劉建軍 陳欣, 汪欣月 齊偉 王多賢 席芳琴 李寧, 柳軍璽 謝興文,*

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,甘肅 蘭州 730000 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué),甘肅 蘭州 730000 3.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029 4.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所,甘肅 蘭州 730000

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)以關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)椴±硖卣?是影響中老年人群關(guān)節(jié)功能的主要疾病[1]。非甾體類藥物抗炎止痛治療OA,長期服用存在消化道出血風(fēng)險(xiǎn)。目前,臨床尚缺乏既能夠抗炎又能夠延緩軟骨退變的藥物治療OA。軟骨細(xì)胞外基質(zhì)是關(guān)節(jié)軟骨的重要組成部分,影響軟骨生物力學(xué)功能和軟骨細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等細(xì)胞行為。軟骨細(xì)胞外基質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)在OA關(guān)節(jié)退變中發(fā)揮著重要作用[2]。自身免疫炎癥反應(yīng)是OA軟骨細(xì)胞外基質(zhì)破壞的主要的原因[3]?；ぜ?xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子激活基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)和Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTS),抑制細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅱ型膠原α1鏈(COL2α1)和蛋白多糖(ACAN)表達(dá),使軟骨組織發(fā)生退變導(dǎo)致OA的發(fā)生[4-5]。因此,延緩軟骨細(xì)胞外基質(zhì)分解、促進(jìn)合成代謝是OA防治的重要方向。

藁本內(nèi)酯(Z-ligustilide,LIG)是中藥當(dāng)歸的主要活性成分,具有抗炎活性,能保護(hù)軟骨細(xì)胞,延緩OA軟骨退變的優(yōu)勢(shì),但是藁本內(nèi)酯常溫容易分解,化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定[6-7]。藁本內(nèi)酯衍生物(ligusticum cycloprolactam,LIGc)保留了LIG活性的結(jié)構(gòu)衍生物,具有生物利用度高,常溫下化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)(如圖1)[8-9]。LIGc對(duì)OA的作用未見報(bào)道,本研究通過探究藁本內(nèi)酯衍生物調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成與分解代謝作用,為其延緩軟骨退變治療OA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖1 LIG藁本內(nèi)酯與藁本內(nèi)酯衍生物化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 試劑

藁本內(nèi)酯衍生物相對(duì)分子質(zhì)量247,純度≥98%。大鼠軟骨細(xì)胞購自北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司(2021061311501),IL-1β購自Peprotech公司(批號(hào):H0921DMEM)。CCK8試劑夠自NCM Biotech公司(批號(hào):20220507)、RIPA裂解液購自Servicebio公司(批號(hào):CR2101120)、RNAex Pro RNA提取試劑(批號(hào):A3A2161)、Evo M-mLV 反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒(批號(hào):A3A1403)、SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型RT-qPCR試劑盒(批號(hào):A3A1983)均購自Accurate Biotechnology公司。COX-2一抗(批號(hào):31296111P56)購自BOSTER公司,HMGB1(批號(hào):BA07071406)、NF-κB P65一抗(批號(hào):AH04138226)購自Bioss公司、TLR4一抗(批號(hào):GR271818-5)購自Abcam公司。

1.2 細(xì)胞分組及造模

大鼠軟骨細(xì)胞用含有10%胎牛血清培養(yǎng)液1640進(jìn)行培養(yǎng)并隔日換一次液。10 ng/mL IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞炎癥損傷模型。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和IL-1β組、藁本內(nèi)酯衍生物高劑量組(0.4 μmol/mL)、中劑量組(0.2 μmol/mL)組和低劑量組(0.1 μmol/mL)組,除空白對(duì)照組組外,每組分別加入10 ng/mL的IL-1β處理軟骨細(xì)胞,30 min后加入不同濃度的藁本內(nèi)酯衍生物L(fēng)IGc孵育24 h。

1.3 CCK8法檢測細(xì)胞活性

無菌條件下將大鼠軟骨細(xì)胞均勻接種在96孔板上,在恒溫培養(yǎng)箱中孵育過夜,按照要求濃度進(jìn)行藥物處理,并設(shè)置空白對(duì)照和正常細(xì)胞對(duì)照組,繼續(xù)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后向每孔加入10 μL CCK8溶液將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h,1 000 r/min離心10 min,分離并丟棄上清液,每孔加入DMSO 150 mL,平板振蕩10 min后,在酶標(biāo)儀450 nm處測吸光度OD值,根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞的存活率。

1.4 細(xì)胞免疫熒光檢測

對(duì)96孔板內(nèi)培養(yǎng)的各組大鼠軟骨細(xì)胞IL-1β與藁本內(nèi)酯衍生物干預(yù)處理后用PBS洗3次,加入多聚甲醛固定30 min,隨后順序加入2% Triton X-100進(jìn)行透化處理15 min后用檸檬酸鈉進(jìn)行熱修復(fù)2次,每次5 min。孔板中滴加正常山羊血清封閉后常溫孵育30 min,再用無菌濾紙去除血清再直接滴加第一抗稀釋液(1∶100),濕盒中4 ℃冰箱過夜,常溫下復(fù)蘇后用PBS洗滌3次,每次5 min。再次滴加二抗常溫孵育1 h,PBS洗滌3次,每次5 min。滴加DAPI常溫孵育10 min,PBS洗滌3次,每次5 min。用抗熒光淬滅劑封片同時(shí)使用熒光顯微鏡和圖像采集系統(tǒng)采集圖像。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(realtime-quantitativepolymerasechainreaction,RT-qPCR)檢測基因表達(dá)

在上述實(shí)驗(yàn)分組的情況下收集細(xì)胞進(jìn)行總RNA的提取及測定。用Trizol法提取總RNA,采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA,采用3步法進(jìn)行PCR反應(yīng)程序并依據(jù)溶解曲線對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物特異性進(jìn)行判定。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參,相對(duì)表達(dá)量用2-△△CT法分析。引物合成使用PrimerPremier 5.0軟件。引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)引物序列

1.6 蛋白印跡(Western blot)檢測蛋白表達(dá)

收集好的細(xì)胞加入RIPA液提取蛋白,用蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。上樣緩沖液與蛋白樣本混合后98 ℃煮沸5 min后冰浴5 min,蛋白變性后經(jīng)SDS-PAGE電泳分析,將電泳后蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,將PVDF膜防置在脫脂牛奶中加入一抗過夜孵育,第2天加入相應(yīng)二抗常溫孵育1 h,用TBST洗膜,用Image J軟件對(duì)條帶量化觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測藁本內(nèi)酯衍生物對(duì)軟骨細(xì)胞活力的影響

與空白對(duì)照組組比較,IL-1β組細(xì)胞活性明顯降低(P<0.01);與IL-1β組比較,藁本內(nèi)酯衍生物組(0.4、0.2、0.1 μmol/mL)細(xì)胞活力顯著升高(P<0.01)。見圖2。

圖2 藁本內(nèi)酯衍生物對(duì)軟骨細(xì)胞活力的影響

2.2 免疫熒光檢測COL2α1和ACAN表達(dá)

COL2α1和ACAN在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá),呈綠色熒光,軟骨細(xì)胞胞核被DAPI染成藍(lán)色,Merge為藍(lán)色、綠色熒光表達(dá)的組合比較。空白對(duì)照組可見較多的綠色熒光,COL2α1和ACAN在細(xì)胞核內(nèi)高表達(dá),IL-1β組綠色熒光數(shù)量明顯減少;與模型組比較,藁本內(nèi)酯衍生物組綠色熒光數(shù)量顯著增加,COL2α1和ACAN高表達(dá),與藁本內(nèi)酯衍生物濃度呈正相關(guān),見圖3(A、C)。

圖3 藁本內(nèi)脂衍生物組對(duì)軟骨細(xì)胞COL2a1、ACAN免疫熒光表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較,模型組COL2α1和ACAN的表達(dá)明顯降低(P<0.01);與IL-1β組比較,COL2α1表達(dá)藁本內(nèi)酯衍生物組明顯升高(P<0.01),ACAN表達(dá)中、高組明顯升高(P<0.01),見圖3(B、D)。

2.3 藁本內(nèi)酯衍生物對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞PRG4、SOX9、MMP13、ADAMTS5基因表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較,IL-1β組PRG4、SOX9 mRNA的表達(dá)水平顯著降低,MMP13、ADAMTS5 mRNA的表達(dá)水平顯著升高;與IL-1β組相比,藁本內(nèi)酯衍生物(0.4 μmol/mL、0.2 μmol/mL)組PRG4、SOX9 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01),MMP13、ADAMTS5mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.01),且變化與藁本內(nèi)酯衍生物劑量呈負(fù)相關(guān),見圖4。

圖4 藁本內(nèi)酯衍生物對(duì)軟骨細(xì)胞PRG4、SOX9、MMP13、ADAMTS5 mRNA表達(dá)的影響

2.4 藁本內(nèi)酯衍生物對(duì)炎癥因子HMGB1、COX-2蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較,IL-1β組HMGB1、COX-2的表達(dá)水平顯著升高;與IL-1β組相比,藁本內(nèi)酯衍生物(0.4 μmol/mL)組、藁本內(nèi)酯衍生物(0.2 μmol/mL)組和藁本內(nèi)酯衍生物(0.1 μmol/mL)組細(xì)胞中HMGB1、COX-2的蛋白表達(dá)水平顯著降低,且變化與LIGc呈負(fù)相關(guān),見圖5。

2.5 藁本內(nèi)酯衍生物對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響

與空白對(duì)照組比較,IL-1β組TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01),與IL-1β比較,藁本內(nèi)酯衍生物(0.4、0.2、0.1 μmol/mL)組TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01);藁本內(nèi)酯衍生物(0.4、0.2、0.1 μmol/mL)能降低TLR4、NF-κB p65蛋白的表達(dá),表明藁本內(nèi)酯衍生物能抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活。見圖6。

圖6 藁本內(nèi)酯衍生物對(duì)軟骨細(xì)胞TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響

3 討論

隨著我國人口老齡化社會(huì)結(jié)構(gòu)進(jìn)程導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病率逐年上升。目前缺乏有效治療藥物,尤其是延緩軟骨退變、增強(qiáng)關(guān)節(jié)功能同時(shí)不良反應(yīng)小的疾病修飾藥物(DMOAD)[10]。研究發(fā)現(xiàn),中藥及其單體是骨關(guān)節(jié)炎藥物天然庫,具有研究開發(fā)的價(jià)值[11]。研究表明,藁本內(nèi)酯是當(dāng)歸發(fā)揮活血化瘀功效的物質(zhì)基礎(chǔ),屬于天然苯酞類化合物[12-13],具有抗炎[14]、抗氧化應(yīng)激[15]、保護(hù)細(xì)胞[2],延緩軟骨退變和炎癥治療OA的作用。因此,藁本內(nèi)酯具有骨關(guān)節(jié)炎疾病修飾藥物研究價(jià)值和潛力。但是,藁本內(nèi)酯室溫下結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定可脫氫、氧化和降解,不易保存,導(dǎo)致藁本內(nèi)酯進(jìn)一步研究和開發(fā)研究困難。柳軍璽團(tuán)隊(duì)通過對(duì)藁本內(nèi)酯穩(wěn)定化目標(biāo),進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾形成常溫下結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的白色晶體化合物,命名為藁本內(nèi)酯衍生物(LIGc)。Zhang等[9]研究發(fā)現(xiàn)藁本內(nèi)酯衍生物保留了藁本內(nèi)酯生物活性,而且口服生物利用度顯著升高。高娟[16]研究發(fā)現(xiàn)LIGc能夠通過活化BID/NF-κB信號(hào)通路治療神經(jīng)炎性疾病。目前,藁本內(nèi)酯衍生物對(duì)于OA治療作用及機(jī)制尚未不明確,本研究通過探討藁本內(nèi)酯衍生物對(duì)IL-1β誘導(dǎo)大鼠軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成與分解代謝的影響,為進(jìn)一步研究該藥治療OA作用及機(jī)制提供理論依據(jù)。

軟骨細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)是OA關(guān)節(jié)退變的重要病理標(biāo)記[17]。自身免疫紊亂引起滑膜細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放IL-1β等炎癥介質(zhì),激活軟骨ECM分解代謝因子,抑制合成代謝因子,導(dǎo)致軟骨ECM降解和軟骨退變[18]。其中,聚集蛋白和膠原蛋白II是維持軟骨ECM功能的主要成分,分解代謝因子導(dǎo)致膠原蛋白II合成不足,從而促進(jìn)了軟骨ECM降解[19]。SOX9和PRG4是軟骨ECM合成代謝的重要轉(zhuǎn)錄因子,能促進(jìn)膠原蛋白II、蛋白聚糖基因轉(zhuǎn)錄。MMP-13和ADAMTS5是ECM重要的分解代謝因子,激活細(xì)胞外基質(zhì)的分解代謝。本研究也發(fā)現(xiàn),IL-1β即可抑制COL2α1和ACAN蛋白表達(dá)(P<0.01),用藁本內(nèi)酯衍生物(0.4、0.2、0.1 μmol/mL)處理后可促進(jìn)COL2α1和ACAN蛋白表達(dá)(P<0.01)。藁本內(nèi)酯衍生物能減弱IL-1β對(duì)SOX9、PRG4基因表達(dá)的抑制作用(P<0.01),同時(shí)抑制MMP-13、ADAMTS-5基因表達(dá)(P<0.01)。因此,藁本內(nèi)酯衍生物能抑制軟骨ECM的分解代謝,促進(jìn)軟骨ECM合成代謝。

骨關(guān)節(jié)炎是慢性低度免疫炎癥反應(yīng)性疾病。HMGB1和COX-2是免疫炎癥反應(yīng)的中心分子,在OA炎癥反應(yīng)中均發(fā)揮著重要的作用,在關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要作用[20]。研究發(fā)現(xiàn),HMGB1和COX-2抑制劑在臨床上治療OA疼痛及腫脹療效顯著[21-22]。本研究顯示,IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞中HMGB1和COX-2高表達(dá)(P<0.01),而藁本內(nèi)酯衍生物抑制IL-1β對(duì)軟骨細(xì)胞中COX-2和HMGB1表達(dá)(P<0.01)。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明藁本內(nèi)酯衍生物能抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

TLR4/NF-κB通路是OA免疫炎癥反應(yīng)的經(jīng)典通路,IL-1β等炎癥因子激活TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)MMP-13、ADAMTS-5等細(xì)胞外基質(zhì)分解代謝因子的表達(dá)[23-24]。為了進(jìn)一步探究藁本內(nèi)酯衍生物干預(yù)IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)分解與合成代謝的可能機(jī)制,本研究對(duì)TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白進(jìn)行了檢測。研究結(jié)果表明藁本內(nèi)酯衍生物能顯著抑制軟骨細(xì)胞炎癥損傷模型中TLR4、NF-κB p65的蛋白表達(dá)(P<0.01)。綜上所述,研究發(fā)現(xiàn)藁本內(nèi)酯衍生物能夠抑制IL-1β所致炎癥因子表達(dá),上調(diào)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成代謝因子、下調(diào)分解代謝因子,具有延緩骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解及炎癥治療OA的作用。藁本內(nèi)酯衍生物作用機(jī)制與其調(diào)節(jié)OA免疫炎癥反應(yīng)及其相關(guān)的TLR4/NF-κB信號(hào)通路途徑有關(guān)。總之,本研究初步探究藁本內(nèi)酯衍生物對(duì)軟骨大鼠細(xì)胞炎癥及細(xì)胞外基質(zhì)降解的作用及可能作用機(jī)制,為進(jìn)一步研究藁本內(nèi)酯衍生物治療OA奠定理論基礎(chǔ),但具體作用靶點(diǎn)和機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究探究。