hào)：205709634）購(gòu)自天根生化科技有限公司。一抗（兔抗人單抗）：Epac1（批號(hào)：107789164）、p-CREB（批號(hào)：109645324）、CREB（批號(hào)：315769455）、Cyclin D1（批號(hào)：164389790）、CDK2（批號(hào)：324758912）、p21（批號(hào)：521467936）、β-actin（批號(hào)264683965）購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司。山羊抗兔IgG(H+L)HRP 二抗（批號(hào)：LK7046567915）購(gòu)自杭州聯(lián)科生物科技有限公司。細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（PI/RNase A Staining；批號(hào)：DJD45762318）購(gòu)自日本Dojindo生物公司。

正置光學(xué)顯微鏡（型號(hào)：ECLIPSE Ti2）購(gòu)自日本Nikon 株式會(huì)社，流式細(xì)胞儀（型號(hào)：CytoFLEX SRT）購(gòu)自貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)(中國(guó))有限公司，酶標(biāo)儀（型號(hào)：Sunrise）購(gòu)自帝肯（上海）實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

1.2 臨床樣本收集

收集2019 年8 月至2021 年7 月我院12 例肢端肥大癥患者的fGH-PA 組織。其中男7 例，女5 例；年齡26～56 歲，中位年齡39 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡在18 歲及以上；基于臨床特征和生化證據(jù)確診為肢端肥大癥；磁共振成像顯示蝶鞍內(nèi)有垂體瘤；經(jīng)2 h 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)后未抑制的生長(zhǎng)激素低于0.4 μg/L；胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（insulin like growth factor-1,IGF-1）水平超過(guò)正常上限的1.3 倍；距離最近一次垂體手術(shù)已有3 個(gè)月以上。

1.3 qPCR

使用TRIzol裂解緩沖液在液氮中研磨并裂解組織或細(xì)胞，提取組織及細(xì)胞總RNA。使用FastKing RT Kit 試劑盒合成cDNA。使用SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）Kit 進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增。引物序列（5'-3'）：Epac1 正向GCTGGCTCCTTCGTCTGAG，Epac1 反向G CTGGCTCCTTCGTCTGAG；GAPDH 正向ATGGGCAG CCGTTAGGAAAG，GAPDH 反向AGGAAAAGCATCA CCCGGAG。

1.4 免疫組織化學(xué)

手術(shù)獲得fGH-PA 樣本后，立即浸沒(méi)于10%中性福爾馬林緩沖液中，4 ℃下固定超過(guò)48 h 后進(jìn)行石蠟包埋和切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化后，常規(guī)使用微波爐進(jìn)行抗原修復(fù)。向切片滴加3%的雙氧水，于室溫避光封閉30 min；向切片滴加封閉緩沖液，于室溫封閉1 h；向切片滴加Epac1 一抗工作液，于4 ℃孵育過(guò)夜；次日向切片滴加二抗山羊抗兔IgG（H+L）HRP 工作液，于室溫孵育1 h。向切片滴加生物素底物，于室溫孵育30 min；向切片滴加1×DAB 顯色液，避光顯色5～10 min，于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

RGC-5 細(xì)胞培養(yǎng)于含10.0% FBS 和100 UI/mL 青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中；MMQ 細(xì)胞和GH3 細(xì)胞培養(yǎng)于含2.5% FBS、15.0%馬血清和100 UI/mL 青霉素-鏈霉素的Ham's F-12K 培養(yǎng)液中，置于37 ℃恒溫濕潤(rùn)的CO2孵育箱中維持培養(yǎng)。

1.6 Western blot

使用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解和提取緩沖液，在液氮中研磨并裂解組織或細(xì)胞，提取總蛋白。采用含10.0%脫脂奶粉的TBS-T緩沖液封閉PVDF 膜。向膜上滴加一抗工作液并于4 ℃孵育過(guò)夜。次日，向膜上滴加二抗工作液并于室溫孵育1 h。使用ECL 超敏化學(xué)發(fā)光底物對(duì)目的條帶進(jìn)行顯影。使用Image J v 1.8.0對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。

1.7 轉(zhuǎn)染

使用GH3細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，過(guò)表達(dá)或敲低Epac1，或敲低CREB。使用Lipofectamine 3000 脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染結(jié)束48 h 后，檢測(cè)下游指標(biāo)。對(duì)于過(guò)表達(dá)Epac1實(shí)驗(yàn)，分別向細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒（Vector組）或pcDNA3.1-Epac1 質(zhì)粒（Epac1-OE 組），未做任何轉(zhuǎn)染處理的細(xì)胞為Control組。為了擴(kuò)增Epac1開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）完整序列，使用引物對(duì)Epac1 ORF-正向引物5'-CCCCTTATCAAAGCTGATG-3'，Epac1 ORF-反向引物5'-CTAATCCTGCAAAAGAATA-3'擴(kuò)增Epac1，并將其插入pcDNA3.1載體中，構(gòu)建Epac1過(guò)表達(dá)載體。對(duì)于敲低Epac1 實(shí)驗(yàn)，分別向細(xì)胞轉(zhuǎn)染Epac1 shRNA（Epac1 shRNA 組）或shRNA NT（shRNA NT 組），未做任何轉(zhuǎn)染處理的細(xì)胞為Control 組。Epac1 shRNA 序列為5'-GCAGTGCTGCTCTGGCCGG-3'；shRNA NT 序列為5'-CACGGTCTGACACTGACTG-3'。對(duì)于敲低CREB 實(shí)驗(yàn)，分別向細(xì)胞轉(zhuǎn)染CREB shRNA（CREB shRNA 組）或shRNA NT-2（shRNA NT-2組），未做任何轉(zhuǎn)染處理的細(xì)胞為Control組。CREB shRNA 序列為5'-ACGGAGGAGCTTGTA CCAC-3'；shRNA NT-2序列為5'-CAGACTGTGCT AGACAATG-3'。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)

將6 孔板中的各組細(xì)胞制備為單細(xì)胞懸液，每0.5 mL 單細(xì)胞懸液中加入5 mL 冰預(yù)冷的70.0%乙醇，于4 ℃固定細(xì)胞過(guò)夜。次日，以800 r/min 離心15 min，收集固定好的細(xì)胞；加入0.5 mL PBS 重懸細(xì)胞。向單細(xì)胞懸液中加入終濃度為50 μg/mL 的RNase A，將細(xì)胞置于37 ℃水浴中孵育30 min。加入終濃度為65 μg/mL 的PI，于冰浴中避光孵育30 min。然后上機(jī)流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期。

1.9 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖能力

使用CCK-8 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)操作步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。使用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定光密度（optical density, OD）值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism v8統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。2 組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Epac1 在人fGH-PA 組織和大鼠垂體瘤細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)

與旁側(cè)正常組織相比，fGH-PA 組織中Epac1 mRNA 的表達(dá)水平明顯增高（P＜0.05），見(jiàn)圖1a；在fGH-PA組織中Epac1蛋白免疫組織化學(xué)著色明顯增強(qiáng)（P＜0.05），見(jiàn)圖1b。與RGC-5 細(xì)胞相比，MMQ 細(xì)胞和GH3 細(xì)胞中Epac1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05），見(jiàn)圖1c。

圖1 Epac1 mRNA和蛋白在fGH-PA組織和大鼠垂體瘤細(xì)胞系中的表達(dá)

2.2 過(guò)表達(dá)Epac1上調(diào)p-CREB 促進(jìn)大鼠垂體瘤細(xì)胞周期失調(diào)和大量增殖

與Control 組相比，Epac1-OE 組G0/G1 期和S 期細(xì)胞占比明顯減少（P＜0.05），G2/M期細(xì)胞占比明顯增多（P＜0.05）；Vector組G0/G1期、S期和G2/M 期細(xì)胞占比無(wú)明顯差異（P＞0.05），見(jiàn)圖2a、b。與Control 組相比，Epac1-OE 組細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)（P＜0.05）；而Vector 組細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯差異（P＞0.05），見(jiàn)圖2c。與Control 組相比，Epac1-OE 組細(xì)胞內(nèi)p-CREB、Cyclin D1 的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），CDK2 和p21 的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），CREB 的表達(dá)水平無(wú)明顯變化（P＞0.05）；而Vector 組細(xì)胞內(nèi)上述蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯差異（P＞0.05），見(jiàn)圖2d～f。

圖2 過(guò)表達(dá)Epac1前后細(xì)胞周期及其相關(guān)蛋白和細(xì)胞增殖能力變化測(cè)定

2.3 敲低Epac1 抑制大鼠垂體瘤細(xì)胞周期失調(diào)和大量增殖

與Control組相比，Epac1 shRNA組G0/G1期細(xì)胞占比明顯增多（P＜0.05），S期細(xì)胞占比明顯減少（P＜0.05），G2/M 期細(xì)胞占比無(wú)明顯差異（P＞0.05）；shRNA NT 組G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞占比無(wú)明顯差異（P＞0.05），見(jiàn)圖3a、b。與Control組相比，Epac1 shRNA組細(xì)胞增殖能力明顯減弱（P＜0.05）；而shRNA NT 組細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯差異（P＞0.05），見(jiàn)圖3c。與Control 組相比，Epac1 shRNA 組細(xì)胞內(nèi)p-CREB 和Cyclin D1 的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），CDK2 和p21 的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），CREB 的表達(dá)水平無(wú)明顯差異（P＞0.05）；而shRNA NT 組細(xì)胞內(nèi)上述蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯差異（P＞0.05），見(jiàn)圖3d～f。

2.4 敲低CREB 抑制大鼠垂體瘤細(xì)胞周期失調(diào)和大量增殖

與Control 組相比，CREB shRNA 組G0/G1 期細(xì)胞占比明顯增多（P＜0.05），S期細(xì)胞占比明顯減少（P＜0.05），G2/M 期細(xì)胞占比無(wú)明顯差異（P＞0.05）；shRNA NT-2組G0/G1 期、S 期和G2/M 期細(xì)胞占比無(wú)明顯差異（P＞0.05），見(jiàn)圖4a、b。CREB shRNA 組細(xì)胞增殖能力明顯減弱（P＜0.05）；而shRNA NT-2 組細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯差異（P＞0.05），見(jiàn)圖4c。與Control 組相比，CREB shRNA 組細(xì)胞內(nèi)p-CREB、CREB 和Cyclin D1 的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），CDK2 和p21 的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；而shRNA NT-2 組細(xì)胞內(nèi)上述蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯差異（P＞0.05），見(jiàn)圖4d～f。

3 討論

Epac1 與多種腫瘤的惡性增殖相關(guān)。鋰和Epac1特異性抑制劑ESI-09 協(xié)同抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和存活[7]。Epac1 在低級(jí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的分泌水平高于其在高級(jí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的分泌水平，并參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)展[8]。過(guò)表達(dá)RBM10 通過(guò)抑制Epac1 的激活抑制肺腺癌細(xì)胞增殖[9]。本研究也發(fā)現(xiàn)，Epac1 在人fGH-PA組織和大鼠垂體瘤細(xì)胞中高表達(dá)。

CREB 磷酸化和異?；罨纱龠M(jìn)癌細(xì)胞增殖。CREB 在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，并與食管癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤-淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移-遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移分期呈正相關(guān)。下調(diào)CREB 的表達(dá)可有效抑制體外和體內(nèi)食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)癌細(xì)胞S期周期停滯，引發(fā)細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞遷移和侵襲[10]。PAK1 對(duì)于許多癌癥的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要。在人非小細(xì)胞肺癌組織中發(fā)現(xiàn)，PAK1與CREB 的表達(dá)水平均升高，并且PAK1通過(guò)磷酸化CREB 促進(jìn)癌細(xì)胞增殖[11]。在彌漫性惡性間皮瘤組織中，Aki1 高表達(dá)并通過(guò)Aki1/AKT/p-CREB軸促進(jìn)癌細(xì)胞增殖[12]。本研究結(jié)果顯示，在GH3 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Epac1 能夠上調(diào)CREB 的磷酸化水平，敲低Epac1 能夠下調(diào)CREB 的磷酸化水平，上調(diào)p-CREB 能夠促進(jìn)細(xì)胞通過(guò)G1/S 期檢查點(diǎn)并大量增殖。這是一項(xiàng)新的發(fā)現(xiàn)，即在人fGH-PA 組織和大鼠垂體瘤細(xì)胞中高表達(dá)的Epac1 是通過(guò)上調(diào)CREB 的磷酸化水平促進(jìn)癌細(xì)胞G1/S 期檢查點(diǎn)失調(diào)并增殖。與此同時(shí)，本研究中敲低CREB 抑制大鼠垂體瘤細(xì)胞周期失調(diào)和大量增殖的結(jié)果也進(jìn)一步佐證了上述結(jié)論。

細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1、CDK2、p21 是關(guān)鍵的G1/S 期檢查點(diǎn)蛋白[13]。Cyclin D1 可以直接與基因組DNA 結(jié)合，作為轉(zhuǎn)錄因子激活或下調(diào)基因表達(dá)，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的促癌細(xì)胞增殖作用[14]。組成型激活的Rac1 上調(diào)p-AKT 和Cyclin D1，誘導(dǎo)癌細(xì)胞增殖[15]。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（Cyclindependent kinases，CDKs）能夠加強(qiáng)對(duì)細(xì)胞周期S 期的控制并抵消DNA 損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯[16]。AKT通過(guò)上調(diào)TopBP1 的磷酸化水平繞過(guò)CDK2 對(duì)G1/S 期的管控，增強(qiáng)DNA 復(fù)制并通過(guò)S 期，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖[17]。細(xì)胞對(duì)S 期管控失控會(huì)引發(fā)癌細(xì)胞大量增殖。有研究顯示，p21/p27 軸為G1/S 期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵檢查點(diǎn)通路，且該通路在許多癌癥中被劫持，使癌細(xì)胞維持不受控制的增殖狀態(tài)[18]。Suv4-20h1 通過(guò)下調(diào)慢性髓性白血病K562 細(xì)胞中p21WAF1/CIP1的表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞由G1 期向S 期轉(zhuǎn)變[19]。即癌細(xì)胞可通過(guò)上調(diào)Cyclin D1，抑制CDK2 和p21 的表達(dá)，通過(guò)G1/S 期檢查點(diǎn)并惡性增殖。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)Epac1 引起的p-CREB水平上調(diào)能夠引起CDK2 和p21 的表達(dá)下調(diào)及Cyclin D1 的高表達(dá)，導(dǎo)致癌細(xì)胞通過(guò)G1/S 期，發(fā)生大量增殖。

綜上，Epac1 在人fGH-PA 組織中高表達(dá)，且在GH3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Epac1能夠上調(diào)p-CREB的水平，促進(jìn)GH3細(xì)胞通過(guò)G1/S期檢查點(diǎn)，發(fā)生細(xì)胞周期檢查點(diǎn)失調(diào)和癌細(xì)胞大量增殖。但研究結(jié)論尚需進(jìn)行在體動(dòng)物模型水平上的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。