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        Epac1 對(duì)垂體腺瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響及分子機(jī)制研究

        2023-12-15 01:45:02王俊文黃逸民華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)外科湖北武漢430030
        局解手術(shù)學(xué)雜志 2023年12期
        關(guān)鍵詞:垂體瘤檢查點(diǎn)細(xì)胞周期

        孫 煒,王俊文,李 然,黃逸民,張 卓,雷 霆(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)外科,湖北 武漢 430030)

        垂體腺瘤(pituitary adenoma,PA)起源于垂體前葉,是第三大常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,是蝶鞍最常見(jiàn)的病變,占所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的10%[1-2]。大多數(shù)PA 為散發(fā),且65%以上為功能性PA 或激素分泌型PA,即使沒(méi)有發(fā)生轉(zhuǎn)移,也會(huì)導(dǎo)致激素分泌過(guò)多或分泌不足、視覺(jué)缺陷以及其他殘疾等[3]。功能性生長(zhǎng)激素垂體腺瘤(functional growth hormone-secreting pituitary adenoma,fGH-PA)是PA 最重要的一種形式,其分泌生長(zhǎng)激素和生長(zhǎng)激素釋放激素,引起生長(zhǎng)激素細(xì)胞增生和生長(zhǎng)激素過(guò)量釋放[4]。成年人生長(zhǎng)激素過(guò)量會(huì)導(dǎo)致肢端肥大癥;年輕人若在骨骺尚未閉合時(shí)開(kāi)始發(fā)病,會(huì)導(dǎo)致身材高大或巨人癥。

        細(xì)胞周期檢查點(diǎn)失調(diào)、細(xì)胞發(fā)生持續(xù)增殖是PA生長(zhǎng)的主要驅(qū)動(dòng)因素,高達(dá)80%的PA 存在G1/S 期檢查點(diǎn)失調(diào)[5]。cAMP 直接激活的交換蛋白1(exchange protein 1 directly activated by cAMP,Epac1)是一種新發(fā)現(xiàn)的cAMP 效應(yīng)器蛋白,在癌癥中具有雙重功能,可促進(jìn)或抑制癌癥的形成和進(jìn)展[6]。cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element-binding protein,CREB)是一種具有cAMP 響應(yīng)元件的轉(zhuǎn)錄因子,可通過(guò)下游多種通路改變細(xì)胞周期進(jìn)程。本研究通過(guò)測(cè)定PA 組織臨床樣本中Epac1 的表達(dá)水平和體外實(shí)驗(yàn),探討Epac1通過(guò)磷酸化CREB引起細(xì)胞周期檢查點(diǎn)失調(diào)、促進(jìn)PA細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 主要材料與試劑

        大鼠視網(wǎng)膜永生化細(xì)胞系RGC-5 細(xì)胞、大鼠泌乳素瘤細(xì)胞系MMQ 細(xì)胞、大鼠垂體瘤細(xì)胞系GH3 細(xì)胞、Ham's F-12K 培養(yǎng)液購(gòu)自武漢普諾賽生物科技有限公司。TRIzol 裂解緩沖液(批號(hào):2792739)、RIPA 裂解和提取緩沖液(批號(hào):YJ378720)、胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS;批號(hào):2831969RP)、DMEM 培養(yǎng)液(批號(hào):2797239)、Lipofectamine 3000 脂質(zhì)體(批號(hào):2754186)購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司。馬血清購(gòu)自上海酶研生物科技有限公司。FastKing RT Kit(批號(hào):116502396)、SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) Kit(批號(hào):205709634)購(gòu)自天根生化科技有限公司。一抗(兔抗人單抗):Epac1(批號(hào):107789164)、p-CREB(批號(hào):109645324)、CREB(批號(hào):315769455)、Cyclin D1(批號(hào):164389790)、CDK2(批號(hào):324758912)、p21(批號(hào):521467936)、β-actin(批號(hào)264683965)購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司。山羊抗兔IgG(H+L)HRP 二抗(批號(hào):LK7046567915)購(gòu)自杭州聯(lián)科生物科技有限公司。細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(PI/RNase A Staining;批號(hào):DJD45762318)購(gòu)自日本Dojindo生物公司。

        正置光學(xué)顯微鏡(型號(hào):ECLIPSE Ti2)購(gòu)自日本Nikon 株式會(huì)社,流式細(xì)胞儀(型號(hào):CytoFLEX SRT)購(gòu)自貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)(中國(guó))有限公司,酶標(biāo)儀(型號(hào):Sunrise)購(gòu)自帝肯(上海)實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

        1.2 臨床樣本收集

        收集2019 年8 月至2021 年7 月我院12 例肢端肥大癥患者的fGH-PA 組織。其中男7 例,女5 例;年齡26~56 歲,中位年齡39 歲。納入標(biāo)準(zhǔn):年齡在18 歲及以上;基于臨床特征和生化證據(jù)確診為肢端肥大癥;磁共振成像顯示蝶鞍內(nèi)有垂體瘤;經(jīng)2 h 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)后未抑制的生長(zhǎng)激素低于0.4 μg/L;胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin like growth factor-1,IGF-1)水平超過(guò)正常上限的1.3 倍;距離最近一次垂體手術(shù)已有3 個(gè)月以上。

        1.3 qPCR

        使用TRIzol裂解緩沖液在液氮中研磨并裂解組織或細(xì)胞,提取組織及細(xì)胞總RNA。使用FastKing RT Kit 試劑盒合成cDNA。使用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)Kit 進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增。引物序列(5'-3'):Epac1 正向GCTGGCTCCTTCGTCTGAG,Epac1 反向G CTGGCTCCTTCGTCTGAG;GAPDH 正向ATGGGCAG CCGTTAGGAAAG,GAPDH 反向AGGAAAAGCATCA CCCGGAG。

        1.4 免疫組織化學(xué)

        手術(shù)獲得fGH-PA 樣本后,立即浸沒(méi)于10%中性福爾馬林緩沖液中,4 ℃下固定超過(guò)48 h 后進(jìn)行石蠟包埋和切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化后,常規(guī)使用微波爐進(jìn)行抗原修復(fù)。向切片滴加3%的雙氧水,于室溫避光封閉30 min;向切片滴加封閉緩沖液,于室溫封閉1 h;向切片滴加Epac1 一抗工作液,于4 ℃孵育過(guò)夜;次日向切片滴加二抗山羊抗兔IgG(H+L)HRP 工作液,于室溫孵育1 h。向切片滴加生物素底物,于室溫孵育30 min;向切片滴加1×DAB 顯色液,避光顯色5~10 min,于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

        1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

        RGC-5 細(xì)胞培養(yǎng)于含10.0% FBS 和100 UI/mL 青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中;MMQ 細(xì)胞和GH3 細(xì)胞培養(yǎng)于含2.5% FBS、15.0%馬血清和100 UI/mL 青霉素-鏈霉素的Ham's F-12K 培養(yǎng)液中,置于37 ℃恒溫濕潤(rùn)的CO2孵育箱中維持培養(yǎng)。

        1.6 Western blot

        使用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解和提取緩沖液,在液氮中研磨并裂解組織或細(xì)胞,提取總蛋白。采用含10.0%脫脂奶粉的TBS-T緩沖液封閉PVDF 膜。向膜上滴加一抗工作液并于4 ℃孵育過(guò)夜。次日,向膜上滴加二抗工作液并于室溫孵育1 h。使用ECL 超敏化學(xué)發(fā)光底物對(duì)目的條帶進(jìn)行顯影。使用Image J v 1.8.0對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。

        1.7 轉(zhuǎn)染

        使用GH3細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,過(guò)表達(dá)或敲低Epac1,或敲低CREB。使用Lipofectamine 3000 脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染結(jié)束48 h 后,檢測(cè)下游指標(biāo)。對(duì)于過(guò)表達(dá)Epac1實(shí)驗(yàn),分別向細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒(Vector組)或pcDNA3.1-Epac1 質(zhì)粒(Epac1-OE 組),未做任何轉(zhuǎn)染處理的細(xì)胞為Control組。為了擴(kuò)增Epac1開(kāi)放閱讀框(open reading frame,ORF)完整序列,使用引物對(duì)Epac1 ORF-正向引物5'-CCCCTTATCAAAGCTGATG-3',Epac1 ORF-反向引物5'-CTAATCCTGCAAAAGAATA-3'擴(kuò)增Epac1,并將其插入pcDNA3.1載體中,構(gòu)建Epac1過(guò)表達(dá)載體。對(duì)于敲低Epac1 實(shí)驗(yàn),分別向細(xì)胞轉(zhuǎn)染Epac1 shRNA(Epac1 shRNA 組)或shRNA NT(shRNA NT 組),未做任何轉(zhuǎn)染處理的細(xì)胞為Control 組。Epac1 shRNA 序列為5'-GCAGTGCTGCTCTGGCCGG-3';shRNA NT 序列為5'-CACGGTCTGACACTGACTG-3'。對(duì)于敲低CREB 實(shí)驗(yàn),分別向細(xì)胞轉(zhuǎn)染CREB shRNA(CREB shRNA 組)或shRNA NT-2(shRNA NT-2組),未做任何轉(zhuǎn)染處理的細(xì)胞為Control組。CREB shRNA 序列為5'-ACGGAGGAGCTTGTA CCAC-3';shRNA NT-2序列為5'-CAGACTGTGCT AGACAATG-3'。

        1.8 流式細(xì)胞術(shù)

        將6 孔板中的各組細(xì)胞制備為單細(xì)胞懸液,每0.5 mL 單細(xì)胞懸液中加入5 mL 冰預(yù)冷的70.0%乙醇,于4 ℃固定細(xì)胞過(guò)夜。次日,以800 r/min 離心15 min,收集固定好的細(xì)胞;加入0.5 mL PBS 重懸細(xì)胞。向單細(xì)胞懸液中加入終濃度為50 μg/mL 的RNase A,將細(xì)胞置于37 ℃水浴中孵育30 min。加入終濃度為65 μg/mL 的PI,于冰浴中避光孵育30 min。然后上機(jī)流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期。

        1.9 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖能力

        使用CCK-8 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)操作步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。使用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定光密度(optical density, OD)值。

        1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        使用GraphPad Prism v8統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。2 組間比較采用t檢驗(yàn);多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 Epac1 在人fGH-PA 組織和大鼠垂體瘤細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)

        與旁側(cè)正常組織相比,fGH-PA 組織中Epac1 mRNA 的表達(dá)水平明顯增高(P<0.05),見(jiàn)圖1a;在fGH-PA組織中Epac1蛋白免疫組織化學(xué)著色明顯增強(qiáng)(P<0.05),見(jiàn)圖1b。與RGC-5 細(xì)胞相比,MMQ 細(xì)胞和GH3 細(xì)胞中Epac1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05),見(jiàn)圖1c。

        圖1 Epac1 mRNA和蛋白在fGH-PA組織和大鼠垂體瘤細(xì)胞系中的表達(dá)

        2.2 過(guò)表達(dá)Epac1上調(diào)p-CREB 促進(jìn)大鼠垂體瘤細(xì)胞周期失調(diào)和大量增殖

        與Control 組相比,Epac1-OE 組G0/G1 期和S 期細(xì)胞占比明顯減少(P<0.05),G2/M期細(xì)胞占比明顯增多(P<0.05);Vector組G0/G1期、S期和G2/M 期細(xì)胞占比無(wú)明顯差異(P>0.05),見(jiàn)圖2a、b。與Control 組相比,Epac1-OE 組細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)(P<0.05);而Vector 組細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯差異(P>0.05),見(jiàn)圖2c。與Control 組相比,Epac1-OE 組細(xì)胞內(nèi)p-CREB、Cyclin D1 的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05),CDK2 和p21 的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),CREB 的表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P>0.05);而Vector 組細(xì)胞內(nèi)上述蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P>0.05),見(jiàn)圖2d~f。

        圖2 過(guò)表達(dá)Epac1前后細(xì)胞周期及其相關(guān)蛋白和細(xì)胞增殖能力變化測(cè)定

        2.3 敲低Epac1 抑制大鼠垂體瘤細(xì)胞周期失調(diào)和大量增殖

        與Control組相比,Epac1 shRNA組G0/G1期細(xì)胞占比明顯增多(P<0.05),S期細(xì)胞占比明顯減少(P<0.05),G2/M 期細(xì)胞占比無(wú)明顯差異(P>0.05);shRNA NT 組G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞占比無(wú)明顯差異(P>0.05),見(jiàn)圖3a、b。與Control組相比,Epac1 shRNA組細(xì)胞增殖能力明顯減弱(P<0.05);而shRNA NT 組細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯差異(P>0.05),見(jiàn)圖3c。與Control 組相比,Epac1 shRNA 組細(xì)胞內(nèi)p-CREB 和Cyclin D1 的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),CDK2 和p21 的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05),CREB 的表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P>0.05);而shRNA NT 組細(xì)胞內(nèi)上述蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P>0.05),見(jiàn)圖3d~f。

        2.4 敲低CREB 抑制大鼠垂體瘤細(xì)胞周期失調(diào)和大量增殖

        與Control 組相比,CREB shRNA 組G0/G1 期細(xì)胞占比明顯增多(P<0.05),S期細(xì)胞占比明顯減少(P<0.05),G2/M 期細(xì)胞占比無(wú)明顯差異(P>0.05);shRNA NT-2組G0/G1 期、S 期和G2/M 期細(xì)胞占比無(wú)明顯差異(P>0.05),見(jiàn)圖4a、b。CREB shRNA 組細(xì)胞增殖能力明顯減弱(P<0.05);而shRNA NT-2 組細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯差異(P>0.05),見(jiàn)圖4c。與Control 組相比,CREB shRNA 組細(xì)胞內(nèi)p-CREB、CREB 和Cyclin D1 的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),CDK2 和p21 的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05);而shRNA NT-2 組細(xì)胞內(nèi)上述蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P>0.05),見(jiàn)圖4d~f。

        3 討論

        Epac1 與多種腫瘤的惡性增殖相關(guān)。鋰和Epac1特異性抑制劑ESI-09 協(xié)同抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和存活[7]。Epac1 在低級(jí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的分泌水平高于其在高級(jí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的分泌水平,并參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)展[8]。過(guò)表達(dá)RBM10 通過(guò)抑制Epac1 的激活抑制肺腺癌細(xì)胞增殖[9]。本研究也發(fā)現(xiàn),Epac1 在人fGH-PA組織和大鼠垂體瘤細(xì)胞中高表達(dá)。

        CREB 磷酸化和異?;罨纱龠M(jìn)癌細(xì)胞增殖。CREB 在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá),并與食管癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤-淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移-遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移分期呈正相關(guān)。下調(diào)CREB 的表達(dá)可有效抑制體外和體內(nèi)食管癌細(xì)胞生長(zhǎng),誘導(dǎo)癌細(xì)胞S期周期停滯,引發(fā)細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞遷移和侵襲[10]。PAK1 對(duì)于許多癌癥的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要。在人非小細(xì)胞肺癌組織中發(fā)現(xiàn),PAK1與CREB 的表達(dá)水平均升高,并且PAK1通過(guò)磷酸化CREB 促進(jìn)癌細(xì)胞增殖[11]。在彌漫性惡性間皮瘤組織中,Aki1 高表達(dá)并通過(guò)Aki1/AKT/p-CREB軸促進(jìn)癌細(xì)胞增殖[12]。本研究結(jié)果顯示,在GH3 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Epac1 能夠上調(diào)CREB 的磷酸化水平,敲低Epac1 能夠下調(diào)CREB 的磷酸化水平,上調(diào)p-CREB 能夠促進(jìn)細(xì)胞通過(guò)G1/S 期檢查點(diǎn)并大量增殖。這是一項(xiàng)新的發(fā)現(xiàn),即在人fGH-PA 組織和大鼠垂體瘤細(xì)胞中高表達(dá)的Epac1 是通過(guò)上調(diào)CREB 的磷酸化水平促進(jìn)癌細(xì)胞G1/S 期檢查點(diǎn)失調(diào)并增殖。與此同時(shí),本研究中敲低CREB 抑制大鼠垂體瘤細(xì)胞周期失調(diào)和大量增殖的結(jié)果也進(jìn)一步佐證了上述結(jié)論。

        細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1、CDK2、p21 是關(guān)鍵的G1/S 期檢查點(diǎn)蛋白[13]。Cyclin D1 可以直接與基因組DNA 結(jié)合,作為轉(zhuǎn)錄因子激活或下調(diào)基因表達(dá),在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的促癌細(xì)胞增殖作用[14]。組成型激活的Rac1 上調(diào)p-AKT 和Cyclin D1,誘導(dǎo)癌細(xì)胞增殖[15]。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclindependent kinases,CDKs)能夠加強(qiáng)對(duì)細(xì)胞周期S 期的控制并抵消DNA 損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯[16]。AKT通過(guò)上調(diào)TopBP1 的磷酸化水平繞過(guò)CDK2 對(duì)G1/S 期的管控,增強(qiáng)DNA 復(fù)制并通過(guò)S 期,促進(jìn)癌細(xì)胞增殖[17]。細(xì)胞對(duì)S 期管控失控會(huì)引發(fā)癌細(xì)胞大量增殖。有研究顯示,p21/p27 軸為G1/S 期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵檢查點(diǎn)通路,且該通路在許多癌癥中被劫持,使癌細(xì)胞維持不受控制的增殖狀態(tài)[18]。Suv4-20h1 通過(guò)下調(diào)慢性髓性白血病K562 細(xì)胞中p21WAF1/CIP1的表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞由G1 期向S 期轉(zhuǎn)變[19]。即癌細(xì)胞可通過(guò)上調(diào)Cyclin D1,抑制CDK2 和p21 的表達(dá),通過(guò)G1/S 期檢查點(diǎn)并惡性增殖。本研究結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)Epac1 引起的p-CREB水平上調(diào)能夠引起CDK2 和p21 的表達(dá)下調(diào)及Cyclin D1 的高表達(dá),導(dǎo)致癌細(xì)胞通過(guò)G1/S 期,發(fā)生大量增殖。

        綜上,Epac1 在人fGH-PA 組織中高表達(dá),且在GH3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Epac1能夠上調(diào)p-CREB的水平,促進(jìn)GH3細(xì)胞通過(guò)G1/S期檢查點(diǎn),發(fā)生細(xì)胞周期檢查點(diǎn)失調(diào)和癌細(xì)胞大量增殖。但研究結(jié)論尚需進(jìn)行在體動(dòng)物模型水平上的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

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