陳巧鳳 施建輝 羅昌林

1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院骨科,福建 泉州 362000 2.福建醫(yī)科大學(xué),福建 福州 362002

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與關(guān)節(jié)內(nèi)外軟組織和骨骼對(duì)尿酸鈉鹽(monosodium urate,MSU)沉積產(chǎn)生的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)。炎癥反復(fù)及間歇性的發(fā)作可產(chǎn)生慢性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎,導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和骨骼破壞,隨著疾病的發(fā)展甚至可能出現(xiàn)局部骨質(zhì)疏松[1]。晶體誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎癥和應(yīng)激反應(yīng)涉及關(guān)節(jié)周圍組織中的多種類型細(xì)胞加入,包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和滑膜細(xì)胞,這些細(xì)胞的產(chǎn)生會(huì)增加其他促炎細(xì)胞因子(如IL-1β和IL-6)的釋放,導(dǎo)致關(guān)節(jié)組織受損。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎可檢測(cè)到關(guān)節(jié)周圍骨侵蝕和軟骨丟失等代謝性變化,以及代謝性新骨形成[2]。成骨細(xì)胞的生存能力是骨重建的限速步驟,成骨細(xì)胞數(shù)量和功能與MSU的刺激有關(guān)[3]。

飲食習(xí)慣、痛風(fēng)的病理特點(diǎn)以及有限的治療方法使痛風(fēng)的治療具有挑戰(zhàn)性。因此,人類正在積極研究痛風(fēng)的發(fā)病機(jī)制和尋找有效的治療方法[4]。急性痛風(fēng)的有效治療方法包括秋水仙堿、非甾體抗炎藥、別嘌醇、非布司他等,但這些藥物可能引起肝腎功能損傷、胃腸道反應(yīng)等副作用[5]。因此,尋找低毒、安全、有效的天然化合物已成為痛風(fēng)治療的研究重點(diǎn)之一[6]。

萊菔硫烷(sulforaphane,SFN)是從花椰菜和西蘭花等蔬菜中提取的一種活性成分。由于其在Nrf2激活中的特殊能力,SFN被認(rèn)為是Nrf2的激活劑,并被視為預(yù)防和(或)治療氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的補(bǔ)充劑。SFN是核因子紅系2相關(guān)因子2(Nrf2)抗氧化反應(yīng)元件(ARE)遺傳途徑的有效激活劑。Nrf2-ARE的上調(diào)增加了多種抗氧化劑的可用性,這些抗氧化劑在細(xì)胞氧化還原平衡和抗氧化刺激保護(hù)中起著關(guān)鍵作用。SFN降低了許多疾病的風(fēng)險(xiǎn)以及氧化應(yīng)激和炎癥條件下的癥狀負(fù)擔(dān)[7]。然而,關(guān)于SFN影響痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的研究很少,尤其是那些伴有骨破壞的關(guān)節(jié)炎。本研究旨在評(píng)估SFN對(duì)MSU誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞損傷的作用,這可能是預(yù)防和治療痛風(fēng)患者骨侵蝕的一種方法。

1 材料與方法

1.1 成骨細(xì)胞的培養(yǎng)

將細(xì)胞接種到25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,加入4～5 mL含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞在37 ℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞狀態(tài),每天更換一次細(xì)胞培養(yǎng)基,每3 d傳代一次。

1.2 CCK-8檢測(cè)MSU和SFN對(duì)UMR-106細(xì)胞活力的影響

1.2.1成骨細(xì)胞接種:采用CCK-8法檢測(cè)UMR-106細(xì)胞的活力和增殖情況。將細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整為3×103個(gè)/孔,將其接種到96孔板中,并在37 ℃和5% CO2加濕條件下孵育。在細(xì)胞完全貼壁后,吸出完整的培養(yǎng)基并加入無血清培養(yǎng)基,并保持細(xì)胞培養(yǎng)24 h。

1.2.2血清干預(yù):在培養(yǎng)基中分別加入MSU(10、50、100、300、500 μg/mL)和SFN(1、5、10、20、50 μmol/L),不同濃度的每種藥物6個(gè)孔。

1.2.3CCK8添加:向每個(gè)孔中加入10 μL CCK8,在37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)4 h。

1.2.4OD值檢測(cè):采用標(biāo)準(zhǔn)化酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞活力。將96孔板放入酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)中,打開計(jì)算機(jī)并按照說明進(jìn)行操作,檢測(cè)OD值。根據(jù)吸光度值,比較不同濃度的含藥血清和模型血清對(duì)細(xì)胞增殖的影響,確定最佳含藥血清濃度。

1.3 細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)

設(shè)置0 μg/mL MSU+0 μmol/L SFN組為CON組,300 μg/mL MSU+0 μmol/L SFN組為MSU組,使用ROS敏感的熒光探針2',7'-二氯二氫熒光素二乙酯(DCFH-DA)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組后,對(duì)其進(jìn)行常規(guī)消化,收集細(xì)胞沉淀物,并制備細(xì)胞懸浮液。用無血清培養(yǎng)基以1∶1 000的比例稀釋DCFH-DA,以達(dá)到10 μmol/L的所需工作濃度。收集后將細(xì)胞懸浮在稀釋的DCFH-DA中,并在37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。每隔3～5 min將其倒置混合一次,以確保探針與細(xì)胞完全接觸。使用PBS洗滌來去除未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA。采用488 nm激發(fā)波長和525 nm發(fā)射波長,熒光強(qiáng)度作為熒光分光光度計(jì)。對(duì)照組的熒光強(qiáng)度為100%,并將其他各組與對(duì)照組進(jìn)行比較,以計(jì)算細(xì)胞內(nèi)ROS的變化。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

用胰蛋白酶消化收集培養(yǎng)的UMR-106細(xì)胞。細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌3次,并在4 ℃和1 000 r/min下離心5 min;將上清液丟棄。然后用1 mL結(jié)合緩沖液洗滌細(xì)胞,并在4 ℃和1 000 r/min下離心5 min;將上清液丟棄。然后加入100 μL的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,加入5 μL的PI和5 μL的FITC膜聯(lián)蛋白V混合均勻,在26 ℃的黑暗中孵育15 min,與400 μL的結(jié)合緩沖劑混合,并立即用流式細(xì)胞儀盡快檢測(cè)[8]。

1.5 細(xì)胞標(biāo)記蛋白表達(dá)的檢測(cè)

在培養(yǎng)基中加入10 μmol/L SFN和300 μmol/L MSU 48 h后,用常規(guī)細(xì)胞裂解液收集UMR-106細(xì)胞并獲得蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)離心和濃度測(cè)定采用BCA法。將制備的粘合劑和30 μg蛋白質(zhì)加熱變性,加載并電泳檢測(cè)。在70 V電壓和110 V電壓下作用30 min后,切割粘合劑并轉(zhuǎn)移膜,在60 V電壓下作用2 h后密封膜。將膜與Nrf2、HO-1、HIF-1、IL-6和caspase-3的一級(jí)抗體(1∶200)孵育1 h,用TBST洗脫3次(每次15 min)。加入第二種抗體,以(1∶1 000)稀釋,用于洗脫、化學(xué)發(fā)光、顯影和固定。β-actin作為內(nèi)部參考,并使用圖像分析系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,測(cè)量數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組之間使用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較,多組之間使用單向方差分析進(jìn)行比較,成對(duì)比較使用Bonferroni調(diào)整的t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSU降低成骨細(xì)胞的活性

MSU對(duì)成骨細(xì)胞活性的毒性作用隨著濃度和時(shí)間的增加而增加,當(dāng)濃度為300 μg/mL,反應(yīng)時(shí)間48 h時(shí),細(xì)胞活力低于50%。本研究選擇濃度為300 μg/mL的MSU作為成骨細(xì)胞損傷作用濃度,48 h作為細(xì)胞損害的作用時(shí)間。見圖1。

圖1 不同濃度的MSU降低成骨細(xì)胞的活性

2.2 SFN對(duì)成骨細(xì)胞生存能力的影響

1、5和10 μmol/L濃度的SFN對(duì)細(xì)胞活力沒有影響,但20 μmol/L和50 μmol/L的SFN顯著降低了細(xì)胞活力,尤其是作用時(shí)間超過48 h。當(dāng)SFN濃度為20 μmol/L時(shí),細(xì)胞活力降至50%以下。因此,本研究選擇1、5、10 μmol/L作為成骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)濃度,48 h作為實(shí)驗(yàn)時(shí)間。見圖2。

圖2 不同濃度的SFN對(duì)成骨細(xì)胞活力的影響

2.3 SFN降低MSU誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞ROS水平

SFN降低了MSU引起的ROS水平增加,并且隨著濃度的增加效果越明顯。當(dāng)SFN濃度為10 μmol/L時(shí),MSU誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組之間的ROS水平差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

圖3 SFN降低MSU誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞ROS水平

2.4 SFN逆轉(zhuǎn)MSU誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡水平

MSU增加了成骨細(xì)胞的凋亡,SFN減少了MSU引起的細(xì)胞凋亡,并且隨著SFN濃度的增加效果更好。當(dāng)SFN濃度為10 μmol/L時(shí),MSU誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組之間的細(xì)胞凋亡差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖4。

圖4 SFN逆轉(zhuǎn)MSU誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡水平

2.5 SFN降低MSU誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞中HIF-1、IL-6、caspase-3蛋白的表達(dá),增加Nrf2、HO-1的蛋白表達(dá)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證SFN對(duì)MSU誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的影響,本研究檢測(cè)了氧化指標(biāo)(Nrf2、HO-1、HIF-1)、炎癥指標(biāo)(IL-6)和凋亡指標(biāo)(caspsae-3)蛋白。發(fā)現(xiàn)與MSU組相比,SFN可以降低HIF-1、IL-6和caspase-3蛋白,但增加Nrf2和HO-1蛋白。見圖5。

圖5 SFN對(duì)MSU誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞蛋白質(zhì)的影響

3 討論

高尿酸血癥在骨質(zhì)疏松癥中起著重要作用。一些研究表明,高尿酸血癥會(huì)導(dǎo)致尿酸降解過程中許多因子過量產(chǎn)生,包括自由氧基、超氧化物和炎性細(xì)胞因子[9],這些因子刺激破骨細(xì)胞的產(chǎn)生,抑制成骨細(xì)胞的形成,增加骨吸收,減少骨形成。高尿酸血癥引起的維生素D缺乏會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。如果產(chǎn)生過量的嘌呤或尿酸排泄不足,體內(nèi)的尿酸量就會(huì)增加。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是指過量的尿酸結(jié)晶積聚在關(guān)節(jié)中,并導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛和腫脹[10]。促炎細(xì)胞因子是介導(dǎo)急性和慢性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的重要分子。研究表明,受痛風(fēng)影響的關(guān)節(jié)骨重塑紊亂和骨侵蝕是MSU晶體直接和間接作用的綜合結(jié)果。

本研究發(fā)現(xiàn)低劑量SFN可以有效降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平,并減輕MSU晶體誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡。本研究表明,SFN劑量依賴性地削弱了MSU對(duì)成骨細(xì)胞凋亡水平和細(xì)胞內(nèi)ROS水平的刺激作用,并提高了成骨細(xì)胞的活力水平。本研究發(fā)現(xiàn),SFN給藥組Nrf2、HO-1水平升高以及HIF-1、IL-6和caspase-3水平降低同時(shí)發(fā)生。研究表明,氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在痛風(fēng)影響成骨細(xì)胞的過程中發(fā)揮著重要作用。痛風(fēng)的病理學(xué)非常復(fù)雜,涉及多方面的模型,包括炎癥過程、氧化應(yīng)激和潛在的遺傳影響之間的相互作用。Nrf2在疾病的發(fā)展和維持中起著關(guān)鍵作用[11]。

SFN是一種來源于十字花科蔬菜的化合物,已被證明是安全無毒的,副作用小,由于其多種生物活性,如抗癌和抗氧化活性,已被廣泛研究[12]。SFN的抗氧化功能是由Nrf2依賴性誘導(dǎo)的血紅素加氧酶-1(HO-1)介導(dǎo)的,它保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激。核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[13-14]。Nrf2是一種氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子,通過對(duì)血紅素加氧酶-1(HO-1)酶表達(dá)/活性的積極影響來調(diào)節(jié)宿主應(yīng)激反應(yīng),從而導(dǎo)致有效的微生物清除。Nrf-2是氧化反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子,維持組織的正常功能。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎通過Nrf2轉(zhuǎn)錄因子途徑產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[15]。痛風(fēng)誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體和Nrf2的激活,Nrf2在細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中起保護(hù)作用[16]。本研究證實(shí),SFN可以逆轉(zhuǎn)MSU對(duì)成骨細(xì)胞的破壞作用,提高成骨細(xì)胞存活率和活性[17]。

綜上,SFN可以通過減少細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)來提高M(jìn)SU誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的活性并降低其凋亡水平。