吳世祥 尹恒,馬勇 崔恒燕 武豪 李青融 韓保國(guó) 倪志明 張亞峰.2*

1.南京中醫(yī)藥大學(xué),江蘇 南京 210023 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)無(wú)錫附屬醫(yī)院,江蘇 無(wú)錫 214071

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種全身性的骨骼疾病,由多種因素導(dǎo)致患者的骨密度降低、骨質(zhì)量變差甚至?xí)?dǎo)致骨組織微觀結(jié)構(gòu)的退行性病變,進(jìn)而引發(fā)了人體的骨脆性增加,更加容易致使患者發(fā)生骨折的代謝性骨病。目前骨密度(bone mineral density,BMD)是臨床上用來(lái)評(píng)估骨質(zhì)疏松癥的最常用的測(cè)量方法。國(guó)內(nèi)采用的雙能X線吸收法(DXA),DXA計(jì)算T值需采用中國(guó)人數(shù)據(jù)庫(kù),T值≥-1.0 SD 為正常;-2.5 SD

眾所周知,當(dāng)破骨細(xì)胞骨吸收大于成骨細(xì)胞骨形成,則會(huì)導(dǎo)致骨礦物質(zhì)減少,直接會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥,因此,臨床上治療骨質(zhì)疏松的策略目前主要是通過(guò)促進(jìn)骨形成或者抑制破骨細(xì)胞活性。破骨細(xì)胞活化和分化的抑制劑已經(jīng)在臨床上已使用多年,例如雌激素、雙膦酸鹽、降鈣素、地舒單抗等,但是這些藥無(wú)法促進(jìn)骨細(xì)胞的形成、功能的恢復(fù)以及骨結(jié)構(gòu)的重建,甚至還會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的不良反應(yīng)[4-5]。所以,迫切需要找到靶向骨再生同時(shí)將藥物治療引起的潛在危害最小化的治療方法,而外泌體則是作為治療骨質(zhì)疏松的潛在骨靶向藥物[6]。

1 外泌體的概述

外泌體是(EXOs)由細(xì)胞內(nèi)多泡體與細(xì)胞膜融合后釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中的膜性囊泡。幾乎所有類型的細(xì)胞,都可以產(chǎn)生并釋放外泌體。它是一種直徑為30～60 nm的納米級(jí)脂質(zhì)雙分子包裹體結(jié)構(gòu),內(nèi)部包裹了蛋白、脂質(zhì)衍生物、mRNA和micoRNA等物質(zhì)。外泌體通過(guò)體內(nèi)器官循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)其他細(xì)胞與組織,與靶細(xì)胞結(jié)合,進(jìn)而產(chǎn)生生物間的作用,而目前大量的研究表明,來(lái)源不同的外泌體所產(chǎn)生的功能也不盡相同,而其中有些來(lái)源的外泌體的功能與骨代謝相關(guān)聯(lián)。其中,Qin等[7]指出,外泌體可以通過(guò)調(diào)控體內(nèi)骨形成以及血管形成進(jìn)而刺激骨細(xì)胞再生的分子機(jī)制作用。一方面,外泌體通過(guò)參與除細(xì)胞外介質(zhì)的信息傳遞和交流而產(chǎn)生作用;另一方面,對(duì)于體內(nèi)不同的骨細(xì)胞而言,外泌體在一定程度上具有修復(fù)及促進(jìn)骨細(xì)胞再生的生理作用,并通過(guò)這條路徑來(lái)調(diào)控骨的生理和病理狀態(tài)[8-9],見圖1。

圖1 外泌體與骨形成的關(guān)系

2 不同來(lái)源的外泌體和骨質(zhì)疏松癥的關(guān)聯(lián)

2.1 脂肪源性外泌體與骨質(zhì)疏松癥關(guān)聯(lián)

脂肪源性干細(xì)胞(ADSCs)是間充質(zhì)干細(xì)胞的一種,可以從多種來(lái)源的脂肪組織中輕易獲得,并且具有多分化以及自我更新的潛能[11]。目前研究發(fā)現(xiàn)ADSCs數(shù)量眾多,它們易于分離、可操作,具有增殖和分化潛力,并且它們的端粒酶活性比BMSCs受年齡的影響更小,可以應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥的骨再生[12-13]。因此,ADSCs應(yīng)用的可能是骨質(zhì)疏松癥中的骨形成和骨結(jié)構(gòu)的重建一種基于BMSC有前景的治療策略[14]。來(lái)源于脂肪干細(xì)胞的外泌體(ADSCs-Exos)會(huì)含有ADSCs的活性物質(zhì),同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生與ADSCs相關(guān)的生理功能。2001年,Zuk等[15]的研究從脂肪組織中分離出ADSCs,并且發(fā)現(xiàn)ADSCs可以經(jīng)過(guò)培養(yǎng)分化成脂肪、成骨、成軟骨以及成肌細(xì)胞。作為ADSCs重要的生物活性物質(zhì),ADSCs-Exos在許多疾病中體現(xiàn)出了很強(qiáng)的再生潛力[16]。Wang等[17]研究顯示,TNF-a可以增加miR-141-5p的生成,進(jìn)而抑制原代成骨細(xì)胞的增殖分化,而通過(guò)嘗試用ADSCs-Exos培養(yǎng)經(jīng)過(guò)TNF-α處理過(guò)的原代成骨細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)ADSCs-Exos可以促進(jìn)細(xì)胞存活而減少細(xì)胞的凋亡,這表明ADSCs-Exos可以作為治療骨質(zhì)疏松癥患者的有前途的潛在標(biāo)志物。雖然目前國(guó)際上的研究發(fā)現(xiàn)ADSCs-Exos治療骨質(zhì)疏松癥的臨床效應(yīng)是有益的,但是其作用的潛在機(jī)制尚未明確,這需要我們?cè)诓痪玫膶?lái)通過(guò)更多的研究,以便于更加精確地描述這其中的潛在作用機(jī)制。

2.2 骨源性外泌體與骨質(zhì)疏松癥的關(guān)聯(lián)

2.2.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在某種程度被認(rèn)為是骨髓中成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的共同祖細(xì)胞,但是這兩種細(xì)胞本身是相互排斥的。人體在衰老的同時(shí),機(jī)體會(huì)抑制成骨細(xì)胞的形成,同時(shí)會(huì)增加脂肪細(xì)胞的形成,進(jìn)而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的產(chǎn)生。由于外泌體的納米顆粒大小、具有的脂雙層結(jié)構(gòu)和表面的特異性抗體,它們還可以發(fā)揮細(xì)胞通訊的作用并具有傳輸特性,使其成為治療骨質(zhì)疏松疾病的藥物遞送系統(tǒng)的理想候選者[21]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體(BMSCs-Exos)是BMSCs的主要活性產(chǎn)物,它應(yīng)該具備BMSCs的生理功能,可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的形成與分化,增加成骨細(xì)胞中骨基因的含量,促進(jìn)骨的形成,這為BMSCs-Exos正向調(diào)節(jié)骨代謝提供一定的理論支撐[18]。研究表明,BMSCs-Exos可抑制脂肪生成分化,同時(shí)促進(jìn)成骨分化和血管化,這逆轉(zhuǎn)了成骨和脂肪生成轉(zhuǎn)化之間的不平衡[19]。Wnt/β-Catenin通路是抑制成脂基因表達(dá)、恢復(fù)成骨細(xì)胞增殖和分化的重要信號(hào)機(jī)制。BMSCs-Exos攜帶microRNA-335,通過(guò)VapB和Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑促進(jìn)骨折恢復(fù)和成骨細(xì)胞分化[23]。

Zhao等[20]將BMSCs-Exos與成骨細(xì)胞共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)與絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路相關(guān)的蛋白表達(dá)增加,細(xì)胞周期S期所占比例顯著增加,提示BMSCs-Exos可通過(guò)激活MAPK信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。Zhang等[21]研究發(fā)現(xiàn),BMSCs-Exos顯著增加股骨發(fā)育不良大鼠模型的成骨、血管生成和骨折愈合,被人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和前成骨細(xì)胞吸收,并導(dǎo)致增值和遷移改善,這可能是由于BMP-2/Smad1/Runx2和HIF-1α/VEGF信號(hào)通路的激活[22]。來(lái)自BMSC的含MALAT1的外泌體通過(guò)介導(dǎo)microRNA-34c/SATB 2軸促進(jìn)成骨細(xì)胞中SATB2的表達(dá),從而緩解骨質(zhì)疏松癥。攜帶microRNA-122-5p的骨髓MSC來(lái)源的外來(lái)體通過(guò)下調(diào)RTK/Ras/MAPK信號(hào)通路來(lái)下調(diào)SPRY2并增加RTK活性來(lái)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化[24]。骨組織常規(guī)3 D-Exos培養(yǎng)顯示,3 D BMSC-Exos可通過(guò)激活HMGB 1/AKT通路促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移,形成血管腔,促進(jìn)血管生成,3 D BMSCExos有望成為人類醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中促進(jìn)血管生成的潛在治療方法[25]。Zhang 等[26]的研究首次表明BMMSC-Exos可以促進(jìn)大鼠骨不連模型中的血管生成和骨生成,體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,BMMSC-Exos可通過(guò)激活BMP-2/Smad 1/RUNX 2信號(hào)通路促進(jìn)成骨分化,還能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,BMMSC-Exos可明顯促進(jìn)血管生成。

綜上所述,BMSCs-Exos參與骨重建、成骨細(xì)胞增殖分化形成、血管內(nèi)皮細(xì)胞的生成與分化、各種機(jī)體免疫調(diào)節(jié)以及骨炎癥反應(yīng)的生理病理過(guò)程,同時(shí)也從各種研究以及途經(jīng)證明BMSCs-Exos將會(huì)是臨床上治療骨質(zhì)疏松癥的潛在指標(biāo),具體的作用機(jī)制以及利弊反應(yīng)還需要我們進(jìn)一步研究與探討。

2.2.2成骨細(xì)胞外泌體:成骨細(xì)胞體內(nèi)分化是人體骨折愈合的重要過(guò)程,是各種交叉因素的結(jié)果。目前已有研究證明TNF-α可通過(guò)多種機(jī)制抑制成骨細(xì)胞的骨形成功能,包括與其受體和死亡受體的相互作用。因此,推測(cè)TNF-α誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡可能與骨量丟失有關(guān),導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥,迫切需要新的治療策略來(lái)有效抑制TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和凋亡,以治療骨質(zhì)疏松癥[27]。鑒于BMSCs-Exos在骨再生治療中的作用,筆者研究了BMSCs-Exos是否能減弱TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和凋亡,結(jié)果顯示TNF-α依賴性地增加miR-146 a的表達(dá),降低細(xì)胞活力,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,如增加caspase-3,裂解caspase-3和Bax表達(dá)。TNF-α通過(guò)上調(diào)caspase-3和Bax的表達(dá),抑制MC3T3-E1細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)顯示,Rtn4-Exos通過(guò)海綿狀miR-146a減弱TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和凋亡,提示Rtn 4-Exos可能作為治療TNF-α誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥的有前景的候選物[27]。Xiong等[28]研究表明SIK2和SIK3是miR-5106的靶基因,從而強(qiáng)調(diào)了miR-5106在介導(dǎo)成骨細(xì)胞分化中的機(jī)制作用;當(dāng)下調(diào)時(shí),SIK2和SIK3不再能夠抑制BMSCs的成骨細(xì)胞分化,從而加速體內(nèi)骨折愈合。據(jù)報(bào)道研究探索,來(lái)源于礦化成骨細(xì)胞和牙髓細(xì)胞的外泌體可促進(jìn)成骨和成牙分化,中晚期成骨細(xì)胞分泌的外泌體,能夠促進(jìn)成骨形成[29]。Yang等[30]研究表明來(lái)自成骨細(xì)胞的外泌體也反向調(diào)節(jié)MSCs的分化,MSCs攝取成骨細(xì)胞外泌體可增加其Runx2和Osterix的表達(dá),從而促進(jìn)干細(xì)胞的成骨分化。Narayanan等[31]研究表明,小鼠體內(nèi)來(lái)自成骨細(xì)胞前體細(xì)胞的外泌體通過(guò)miRNA干擾骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化,骨髓基質(zhì)細(xì)胞攝取來(lái)自礦化前成骨細(xì)胞的外泌體可通過(guò)抑制Axin 1表達(dá)和增加β-catenin表達(dá)激活Wnt信號(hào)通路,促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化。因此,促進(jìn)成骨細(xì)胞的細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡似乎有希望預(yù)防和臨床治療骨質(zhì)疏松策略。

2.2.3破骨細(xì)胞外泌體:骨重建是骨生成和破骨細(xì)胞生成之間的動(dòng)態(tài)平衡。破骨細(xì)胞主要負(fù)責(zé)骨的分解和吸收,而成骨細(xì)胞則負(fù)責(zé)體內(nèi)新骨形成,同時(shí)破骨細(xì)胞還可以刺激骨形成,從而導(dǎo)致合成代謝的影響。破骨細(xì)胞衍生的外泌體的生物學(xué)活性包括破骨細(xì)胞生成的調(diào)節(jié)和破骨細(xì)胞-成骨細(xì)胞間的通訊。由于破骨細(xì)胞衍生的外泌體具有調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的潛力,它們?cè)诠琴|(zhì)疏松癥和其他骨代謝疾病中的應(yīng)用目前正在研究中[32]。

越來(lái)越多的研究報(bào)道表明成骨細(xì)胞祖細(xì)胞也能感受破骨細(xì)胞分泌的或在細(xì)胞膜上表達(dá)的破骨細(xì)胞衍生信號(hào)以促進(jìn)成骨分化。例如,破骨細(xì)胞來(lái)源的外來(lái)體miR-214-3p和骨細(xì)胞來(lái)源的外來(lái)體miR-218均可調(diào)節(jié)成骨分化[33]。Liang等[34]研究通過(guò)一系列的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn),確定破骨細(xì)胞分泌的外泌體中的miR-324能夠轉(zhuǎn)移到原代間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)中,促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化,從而提出了一種新的miRNA介導(dǎo)的破骨細(xì)胞-成骨細(xì)胞偶聯(lián)模式。Liang等[34]同時(shí)使用miRNA微陣列分析鑒定了miR-324在破骨細(xì)胞源性外泌體中高表達(dá),體外和體內(nèi)研究均表明miR-324顯著促進(jìn)成骨分化,miR-324通過(guò)靶向ARHGAP1(成骨分化的負(fù)調(diào)節(jié)因子),顯著誘導(dǎo)MSCs體外成骨分化和礦化[34]。綜上所述,成熟破骨細(xì)胞釋放的含miR-324的外泌體在成骨分化的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,并可能橋接破骨細(xì)胞和MSCs之間的偶聯(lián),以上研究表明破骨細(xì)胞來(lái)源的外泌體中的miR-324促進(jìn)MSCs的成骨分化。

眾所周知,骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞是RANKL和骨保護(hù)素的主要提供者,因此不僅對(duì)破骨細(xì)胞形成的調(diào)節(jié)至關(guān)重要,而且它們同時(shí)協(xié)調(diào)和維持骨吸收和骨形成之間的平衡[35]。攜帶RANK的破骨細(xì)胞外泌體可以結(jié)合成骨細(xì)胞表面活化轉(zhuǎn)錄因子Runx2,從而促進(jìn)骨形成[36]。早期研究表明,成骨細(xì)胞通過(guò)RANKL和成骨細(xì)胞分泌的骨保護(hù)素之間的緊密相互作用來(lái)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化,相反破骨細(xì)胞源性RANK也調(diào)節(jié)骨生成,并偶聯(lián)骨吸收和骨形成[37]。破骨細(xì)胞中的相關(guān)miRNA被轉(zhuǎn)移到成骨細(xì)胞中并影響成骨細(xì)胞分化和骨形成[38]。由此破骨細(xì)胞外泌體的促進(jìn)骨形成和骨重建作用已經(jīng)明確,但是其作用機(jī)制尚未完全明確,還需更多的研究來(lái)探索。

2.3 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與骨質(zhì)疏松癥的關(guān)聯(lián)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSC)外泌體促進(jìn)組織再生和修復(fù),可用于多種疾病的治療;然而,微環(huán)境條件對(duì)外泌體的影響仍不清楚。據(jù)相關(guān)研究探索,臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(HUMSC)對(duì)骨再生的成骨誘導(dǎo)功能,HUMSC來(lái)源的外泌體(Exos)促進(jìn)新骨形成,并對(duì)骨生成和血管生成產(chǎn)生積極影響[39]。HUMSCs通常以無(wú)創(chuàng)方式采集,具有較強(qiáng)的再生能力,在再生醫(yī)學(xué)中具有廣闊的應(yīng)用前景[40]。最新研究發(fā)現(xiàn),HUMSC-Exos可以再生自體骨髓干細(xì)胞(ABMSCs),有效延緩衰老,在治療背景下,HUMSC-EV對(duì)ABMSCs的恢復(fù)作用增強(qiáng)骨形成、傷口愈合和骨組織的血管生成[41]。Li等[42]的研究強(qiáng)調(diào)了HUMSC-Exos通過(guò)促進(jìn)大鼠壞死骨組織中的血管生成而在股骨頭缺血性壞死中的潛在作用。通過(guò)miR-21-PTEN-AKT信號(hào)通路上調(diào)HUMSC來(lái)源的外來(lái)體中的AKT信號(hào)通路和減少大鼠糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨壞死中的破骨細(xì)胞凋亡,外分泌由人HUMSC分泌也可以減少BMSC通過(guò)mir-1263細(xì)胞凋亡/Mob1河馬不使用的信號(hào)途徑,可以有效地防止骨質(zhì)疏松大鼠的骨量丟失[43]。從機(jī)制上講,來(lái)源于成骨誘導(dǎo)的HUMSCs的外泌體miRNA參與骨發(fā)育和分化,例如破骨細(xì)胞分化和MAPK信號(hào)通路。hsa-mir-2110和hsa-mir-328-3p的表達(dá)隨著成骨分化的延長(zhǎng)而逐漸增加,并調(diào)控與骨分化相關(guān)的靶基因,提示它們可能是外泌體中最重要的成骨調(diào)控microRNA[44]。HUMSC外泌體對(duì)骨質(zhì)疏松癥模型小鼠的治療作用,6周后小鼠脛骨和松質(zhì)骨的MicroCT掃描顯示,在三維圖像中,Exo 1和Exo 2相對(duì)于假手術(shù)組誘導(dǎo)增加的骨量,在成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)的微環(huán)境中,來(lái)源于HucMSC的外泌體能夠顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化[45]。越來(lái)越多的研究證實(shí)了HUCMSC-Exos的抗凋亡作用[46]。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,人臍帶華頓膠質(zhì)MSC-Exos(hWJMSC-Exos)能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的遷移和增殖,促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖。Jiang等[45]的研究還發(fā)現(xiàn)hWJMSC-Exos可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2表型極化,hWJMSC-Exos可增強(qiáng)ACECM支架的作用,促進(jìn)骨軟骨再生,此外,microRNA(miRNA)測(cè)序證實(shí)hWJMSC-Exos含有多種miRNA,能夠促進(jìn)透明軟骨的再生,不管Exos來(lái)源于哪種MSCs,MSC-Exos在促進(jìn)BMSC和軟骨細(xì)胞增殖和遷移中的作用可能是普遍的,hWJMSC-Exos可促進(jìn)骨軟骨再生。這種作用可能歸因于Exos對(duì)關(guān)節(jié)腔炎癥的抑制和Exos miRNA對(duì)軟骨ECM合成的促進(jìn)。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可以促進(jìn)骨形成以及血管形成,而且可以無(wú)創(chuàng)式采集,具有很強(qiáng)的增生能力,可以作為治療骨質(zhì)疏松治療的一個(gè)潛在生物靶點(diǎn)。

3 結(jié)論

外泌體是近年來(lái)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中出現(xiàn)的一種新的生物學(xué)元件。近年來(lái)研究表明,不同來(lái)源的外泌體均可通過(guò)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸(mRNA、miRNA、lncRNA等)調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖和分化,對(duì)椎間盤退變、肌腱再生以及心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)疾患有顯著的治療作用,可能用于創(chuàng)傷修復(fù)、心血管系統(tǒng)保護(hù)、神經(jīng)損傷治療和臨床診斷。外泌體通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入靶細(xì)胞發(fā)揮生物活性作用,表現(xiàn)出與來(lái)源干細(xì)胞相似的能力。

綜上所述,本文主要闡述了不同來(lái)源的外泌體在防治骨質(zhì)疏松癥治療方面的應(yīng)用機(jī)制。迄今為止,外泌體治療骨質(zhì)疏松癥具有很大的優(yōu)越性,同時(shí)具備更高的安全性,而且外泌體作為理想載體,可以更加準(zhǔn)確以及高效率的穿透細(xì)胞膜傳遞藥物和基因分子物質(zhì)。但是通過(guò)各種途徑提純出的大量的外泌體無(wú)法進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的保存,而且不同來(lái)源外泌體對(duì)于治療骨質(zhì)疏松的機(jī)制與信號(hào)通路各不相同,骨重建和信號(hào)級(jí)聯(lián)背后的分子機(jī)制尚不清楚,本研究對(duì)各種干細(xì)胞來(lái)源的外泌體針對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠深入,外泌體在骨質(zhì)疏松癥方面的研究前景十分廣闊,這需要未來(lái)共同努力探索。