孫 悅，張楠淇，杜 銳，趙 巖

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長春 130000）

刺五加葉為五加科植物刺五加［Acanthopanax senticosus（Rupr.et Maxim） Harms］的干燥葉片，具有補益肝腎，益精壯骨之功效，適用于短暫性腦缺血、腦動脈硬化、腦栓塞等，亦可用于冠心病、心絞痛、以及神經(jīng)衰弱、更年期綜合癥等。《黑龍江省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（2001 年版）》記載刺五加葉化學(xué)成分包括刺五加苷I，K，L，M 以及金絲桃苷［1］，然而刺五加苷I，K，L，M 在五加屬植物中廣泛存在?；谝环N或多種成分測定的中藥質(zhì)量評價通常不能說明中藥物質(zhì)基礎(chǔ)的特異性和專屬性。針對上述存在的問題，本研究基于中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Quality marker，Q-marker）理論［2］，對刺五加葉的質(zhì)量標(biāo)志物進行預(yù)測，為刺五加葉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂及質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 基于化學(xué)組分和成分轉(zhuǎn)移證據(jù)的質(zhì)量標(biāo)志物分析

中藥的質(zhì)量要求是傳統(tǒng)中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展過程中的重要組成部分。中藥化學(xué)成分是發(fā)揮其功效的物質(zhì)基礎(chǔ)，能夠客觀的反映中藥質(zhì)量實質(zhì)性內(nèi)容。在中藥中存在的有效成分不同于一般化合物，是來自于多組分交互作用的天然產(chǎn)物［3］。因此，刺五加葉質(zhì)量標(biāo)志物的篩選應(yīng)通過化學(xué)物質(zhì)組成及成分傳遞確定。

1.1 化學(xué)物質(zhì)

目前，國內(nèi)外學(xué)者已從刺五加葉中鑒別出來200 多種化學(xué)成分，主要包括有黃酮、三萜、苯丙素、有機酸以及微量元素等［4-23］。刺五加葉含有豐富的黃酮及其苷類，目前已發(fā)現(xiàn)該類成分46 種，以黃酮醇苷和黃酮苷為主。三萜類成分是刺五加葉中重要次級代謝產(chǎn)物，以羽扇豆烷型、齊墩果烷型、烏蘇烷型和木栓型三萜居多，多以皂苷形式存在于植物體內(nèi)，目前已發(fā)現(xiàn)該類成分125 種。刺五加葉中的苯丙素類化合物包含簡單苯丙素類、香豆素、木脂素類化合物，目前已發(fā)現(xiàn)該類成分50 種。刺五加葉中還含有有機酸、類固醇、甾體、氨基酸等多種有機化合物及Ca、Mg、Ba、Na 等微量元素。具體信息見表1~3。

表1 刺五加葉中黃酮類化合物Tab.1 Flavonoids in Acanthopanax senticosus leaves

表2 刺五加葉中三萜類化合物Tab.2 Triterpenes in Acanthopanax senticosus leaves

表3 刺五加葉中苯丙素類化合物Tab.3 Phenylpropanoids in Acanthopanax senticosus leaves

1.2 基于血清藥物化學(xué)證據(jù)的質(zhì)量標(biāo)志物分析

中藥血清藥物化學(xué)是以實驗動物口服給藥后的血清為研究對象，借助傳統(tǒng)天然藥物化學(xué)的研究方法和現(xiàn)代技術(shù)應(yīng)用發(fā)展起來的，研究血清中的移行成分與中藥傳統(tǒng)療效之間的關(guān)系，闡明物質(zhì)在體內(nèi)的代謝學(xué)和動力學(xué)［24］，以期為刺五加葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供證據(jù)。Wang［25］等在對給藥刺五加葉的清醒缺血性中風(fēng)大鼠血漿和海馬中與治療效果相關(guān)的活性化合物分析過程中發(fā)現(xiàn)金絲桃苷、槲皮素、槲皮苷和咖啡酸可以通過血腦屏障，槲皮素比槲皮苷和金絲桃苷需要更長的攝取時間，但通過率更高。Yamauchi 等［26］在對刺五加葉提取物改善大鼠記憶能力研究中發(fā)現(xiàn)，灌胃給藥后血液和大腦中移行物質(zhì)包括刺五加苷M、刺五加皂苷C3、B 和A1，并驗證了刺五加苷M、刺五加皂苷C3、B的增強識別記憶活性。通過上述分析，從刺五加葉的原有成分到血中移行成分的系統(tǒng)標(biāo)識，刺五加葉中金絲桃苷、槲皮素、槲皮苷和咖啡酸，刺五加苷M、刺五加皂苷C3、B 和A1 可以考慮作為刺五加葉候選質(zhì)量標(biāo)志物。

2 基于植物親緣學(xué)相關(guān)證據(jù)的質(zhì)量標(biāo)志物分析

刺五加是小型灌木，為五加科五加屬植物。在我國五加屬植物中能夠藥用的植物種類較多，應(yīng)用歷史悠久。目前在全球范圍內(nèi)已發(fā)現(xiàn)37 種五加屬植物（不包括變種），主要分布于亞洲地區(qū)。我國的五加屬植物資源豐富，廣泛分布于長江流域，共有26 種18 變種，其中最常見的是細柱五加、刺五加和紅毛五加［27］。五加屬植物葉片的主要次生代謝產(chǎn)物為三萜類化合物，且以羽扇豆烷型三萜為主，如chiisanogenin 和chiisanoside 等［28］。將chiisanogenin、chiisanoside 等裂環(huán)羽扇豆烷型三萜作為五加科五加屬葉類分類依據(jù)具有重要植物資源研究意義。

3 基于中藥有效性證據(jù)的質(zhì)量標(biāo)志物分析

中藥質(zhì)量控制的根本目的是確保臨床用藥過程中的有效性和安全性，同時也是建立質(zhì)量標(biāo)志的核心內(nèi)容。中藥藥性和藥效是中醫(yī)藥理論的核心，反映了中醫(yī)藥在不同層面和方式下對人類疾病所產(chǎn)生的療效。刺五加葉質(zhì)量標(biāo)志物的研究應(yīng)包括對刺五加葉的藥性和藥效的認識，以此來反映中藥質(zhì)量的完整性［29］?！侗窘?jīng)》［30］中曾提到“入腹則知其性，入口則知其味”，中藥的本質(zhì)與其功效的性質(zhì)和屬性有關(guān)，并取決于中藥藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，將中藥藥性納入刺五加葉的質(zhì)量指標(biāo)，使中藥性質(zhì)與化學(xué)基團密切連接。

刺五加葉味辛、苦，性平，歸肝、腎經(jīng)。“辛”為五味之一，能散、能行、能通、能溫、能升、能潤、能化，其物質(zhì)基礎(chǔ)多為揮發(fā)油、苷類、生物堿和氨基酸成分。目前在刺五加葉中檢測到多種揮發(fā)性成分，其中以紅沒藥醇、石竹烯以及氧化石竹烯含量最高［31］；刺五加葉中含有多種黃酮苷類成分，主要包括槲皮苷、蘆丁、金絲桃苷等，以及少量三萜皂苷刺如五加皂苷A-E、chiisanoside等［32］；而生物堿成分在刺五加葉中少量存在，近年來僅發(fā)現(xiàn)兩種生物堿類成分Pheophorbide A 和Pyropheophorbide A［33］；此外，在刺五加葉中還檢測出多種氨基酸，其中以天冬氨酸和谷氨酸含量較高。中藥質(zhì)量評價的基本目的是患者在服用中藥后對機體產(chǎn)生的療效。因此，刺五加葉質(zhì)量標(biāo)志物重要的依據(jù)之一是探究刺五加葉的多種藥理活性。

3.1 對心腦血管的作用

刺五加葉可用于治療短暫性腦出血、腦動脈硬化、腦栓塞、冠心病等心腦血管疾病，皂苷類化合物為其主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。有研究發(fā)現(xiàn)，刺五加葉皂苷能夠減少大鼠心肌缺血-再灌注損傷（Myocardial infarction/reperfusion injury， MI/RI）模型的心肌梗死面積，通過激活ERK1/2 途徑減少心肌細胞凋亡；3，4-裂環(huán)羽扇豆烷型三萜皂苷chiisanoside、divaroside等能夠緩解BaCl2引起的室性心律失常［34-35］。刺五加葉具有神經(jīng)保護作用，并且對缺血性腦卒中具有一定的療效。口服刺五加葉能明顯降低缺血性腦卒中動物模型的腦含水量和腦指數(shù)，緩解血清和腦組織中的神經(jīng)遞質(zhì)含量異常變化；并能通過減少機體的氧化應(yīng)激和炎癥損傷，在一定程度上治療缺血性腦卒中［26，36］。刺五加葉能夠調(diào)節(jié)小鼠的認知功能。通過對小鼠進行一系列的學(xué)習(xí)和記憶測試發(fā)現(xiàn)，刺五加葉皂苷能夠增強小鼠的記憶能力，通過AGE-RAGE 和PI3K-Akt 信號通路發(fā)揮中樞神經(jīng)保護作用［23，36］。刺五加葉中三萜皂苷元chiisanogenin能夠有效抑制血小板聚集，其皂苷提取物能明顯改善實驗性腦缺血大鼠血液流變學(xué)和血小板功能的異常變化［37-38］。

3.2 對機體代謝的調(diào)節(jié)作用

刺五加葉能夠調(diào)節(jié)機體的代謝功能，刺五加苷E 能夠調(diào)節(jié)與脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因表達和代謝物，并且影響脂肪酸合成、β-氧化和脂肪分解過程。刺五加葉可以有效抑制脂肪酶的活性，能促進線粒體脂肪酸氧化和CPT 的活化，減輕高脂飲食引起的小鼠血漿TG水平升高［39-42］。

3.3 鎮(zhèn)靜催眠作用

刺五加葉提取物能夠抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，改善小鼠中樞神經(jīng)興奮。有研究發(fā)現(xiàn)，刺五加葉水提物的鎮(zhèn)靜催眠活性優(yōu)于醇提物，刺五加葉乙醇提取物對氯苯丙氨酸（4-Chloro-DL-phenylalanine， p-CPA）誘導(dǎo)的失眠小鼠有明顯的拮抗作用，不僅以劑量依賴的方式縮短睡眠潛伏期，而且還增加了小鼠海馬體中5-羥色胺（5-Hydroxytryptamine， 5-HT）和 γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid ， GABA）的表達［4，43］。

3.4 抗腫瘤作用

刺五加葉中的皂苷類化合物能抑制腫瘤細胞增殖和促進腫瘤細胞凋亡。有文獻報道，刺五加葉皂苷對小鼠食管癌移植瘤和腎癌細胞具有明顯的誘導(dǎo)凋亡及抗增殖作用，其機制可能與凋亡基因bax 蛋白表達增加、bcl-2 蛋白表達下降有關(guān)［44-45］。刺五加葉中含有的chiisanoside 對H22 荷瘤小鼠表現(xiàn)出抗癌活性，苷元chiisanogenin 對多種腫瘤細胞株表現(xiàn)出細胞毒活性。

3.5 免疫抗炎作用

刺五加葉具有良好的抗炎效果。研究發(fā)現(xiàn)，刺五加葉中提取的水溶性多糖具有顯著的免疫生物學(xué)活性［46-47］。刺五加葉中分離出的多種皂苷在脂多糖（Lipopolysaccharide， LPS）刺激的骨髓衍生樹突狀細胞（Bone marrow-derived dendritic cells， BMDCs）中表現(xiàn)出顯著的抗炎活性，能夠顯著抑制白細胞介素12（Interleukin-12， IL-12）的產(chǎn)生［46-47］。

3.6 其他

刺五加葉具有抗菌和胃黏膜保護作用。研究發(fā)現(xiàn)，刺五加苷K 可通過降低毒力來抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant staphylococcus aureus， MRSA）引起的感染［48］。chiisanoside、chiisanogenin 和金絲桃苷對G（+）和G（-）具有廣泛、中度的抗菌活性，最低抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration， MIC）在50~100 MIC g/ml 范圍內(nèi)［49］。刺五加葉還能保護急性胃黏膜損傷，可明顯減輕C48/80 誘導(dǎo)的黏液耗竭和胃黏膜炎癥反應(yīng)，通過抗凋亡機制減少胃黏膜的炎癥和氧化應(yīng)激［50］。

綜上，刺五加葉中裂環(huán)羽扇豆烷型三萜類化合物chiisanoside、divaroside、chiisanogenin，苯丙素苷類化合物刺五加苷E、K，以及黃酮苷類化合物金絲桃苷等成分可考慮作為刺五加葉的候選質(zhì)量標(biāo)志物。

4 基于化學(xué)成分可測性的質(zhì)量標(biāo)志物分析

中藥化學(xué)成分的可測性是建立刺五加葉質(zhì)量評價的基礎(chǔ)，同時也是刺五加葉質(zhì)量標(biāo)志物篩選的基本原則之一。中藥成分復(fù)雜不能全部滿足與中藥相關(guān)的專屬性要求，只有通過現(xiàn)代技術(shù)方法定性或定量要求的化合物才可以被納入到質(zhì)量標(biāo)志物之中。

4.1 定性分析

刺五加葉化學(xué)成分的定性分析和鑒別方法主要包括多種色譜、光譜方法及色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，常用的方法包括TLC、NMR、MS、HPLC-MS?？锖W(xué)課題組［18-20］通過UV、NMR 和MS 等光譜學(xué)分析手段從刺五加葉中定性鑒別出包括綠原酸、阿魏酸在內(nèi)的15 種酚酸類化合物和以蘆丁為代表的5 種黃酮類化合物。王知斌等［15］利用NMR和MS光譜學(xué)分析方法從刺五加葉中鑒定了包括金絲桃苷、槲皮素在內(nèi)的9 個黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)。李仁杰［51］以chiisanoside 和金絲桃苷為對照品建立了刺五加葉的TLC 鑒別方法。Liu 等［4］使用UPLC-Q/TOF-MS 聯(lián)用技術(shù)從刺五加葉中鑒定出75 種化合物。陳宏昌等［11］采用UPLC-QTOF-MS/MS 法對刺五加葉中的化學(xué)成分進行分析，指認出30個化學(xué)成分。

4.2 定量分析

針對刺五加葉中活性組分的理化性質(zhì)，學(xué)者們建立了刺五加葉活性組分的定量分析方法。其定量方法以分光光度法、HPLC 法為主，涉及到的活性物質(zhì)包括總黃酮、總皂苷等有效部位及以chiisanoside 為代表的裂環(huán)羽扇豆烷型三萜類、金絲桃苷等黃酮類、綠原酸等苯丙素類有效成分。李仁杰［51］建立了刺五加葉的總黃酮、裂環(huán)羽扇豆烷型總?cè)圃碥沼行Р课坏淖贤?可見分光光度含量測定方法及chiisanoside、chiisanogenin、金絲桃苷、木犀草苷和槲皮素的HPLC 含量測定方法，并闡明了上述有效物質(zhì)在刺五加葉中的積累規(guī)律。修成［52］利用高光譜無損成像技術(shù)，建立了刺五加冠層葉片中類黃酮含量的分類和預(yù)估方法，實現(xiàn)了避免環(huán)境影響和化學(xué)檢測破壞冠層葉片的快速、實時、準(zhǔn)確類黃酮定量分析。關(guān)欣等［53］利用一測多評技術(shù)建立了適用于刺五加葉中綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、槲皮苷等5 種成分含量的同時測定的HPLC方法。

綜上，基于化學(xué)成分可測性可將以chiisanoside和chiisanogenin 為代表的裂環(huán)羽扇豆烷型三萜皂苷類，以金絲桃苷、木犀草苷、槲皮素、槲皮苷為主的黃酮類，以綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸等苯丙素類成分作為刺五加葉的候選質(zhì)量標(biāo)志物。

5 結(jié)語

刺五加在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品，其葉具有補益肝腎，益精壯骨的功效，主要用于治療心腦方面的疾病，現(xiàn)如今廣泛地應(yīng)用于中藥復(fù)方和藥食同源的保健品，有巨大的市場需求量。產(chǎn)品原料的質(zhì)量及制劑的生產(chǎn)質(zhì)量與其臨床療效和安全性直接相關(guān)，雖然目前已針對部分刺五加葉中的化學(xué)成分建立了定性和定量分析方法，但這些化學(xué)成分的選擇依據(jù)及范圍仍欠缺系統(tǒng)性和全面性。采用系統(tǒng)嚴謹?shù)目茖W(xué)邏輯選定刺五加葉的質(zhì)量標(biāo)志物迫在眉睫。本文基于質(zhì)量標(biāo)志物的理論指導(dǎo)［54-55］，從刺五加葉原有成分到移行成分的系統(tǒng)標(biāo)識篩選出3種黃酮類、3種三萜皂苷類成分和2種苯丙素類成分作為候選質(zhì)量標(biāo)志物；基于植物親緣學(xué)的相關(guān)證據(jù)將chiisanoside 和chiisanogenin 為代表的羽扇豆烷型三萜類納入到刺五加葉的質(zhì)量標(biāo)志物行列；再從刺五加葉的傳統(tǒng)藥性理論和現(xiàn)代藥效學(xué)依據(jù)篩選出3種三萜類、2 種苯丙素類和1 種黃酮類成分；最后通過定性分析和定量分析的角度篩選出刺五加葉中的2 種三萜類、3 種苯丙素類和4 種黃酮類成分。最終確定三萜類成分chiisanoside、chiisanogenin，黃酮類成分金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素，苯丙素類成分刺五加苷E、綠原酸、咖啡酸作為刺五加葉的候選質(zhì)量標(biāo)志物。上述質(zhì)量標(biāo)志物可作為刺五加葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的參考，為建立全面系統(tǒng)的刺五加葉質(zhì)量控制體系，確保臨床療效和用藥安全提供依據(jù)。