王聽雨,毛冬梅,黃媛馨,姚旌*

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 疼痛科,貴州 貴陽 550000)

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是一種致殘甚至死亡的嚴(yán)重疾病,SCI引起的長(zhǎng)期感覺運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知及精神變化通常會(huì)使患者遭受巨大的痛苦[1]。中樞性疼痛(central pain,CP)作為SCI的常見并發(fā)癥,是一種神經(jīng)病理性疼痛,發(fā)病機(jī)制涉及神經(jīng)炎癥反應(yīng)、脊髓感覺神經(jīng)元過度活化及膠質(zhì)細(xì)胞活化等[2],但確切機(jī)制尚不清楚。多年來,臨床上主要采用止痛藥物治療CP,但目前可用的藥物對(duì)CP患者的緩解效果不佳,因此探索更有效的鎮(zhèn)痛方法具有重要意義。自噬是細(xì)胞的基本代謝過程,以溶酶體途徑將有缺陷的細(xì)胞器和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)消除[3]。不同動(dòng)物模型的研究表明,在神經(jīng)損傷后,受損神經(jīng)、脊髓甚至腦的自噬活性發(fā)生了變化[3]。近年來研究表明,SCI模型可以導(dǎo)致自噬流受阻[4]。粒細(xì)胞集落刺激因子、姜黃素等可以通過激活自噬來緩解 CP[5-6],表明調(diào)節(jié)自噬途徑是治療SCI的潛在治療靶點(diǎn)。星狀神經(jīng)節(jié)阻滯(stellate ganglion block,SGB)屬于一種臨床治療方法[7]。本課題組前期研究表明,SGB 可通過調(diào)控白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子-α等炎性因子,抑制創(chuàng)傷后家兔全身炎癥反應(yīng)綜合征的炎性反應(yīng),對(duì)減少痛敏效果明顯[8]。在巨自噬過程的開始,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的自噬效應(yīng)蛋白1和巨自噬過程的上游蛋白對(duì)脅迫信號(hào)通路做出反應(yīng),并啟動(dòng)吞噬細(xì)胞的形成;一些蛋白質(zhì),包括自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白輕鏈3(light chain 3,LC3)和家蠶隔離體蛋白1(sequestosome-1,p62),參與了自噬小體的形成[9]。自噬小體與溶酶體融合,導(dǎo)致自溶酶體的形成和進(jìn)一步的降解,故推測(cè)SGB治療在CP調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,其中一條可能的機(jī)制是SGB治療可以在損傷早期激活脊髓組織自噬,在抗炎和中樞敏化中發(fā)揮重要作用。因此,本研究擬采用大鼠SCI模型觀察SCI術(shù)后脊髓組織自噬指標(biāo)的變化,以及SGB治療后對(duì)其的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物來源 27只成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠,體質(zhì)量200～250 g。本研究已通過學(xué)校倫理委員會(huì)動(dòng)物倫理批準(zhǔn)(NO2201610),所有實(shí)驗(yàn)操作均符合動(dòng)物倫理要求,并按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用原則進(jìn)行。

1.1.2主要試劑和儀器 30%聚丙烯酰胺(polyacrylamide,PAM)、三羥甲基氨基甲烷、過硫酸銨、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)及聚山梨醇酯-20(Tween-20,北京Solarbio),四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine,TEMED;上海Alladin),蛋白marker(上海雅酶),蛋白酶抑制劑(美國sigma),聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜(美國Millipore),增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence,ECL;上海Tanon),水溶性復(fù)合物(bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)抗小鼠抗體及HRP抗兔抗體(上海碧云天),脫脂奶粉(美國BD),甲醇和HCl(南京化學(xué)試劑),甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體(成都Zen-bio);電泳儀和濕法轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad),TY-80R脫色搖床(金壇醫(yī)療儀器),5200化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)(上海Tanon),BCD-216型冰箱(青島海爾),DRP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海森信),YLS-6B智能熱板儀(北京眾實(shí)科技)。

1.2 研究方法

1.2.1動(dòng)物分組 27只大鼠隨機(jī)均分為假手術(shù)組(Sham 組,僅切斷T9～T11椎板并顯露硬脊膜、但不損傷硬脊膜)、SCI 組(行SCI)及SGB組(行SCI后予SGB),分別于術(shù)后第1天、第3天及第7天取大鼠脊髓樣本。

1.2.2CP模型的建立 采用SCI手術(shù)制備大鼠CP模型。SD大鼠用 2% 戊巴比妥鈉 40 mg/kg 腹腔注射麻醉(通過對(duì)有害刺激缺乏撤退反射和缺乏角膜眨眼反射來監(jiān)測(cè))后,確定 T10 部位,手術(shù)區(qū)域備皮,俯臥位固定,將T10 椎板及棘突用手術(shù)鉗摘除,顯露硬膜兩側(cè)緣。待手術(shù)區(qū)域止血完善后,用止血夾(標(biāo)定力恒定)鉗夾脊髓,持續(xù)1 min,松開止血夾,硬脊膜被鉗夾處出現(xiàn)鮮紅血腫標(biāo)志,常規(guī)止血、消毒、縫合傷口。手術(shù)全程嚴(yán)格遵循無菌原則。術(shù)后護(hù)理:按摩大鼠進(jìn)行人工排尿,2次/d,直至膀胱功能恢復(fù)(膀胱功能不能恢復(fù)的大鼠在麻醉下斷頸處理剔除入組)。CP模型造模成功的標(biāo)志:熱痛敏潛伏期縮短和術(shù)后疼痛行為學(xué)改變?nèi)缣弁闯潭鹊募又貋砼袛郈P的造模成功。

1.2.3SGB方法 SGB組大鼠SCI術(shù)后行全頸部備皮,碘伏消毒,于右側(cè)頸總動(dòng)脈分叉處背側(cè)面找到梭型的頸上神經(jīng)節(jié),斜向外下方約3 mm 處可見一個(gè)淡黃色團(tuán)塊,即為頸交感神經(jīng)干(右星狀神經(jīng)節(jié)),在近心端將其離斷,消毒、縫合傷口。造模成功的標(biāo)志:大鼠清醒后出現(xiàn)典型的霍納綜合征,如右側(cè)眼瞼持續(xù)下垂、瞳孔縮小及眼裂變窄等。

1.2.4行為學(xué)特征觀察 分別于術(shù)后第1天、第3天及第7天觀察各組大鼠的精神情況、皮毛光澤程度、體重、飲食情況、膀胱功能恢復(fù)情況;SCI造模后大鼠傷口愈合情況;術(shù)前和術(shù)后大鼠走路協(xié)調(diào)情況,是否拖足,是否有對(duì)其后肢和身體尾部皮膚修飾、搔抓、舔咬及自發(fā)嘶叫等過度自殘行為。其中,采用后肢行為測(cè)試評(píng)分量表(Basso,Beattie and Bresnahan loconmotor rating scale,BBB)評(píng)估各組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能,BBB評(píng)分范圍為0～21分,分值越高,表示后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)越好,至21分時(shí)即與正常動(dòng)物相當(dāng);采用Hargreavest法檢測(cè)各組大鼠熱痛敏潛伏期(paw withdrawl latery,PWL),從實(shí)驗(yàn)開始到出現(xiàn)縮足反應(yīng)的時(shí)間以評(píng)估痛閾,每只大鼠測(cè)定3次,間隔5 min/次,取3次的平均值。

1.2.5脊髓標(biāo)本制取 分別取“1.2.4”項(xiàng)下術(shù)后第1天、第3天及第7天時(shí)SCI、SGB組大鼠3只,術(shù)后第3天Sham組大鼠3只,腹腔注射2%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉,斷頭處死,分離脊柱旁肌肉組織及椎板,迅速取出L4、L5脊髓,液氮速凍放入-80 ℃冰箱保存。

1.2.6Western blot檢測(cè) 取“1.2.5”項(xiàng)下各組大鼠等量脊髓標(biāo)本,碾磨、離心,測(cè)定蛋白含量;采用SDS-PAGE電泳儀(Bio-Rad),蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜;抗LC3A/B抗體、抗p62抗體、抗GAPDH 抗體,4 ℃搖床孵育過夜;TBST沖洗10 min、3次,稀釋二抗,室溫孵育2 h,TBST沖洗10 min、3次,ECL顯色曝光。

1.2.7透射電鏡檢測(cè) 取“1.2.5”項(xiàng)下術(shù)后第3天時(shí)各組大鼠脊髓標(biāo)本,放入2.5%戊二醛溶液,4 ℃固定,改鋨酸固定,梯度酒精行脫水,包埋劑處理樣品獲得70～90 nm切片,染色15 min,透射電鏡下觀察自噬結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況和BBB評(píng)分

SCI后,各組大鼠蘇醒后雙下肢呈遲緩性癱瘓,皮毛顏色逐漸變黃且較前無光澤,體質(zhì)量增長(zhǎng)減慢或減輕,飲食減少,排尿出現(xiàn)障礙,傷口無裂開、化膿及感染等情況。BBB評(píng)分結(jié)果顯示(圖1),Sham組大鼠術(shù)BBB評(píng)分完全恢復(fù);與Sham組相比,SCI組大鼠BBB評(píng)分隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸改善,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);與SCI組相比,SGB組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分改善均優(yōu)于SCI組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

注：(1)與Sham組比較,P<0.001;與SCI組比較,(2)P<0.01,(3)P<0.001。

2.2 PWL

SCI組大鼠PWL從術(shù)后第1天開始升高,術(shù)后第 7 天最高;與Sham組相比,SCI組大鼠PWL降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);與SCI組相比,SGB組大鼠PWL升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見圖2。

注：(1)與Sham組比較,P<0.001;(2)與SCI組比較,P<0.001。

2.3 組織學(xué)特征

采用透射電鏡的方法觀察術(shù)后第3天大鼠脊髓自噬小體含量變化,結(jié)果顯示(圖3),相比Sham組,SCI組大鼠脊髓線粒體結(jié)構(gòu)部分完整,見空泡化,髓鞘板層可見結(jié)構(gòu)分離,自噬體可見;與SCI組相比,SGB組大鼠線粒體結(jié)構(gòu)部分完整、空泡化明顯可見大量自噬體,髓鞘板層結(jié)構(gòu)紊亂較多見。見圖3。

注：黑色箭頭為線粒體,紅色箭頭為髓鞘板層結(jié)構(gòu);紅色方框?yàn)樽允审w,綠色方框?yàn)榫€粒體空泡化,黃色方框?yàn)樗枨拾鍖臃蛛x。

2.4 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62蛋白表達(dá)

與Sham組比較,SCI組大鼠脊髓組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)于術(shù)后第1天迅速升高、第3天達(dá)最高值,且與術(shù)后第1、3天比較,術(shù)后第7天LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);與Sham組比較,SCI組大鼠脊髓組織中p62蛋白表達(dá)于術(shù)后第1、3及7天增加,第3天為最高峰(P<0.001);與SCI組相比,SGB組大鼠脊髓組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)于術(shù)后第1、3及7天明顯升高(P<0.001),SGB組p62蛋白表達(dá)于術(shù)后第1、3及7天明顯降低(P<0.05)。見圖4。

注：A、B為L(zhǎng)C3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白的Western blot 檢測(cè)結(jié)果和定量結(jié)果,C、D為p62蛋白的Western blot 檢測(cè)結(jié)果和定量結(jié)果;與Sham組比較,(1)P<0.005,(3)P<0.001;與SCI組比較,(2)P<0.001,(4)P<0.05。

3 討論

SCI是一種廣泛使用且得到充分證明的CP模型,用于研究神經(jīng)病理性疼痛的病理機(jī)制[10]。SCI后,脊髓神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞被激活,導(dǎo)致背角神經(jīng)元過度興奮,從而引起神經(jīng)元-神經(jīng)膠質(zhì)回路敏化。適應(yīng)不良的脊髓回路直接影響突觸興奮性,包括白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6及腫瘤壞死因子-α在內(nèi)的促炎細(xì)胞因子的積累,能夠激活小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞,導(dǎo)致涉及自由基和血管活性胺的繼發(fā)性細(xì)胞毒性反應(yīng),最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡,促使自噬啟動(dòng),而自噬流受到抑制,則導(dǎo)致異常疼痛綜合征的發(fā)生[1]。自噬是一種常見的細(xì)胞保護(hù)過程,可被多種細(xì)胞應(yīng)激刺激[3]。LC3是細(xì)胞自噬發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵分子,是細(xì)胞自噬發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在發(fā)生自噬的時(shí)候,在自噬體膜上,可溶性LC3Ⅰ會(huì)與自噬體膜上的磷脂酰乙醇胺相結(jié)合,從而轉(zhuǎn)變成LC3Ⅱ。LC3Ⅱ在自噬體形成過程中逐漸被降解和消除,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ與自噬體數(shù)量呈正相關(guān),通常被認(rèn)為是自噬體形成的標(biāo)志,可用于檢測(cè)自噬過程[11]。選擇性自噬體膜受體蛋白,又稱p62蛋白,在所有組織中均有表達(dá),廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體、自噬體及溶酶體,能識(shí)別錯(cuò)誤折疊蛋白和受損器官,被p62識(shí)別后,通過招募LC3Ⅱ與p62一起運(yùn)送到自噬和降解溶酶體中。因此,自噬溶酶體活動(dòng)的強(qiáng)度和自噬通量可以由p62、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ判斷。最近研究顯示,SCI后會(huì)觸發(fā)自啟動(dòng)而自噬流受阻[12]。Western blot結(jié)果顯示,在SCI后,與自噬相關(guān)的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的水平顯著增加[12]。許多使用不同動(dòng)物模型的研究表明,在神經(jīng)損傷后,受損的神經(jīng)軸突、雪旺細(xì)胞和背根神經(jīng)節(jié)中可以檢測(cè)到不同的自噬蛋白自噬活性的升高[13-15]。本研究中,SCI后脊髓組織內(nèi)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)上調(diào),出現(xiàn)少量自噬小體。在基礎(chǔ)狀態(tài)下,脊髓組織中幾乎檢測(cè)不到LC3Ⅱ。這些數(shù)據(jù)表明,在生理?xiàng)l件下,自噬活性通常很低,但SCI可以上調(diào)自噬活性。盡管SCI輕度地誘導(dǎo)了自噬,但CP仍然會(huì)啟動(dòng)和維持。故推測(cè),低水平的自噬不足以逆轉(zhuǎn)SCI大鼠的疼痛。

CP是一種神經(jīng)病理性疼痛,導(dǎo)致SCI后CP的原因很多,主要有神經(jīng)炎癥反應(yīng),脊髓感覺神經(jīng)元過度活躍,膠質(zhì)細(xì)胞活化,突觸傳遞異常,及下游調(diào)控系統(tǒng)紊亂,但其確切的發(fā)病機(jī)理尚不清楚。目前已有研究表明,參與中樞敏化的脊髓背角是神經(jīng)病理性疼痛形成的關(guān)鍵區(qū)域,周圍神經(jīng)損傷后脊髓背角中激活的促炎細(xì)胞因子釋放多種炎癥因子,增加傷害感受器的敏化,促進(jìn)神經(jīng)病理性疼痛的形成[16-17]。由于誘導(dǎo)自噬通量可能有利于SCI后的功能恢復(fù)[18],因此,上調(diào)自噬可以抑制疼痛行為[19-23]。在本研究中,進(jìn)一步探索了SGB是否調(diào)節(jié)大鼠SCI后的自噬途徑,結(jié)果顯示SGB可能通過激活自噬來緩解CP:選用透射電鏡、LC3、p62作為檢測(cè)自噬的主要指標(biāo),主要考慮到LC3、p62是自噬發(fā)生過程中的標(biāo)志蛋白,而自噬檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)之一是透射電鏡[24]。本研究結(jié)果顯示,SCI組在SCI造模后第1、3及7天時(shí)脊髓LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62表達(dá)增加,表明自噬現(xiàn)象會(huì)由SCI造成的損傷刺激誘發(fā),但p62的增加提示損傷抑制了自噬的降解,影響自噬流。這與之前的許多研究結(jié)果相似,如坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷模型能導(dǎo)致自噬流受阻[25];許多不同模型也會(huì)導(dǎo)致的神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)生自噬障礙[26-27]。經(jīng)SGB治療后的SCI大鼠在第3天時(shí)脊髓LC3II/LC3I明顯增加并大于第1和7天,p62降低,提示脊髓自噬增加,自噬流過程通暢;自噬小體在脊髓組織的表達(dá)與蛋白印跡結(jié)果一致。以上研究結(jié)果表明,SGB可能通過激活脊髓組織自噬來緩解CP,其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果表明,SCI可以引發(fā)大鼠神經(jīng)病理性疼痛的同時(shí),也可誘發(fā)脊髓自噬激活,但自噬流受阻;SGB可以降低大鼠痛覺超敏,同時(shí),也可促進(jìn)自噬流,加強(qiáng)脊髓的保護(hù)性自噬。

綜上所述,SGB是潛在的治療CP的有效方法,且可能通過促進(jìn)自噬發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。自噬在SCI造成的CP中發(fā)揮著重要作用,未來需要更深入探索SGB的作用機(jī)制。