王槐駿,楊城,李瑋民,冉棟成,彭維艷,王春慶

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院,貴州 貴陽 550004; 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 急診外科,貴州 貴陽 550004)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種臨床表現(xiàn)為骨強(qiáng)度下降的代謝性骨骼疾病,其特征是骨量減少和骨組織微觀結(jié)構(gòu)破壞[1]。目前治療OP的藥物主要包括雙磷酸類藥物、骨合成代謝藥物、雷洛昔芬及雌激素等,但并不能治愈OP[2]。因此尋找新的治療方法或者靶點(diǎn)對(duì)于抑制OP的發(fā)生發(fā)展具有重要的意義。微小RNA(microRNA,miRNA或miR)是一類長(zhǎng)度約為20～25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA,是重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子,常異常表達(dá)在許多疾病發(fā)生的過程中[3]。miRNA通過結(jié)合靶基因的3′-非翻譯區(qū)(untranslated region,3′-UTR)來干擾mRNA表達(dá),從而改變生物活性[4]。miRNA通過相關(guān)信號(hào)通路調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)最終影響骨的生成及代謝[5]。因此有理由認(rèn)為miRNA在OP的發(fā)病進(jìn)程中起著重要的作用。目前已有研究報(bào)道,miR-125b-5p在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的骨丟失小鼠模型中顯著升高[6];此外,OP患者外周血和骨組織中miR-125b表達(dá)均異常升高[7],且miR-125b能夠抑制人牙周膜干細(xì)胞的成骨分化[8],因此有理由認(rèn)為miR-125b-5p可能參與了OP的發(fā)病進(jìn)程。然而,miR-125b-5p對(duì)OP大鼠骨丟失的調(diào)控作用及相關(guān)分子機(jī)制目前尚不十分清楚。因此,本研究擬探討miR-125b-5p對(duì)OP大鼠骨丟失的影響,同時(shí)利用生物信息學(xué)方法探討其潛在的分子機(jī)制,為闡明OP的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6月齡健康清潔級(jí)Sprague-Dawley (SD)雌性大鼠15只,體質(zhì)量(300±100)g,購(gòu)自于學(xué)校動(dòng)物房(430726210100391485);本研究已獲得學(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(1702032)。

1.1.2主要試劑與儀器 miR-125b-5p激動(dòng)劑 (miR-125b-5p agomir,agomiR-125b-5p)、空載體陰性對(duì)照(NC agomir,agomiR-NC;上海吉瑪基因公司),磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)緩沖液及1 mL注射器(中國(guó)biosharp公司);顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描(microscopic computed tomography,micro-CT;德國(guó)Siemens 公司)。

1.2 研究方法

1.2.1基因芯片信息 從公共基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(www.ncbi.nlm.nih.gov)[9]獲取OP相關(guān)數(shù)據(jù)集(GSE93883),其中包括3例健康人群的血漿樣本(GSM2464442、GSM2464443及GSM2464445),3例OP患者的血漿樣本(GSM2464453、GSM2464446及GSM2464451)。使用GEO2R工具在線分析篩選差異基因,將基因芯片表達(dá)矩陣信息下載分析miR-125b-5p的表達(dá)量,利用R軟件進(jìn)行火山圖及熱圖可視化,標(biāo)注miR-125b-5p;參數(shù)默認(rèn);差異閾值為fold change>2和P<0.05。

1.2.2OP模型大鼠的構(gòu)建 選取3只大鼠,予5%異戊巴比妥鈉按5 mg/100 g行腹腔注射麻醉,脊柱兩側(cè)背部肋骨下緣開1～2 cm切口,剪下卵巢及部分輸卵管,予青霉素20 000 U/只腹腔注射預(yù)防感染3 d,為OP組;另選取大鼠3只,只行背部切口,不切除卵巢,為假手術(shù)(sham operation,Sham)組。術(shù)后3月,對(duì)上述2組大鼠采用micro-CT以12～20 μm的分辨率掃描骨骼,使用Bruker mCT評(píng)估軟件構(gòu)建和分析骨骼的3D圖像,以骨體積分?jǐn)?shù)(percent bone volume,BV/TV)、骨密度bone mineral density,BMD)評(píng)價(jià)OP模型構(gòu)建是否成功[10]。

1.2.3OP大鼠分組及給藥 選擇6月齡雌性SD大鼠9只,按“1.2.2”項(xiàng)下方法構(gòu)建OP模型大鼠,隨機(jī)均分為agomiR-NC組(agomiR-NC干粉33 μg+PBS溶液125 μL)、PBS組(PBS溶液125 μL)及agomiR-125b-5b組(agomiR-125b-5p干粉33 μg+PBS溶液125 μL),各組大鼠尾靜脈注射相應(yīng)處理,1次/周,持續(xù)2個(gè)月;干預(yù)結(jié)束后脫頸椎處死各組大鼠,收集脛骨進(jìn)行micro-CT掃描,記錄BV/TV、BMD、骨小梁數(shù)目(trabecular number,Tb.N)、骨小梁分離度 (trabecular separation,Tb.Sp)及結(jié)構(gòu)模式指數(shù)(structure model index,SMI)等骨相關(guān)參數(shù)。

1.2.4hsa-miR-125b-5p-mRNA靶基因預(yù)測(cè) 公共數(shù)據(jù)庫(kù) starbase(https://starbase.sysu.edu.cn/)作為微小rna-125b-5p (hsa-miR-125b-5p)靶基因預(yù)測(cè)來源,選擇以5種預(yù)測(cè)軟件中至少在4種預(yù)測(cè)軟件(targetScanSites[11]、picTarSites、RNA22Sites、PITASites、miRandaSites[12])中都預(yù)測(cè)到的信使RNA(messenger RNA,mRNA)作為最終結(jié)果,再使用cytoscape軟件[13]對(duì)miR-125b-5p-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化。

1.2.5基因本體( gene ontology,GO)功能富集分析、京都基因和基因基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號(hào)通路分析 使用clusterProfiler R包(v3.18.1)[14]對(duì)在“1.2.4”項(xiàng)下至少4種預(yù)測(cè)軟件都預(yù)測(cè)到的靶基因進(jìn)行GO富集和KEGG分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-125b-5p的表達(dá)

通過GEO2R在線分析共獲得956個(gè)差異miRNA,其中502個(gè)上調(diào),454個(gè)下調(diào);利用 R 包繪制火山圖及熱圖進(jìn)行可視化分析發(fā)現(xiàn),OP患者血漿中miR-125b-5p顯著增高。見圖1。

注：A為通過GEO2R在線分析篩選出的差異基因繪制的火山圖,紅點(diǎn)表示上調(diào)的miRNAs,綠點(diǎn)表示下調(diào)的miRNAs,灰點(diǎn)表示無顯著意義變化的miRNAs;B為利用基因芯片表達(dá)矩陣信息繪制的熱圖,紅色表示差異miRNAs上調(diào),藍(lán)色代表差異miRNAs下調(diào)。

2.2 OP模型大鼠的構(gòu)建

去卵巢術(shù)后3個(gè)月對(duì)OP組及Sham組大鼠脛骨行micro-CT掃描提示,相較于Sham組,OP組大鼠脛骨骨量明顯減少,且BV/TV、BMD低于Sham組(P<0.05或P<0.01),提示本研究OP模型構(gòu)建成功。見圖2。

注：A為micro-CT掃描松質(zhì)骨三維成像圖(2.3×),B、C分別為BV/TV和BMD的定量結(jié)果;與Sham組比較,(1)P<0.01,(2)P<0.05。

2.3 agomiR-125b-5p對(duì)OP大鼠骨量的影響

去卵巢術(shù)后連續(xù)注射2月對(duì)3組大鼠脛骨行micro-CT掃描,結(jié)果提示(圖3),與agomiR-NC組與PBS組比較,agomiR-125b-5p組大鼠骨小梁稀疏,骨量減少;與agomiR-NC組比較,agomiR-125b-5p組大鼠脛骨BV/TV和Tb.N下降,Tb.Sp和SMI升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);agomiR-NC組與PBS組大鼠脛骨上述指標(biāo)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：A為micro-CT掃描二維成像圖(2.3×);B為BV/TV、Tb.N、Tb.Sp及SMI骨參數(shù)指標(biāo)定量結(jié)果;(1)與agomiR-NC組比較,P<0.05。

2.4 hsa-miR-125b-5p的靶基因

預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,4 種軟件預(yù)測(cè)hsa-miR-125b-5p的靶基因102個(gè),進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化(圖4);5 種軟件都預(yù)測(cè)到hsa-miR-125b-5p 的靶基因8個(gè),分別是BCL2拮抗劑/殺傷因子1(BCL2 antagonist/killer 1,BAK1)、磷酸核糖焦磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶(phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase,PPAT)、亮氨酰和胱氨酰氨肽酶(leucyl and cystinyl aminopeptidase,LNPEP)、SUV39H1組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(SUV39H1 histone lysine methyltransferase,SUV39H1)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖4 (glypican 4,GPC4)、絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶11 (mitogen-activated protein kinase kinase kinase 11,MAP3K11)、高爾基體相關(guān)ARF結(jié)合蛋白2 (golgi associated,gamma adaptin ear containing,ARF binding protein 2,GGA2)及氧甾醇結(jié)合蛋白樣9 (oxysterol binding protein like 9,OSBPL9)。

注：紅色為hsa-miR-125b-5p,藍(lán)色則為hsa-miR-125b-5p下游預(yù)測(cè)到的mRNA。

2.5 GO功能富集分析和KEGG信號(hào)通路分析

對(duì)“2.4”項(xiàng)下預(yù)測(cè)到的102個(gè)靶基因進(jìn)行GO富集分析,根據(jù)富集數(shù)目及顯著程度,選取10條GO功能過程繪制氣泡圖,結(jié)果顯示,GO富集涉及生物過程(biological process,BP)主要包括pre-microrna的處理、負(fù)調(diào)控冷誘導(dǎo)產(chǎn)熱和調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的程度等,分子功能(molecular function,MF)顯示主要為金屬胺肽酶活性、泛素結(jié)合酶活性等;對(duì)預(yù)測(cè)到的102個(gè)靶基因進(jìn)行KEGG分析,選取前10條通路,結(jié)果顯示KEGG信號(hào)通路為腎素-血管緊張素系統(tǒng)和泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解等。見圖5及表1。

表1 預(yù)測(cè)的miR-125b-5p下游靶基因的KEGG信號(hào)通路

注：A、B及C分別為BP、MF及KEGG信號(hào)通路;顏色越紅代表P值越小、可信度越高,圓點(diǎn)越大、表示數(shù)目越多。

3 討論

前期研究發(fā)現(xiàn)OP患者miR-125b-5p異常升高[15],因此有理由認(rèn)為miR-125b-5p可能參與OP的發(fā)生發(fā)展。為了研究miR-125b-5p在OP進(jìn)程中的作用,首先利用生物信息學(xué)技術(shù)分析表明,miR-125b-5p在OP患者血漿中顯著升高,這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步表明了miR-125b-5p在OP中的重要性。因此,為研究miR-125b-5p在OP中的作用,本課題組將miR-125b-5p的模擬物注射到雙側(cè)卵巢切除后的大鼠尾靜脈,用以評(píng)估其作用。雙側(cè)卵巢切除術(shù)的雌性大鼠目前已經(jīng)成為最常用的OP模型,可模擬絕經(jīng)后由于雌激素缺乏所誘導(dǎo)的骨丟失[16]。通過大鼠尾靜脈注射后收集各組大鼠脛骨進(jìn)行micro CT掃描檢測(cè)的結(jié)果表明,相較于其他組,agomiR-125b-5p 組大鼠脛骨BV/TV和Tb.N下降,Tb.Sp和SMI升高。BV/TV、Tb.N、Tb.Sp及SMI均是骨結(jié)構(gòu)參數(shù),可用于精準(zhǔn)檢測(cè)松質(zhì)骨的定量分析[17]。上述結(jié)果表明了agomiR-125b-5p可以顯著促進(jìn)去卵巢后大鼠由于雌激素缺乏所誘導(dǎo)的骨丟失。

上述結(jié)果表明agomiR-125b-5p可以促進(jìn)OP大鼠的骨丟失,但是其調(diào)控骨丟失下游的靶基因及通路尚未明確,因此本研究通過生物信息學(xué)對(duì)其進(jìn)行分析。首先對(duì)miR-125b-5p進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),由于不同預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)有一定差異,因此取5種預(yù)測(cè)軟件所獲得的靶基因交集進(jìn)行探討更具有可信度;分析后取交集共獲得了靶基因8個(gè),分別是PPAT、LNPEP、SUV39H1、GPC4、BAK1、MAP3K11、GGA2及OSBPL9,提示這些預(yù)測(cè)到的靶基因可能與miR-125b-5p促進(jìn)骨丟失密切相關(guān)。有研究報(bào)道,缺乏 BAK會(huì)減少成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的凋亡并增加骨量[18]。miR-125b-5p可能是通過減少BAK1的表達(dá),進(jìn)而減少成骨細(xì)胞的凋亡,最終增加骨量,因此BAK1可能是參與OP的發(fā)病的重要靶基因。而其他預(yù)測(cè)到的靶基因關(guān)于OP的研究尚不清楚,因此這些靶基因可作為調(diào)控OP發(fā)展下游的分子進(jìn)行研究,為闡明OP的分子機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

GO與KEGG富集分析有助于更深入地認(rèn)識(shí)并識(shí)別出miR-125b-5p靶基因的功能和機(jī)制。對(duì)4種軟件預(yù)測(cè)到的102個(gè)靶基因進(jìn)行GO富集和KEGG分析,結(jié)果顯示miR-125b-5p靶向基因的BP主要在pre-microrna的處理、負(fù)調(diào)控冷誘導(dǎo)產(chǎn)熱及調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的程度等;pre-microRNAs(pre-miRNAs)是60～120個(gè)核苷酸(nt)的莖環(huán)結(jié)構(gòu),能夠被核糖核酸酶(ribonuclease,RNase)Ⅲ酶Dicer切割成短的約21 nt的雙鏈(ds)RNAs,該雙鏈RNAs可與microRNA效應(yīng)子Argonaute(Ago)結(jié)合,結(jié)合后去除1條RNA鏈,再由Ago-miRNA復(fù)合體通過翻譯抑制和mRNA降解抑制目標(biāo)基因的翻譯[19]。在冷誘導(dǎo)的棕色脂肪組織(brown adipose tissue,BAT)非戰(zhàn)栗產(chǎn)熱(non-shivering thermogenesis,NST)會(huì)激活相關(guān)的代謝效應(yīng),包括增加能量消耗、胰島素敏感性、脂肪分解和脂肪酸氧化,最終有助于控制肥胖和代謝性疾病存在的能量失衡和病理生理后果[20]。以上結(jié)果揭示,miR-125b-5p的靶基因可能主要是通過Ago-miRNA復(fù)合體抑制目標(biāo)基因的翻譯、調(diào)節(jié)冷誘導(dǎo)產(chǎn)熱的相關(guān)代謝效應(yīng)以及相關(guān)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的生長(zhǎng)最終促進(jìn)OP大鼠的骨量丟失。

在GO富集MF中,金屬氨基肽酶活性位居前列,該酶存在于所有類型的生物體中,可利用外源性蛋白質(zhì)作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和消除非功能性蛋白質(zhì),在胚胎發(fā)生、免疫反應(yīng)、血管生成、腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移等生理及病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[21]。泛素結(jié)合酶系統(tǒng)與幾種退行性疾病有關(guān),在C-X-C基序趨化因子配體6(C-X-C motif chemokine ligand 6,CXCL7)缺陷小鼠中進(jìn)行了磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析,結(jié)果顯示泛素蛋白連接酶 E3C (ubiquitin protein ligase E3C,UBE3C)磷酸化增加,CXCL7與后縱韌帶骨化密切相關(guān)[22]。這些表明miR-125b-5p的靶基因促進(jìn)OP大鼠骨丟失在分子功能上可能是通過調(diào)控金屬氨基肽酶活性及泛素結(jié)合酶等來進(jìn)行的。

KEGG富集分析結(jié)果顯示,腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system,RAS)在miR-125b-5p靶基因的KEGG分析中占主要作用。有研究表明,RAS在骨組織中局部存在,并且在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞上表達(dá),還可通過血管緊張素Ⅱ (angiotensinⅡ)受體發(fā)揮作用,對(duì)炎癥性骨病起到重要作用[23]。有研究表明,RAS 的激活誘導(dǎo)高周轉(zhuǎn)OP并加速骨吸收[24]。Li等[25]研究發(fā)現(xiàn),泛素特異性蛋白酶(ubiquitin-specific protease,USPs)通過促進(jìn)骨形成或拮抗骨吸收參與調(diào)節(jié)骨代謝,泛素特異性肽酶26(ubiquitin specific peptidase 26,USP26)通過降低293T細(xì)胞中泛素化進(jìn)而對(duì)骨代謝進(jìn)行調(diào)控。Yang等[26]發(fā)現(xiàn)泛素化和降解在保持破骨細(xì)胞的活性及骨吸收方面起著重要作用。以上結(jié)果表明,腎素-血管緊張素系統(tǒng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在調(diào)控骨代謝中起著重要作用,提示這些相關(guān)通路與miR-125b-5p調(diào)控OP大鼠骨量丟失的潛在機(jī)制密切相關(guān),可作為后續(xù)的研究提供思路。

綜上所述,miR-125b-5p能夠促進(jìn)OP大鼠的骨丟失,其潛在的機(jī)制可能是通過BAK1等相關(guān)mRNA相互作用,涉及腎素-血管緊張素系統(tǒng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等多種途徑從而為下一步研究OP的分子機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及理論依據(jù)。