李彩多,曾曄,石艷萍,張迎春,吳建偉,陳崢宏,王濤*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,貴州 貴陽 550025; 2.貴州省普通高等學(xué)校病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實驗室,貴州 貴陽 550025)

抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)又稱為抗微生物肽,是一種具有固有免疫功能的小分子多肽,一般含有12～100個氨基酸殘基,在原核生物和真核生物中廣泛存在,是生物固有免疫系統(tǒng)的重要組成成分,也是人體抵御病原生物感染的重要防線[1-5]。國內(nèi)外研究報道,AMPs不僅能夠高效地抑制真菌、細(xì)菌及病毒等病原微生物,還有抗寄生蟲、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)的功能,由于AMPs對病原微生物的作用范圍廣、來源豐富及不易使微生物產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn),因此具有新型抗菌藥物的開發(fā)潛力[1-6]。研究表明,AMPs有可能通過抑制真菌細(xì)胞壁的合成或破壞其完整性,從而導(dǎo)致真菌細(xì)胞的死亡[7-9]。有研究顯示,細(xì)胞膜是AMPs天然作用靶標(biāo),AMPs可通過使真菌細(xì)胞膜穩(wěn)定性降低和破壞膜結(jié)構(gòu)的方式,引起細(xì)胞內(nèi)容物外溢,導(dǎo)致真菌細(xì)胞死亡[10]。目前可以通過桶板模型、毯式模型及環(huán)孔模型來解釋AMPs的膜作用機(jī)制[11-15]。家蠅抗真菌肽-1A(Muscadomesticaantifungal peptide-1A,MAF-1A)是本課題組發(fā)現(xiàn)的家蠅幼蟲特有AMPs,前期研究已表明MAF-1A可通過破壞細(xì)胞壁、細(xì)胞膜發(fā)揮抗白念珠菌(Candidaalbicans,C.albicans)作用[16];MAF-1A突變體-22S3(mutant-22S3 of MAF-1A,Mt-22S3)是本課題組通過對MAF-1A 進(jìn)行序列優(yōu)化、改造,獲得一個新型AMPs分子,前期研究顯示Mt-22S3對C.albicans具有較強(qiáng)的抑殺活性[17],但抗C.albicans作用與細(xì)胞壁、細(xì)胞膜破壞的相關(guān)性尚不清楚。本研究旨在探究新型AMPsMt-22S3對C.albicans細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的作用機(jī)制,為AMPs的研究與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)及實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1AMPsMt-22S3 委托生工生物工程(上海)股份有限公司采用9-芴甲氧羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl,FMOC)固相法制備多肽(批次為P27963),并經(jīng)過反相高效液相色譜純化譜、液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行測試,多肽純度為98%以上。

1.1.2實驗菌株C.albicansATCC10231由貴州省普通高等學(xué)校病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實驗室提供。

1.1.3主要試劑及儀器 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(sabouraud dextrose agar,SDA),沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(sabouraud dextrose broth,SDB;杭州百思),碘化丙啶(propidium iodide,PI;北京Solarbio)、2.5% 戊二醛(北京Solarbio),RNA提取試劑(大連TaKaRa),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京康為世紀(jì))、熒光定量試劑盒(南京諾唯贊);掃描電鏡(美國FEI),透射電鏡(日本JEOL),正置熒光顯微鏡(日本尼康ci-e-ds-r11),超微量紫外分光光度計(美國ND2000),實時熒光定量PCR儀(美國STEPONELIUS)。

1.2 研究方法

1.2.1菌株培養(yǎng)及菌懸液配制 采用分區(qū)劃線法將-80 ℃凍存的C.albicans接種于SDA平板中,于37 ℃的溫箱中培養(yǎng);無菌操作下挑取SDA培養(yǎng)基上對數(shù)生長期的C.albicans菌落置于SDB中,以細(xì)胞計數(shù)法配制菌懸液。

1.2.2Mt-22S3抗C.albicans活性檢測 參照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推薦的M27-A4方法[18],以終濃度為(31.3～500.0) mg/L的Mt-22S3和MAF-1A分別作用于C.albicans,放置于37 ℃溫箱培養(yǎng)24 h。采用微量肉湯稀釋法和平板計數(shù)法檢測Mt-22S3和MAF-1A對C.albicans最低抑菌濃度(minimal inhibit concentration,MIC)和最低殺菌濃度(minimal fungicidal concentration,MFC)。以肉眼觀察無菌生長的孔所對應(yīng)的濃度為最低抑菌濃度;將 MIC試驗中判定無菌生長的培養(yǎng)液接種在 SDA平板上,在37 ℃下培養(yǎng)24 h,將無菌生長所對應(yīng)的最低藥物濃度作為最低殺菌濃度。

1.2.3掃描電鏡觀察Mt-22S3作用后C.albicans形態(tài)觀察 取對數(shù)生長期的C.albicans菌懸液,與終濃度為0、125、250 及 500 mg/L Mt-22S3作用,置于37 ℃溫箱培養(yǎng)12 h,4 000 r/min離心5 min,獲取C.albicans菌體,經(jīng)無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS;pH=7.4)洗滌3次,棄上清液,保留菌體沉淀物;沉淀物中添加2.5% 戊二醛1 mL,置于4 ℃環(huán)境中固定過夜;PBS緩沖液(pH=7.4)沖洗2次,棄上清,50%、70% 及100%乙醇依次脫水5 min;載玻片上涂覆沉淀,干燥,使用離子濺射儀噴金處理,并使用掃描電鏡上機(jī)檢測C.albicans形態(tài)變化。

1.2.4透射電鏡觀察Mt-22S3作用后C.albicans形態(tài)觀察 取對數(shù)生長期的C.albicans菌懸液,與終濃度為0、125、250 及 500 mg/L Mt-22S3作用,置于37 ℃溫箱培養(yǎng)12 h,4 000 r/min離心5 min,獲取C.albicans菌體,PBS緩沖液(pH= 7.4)洗滌3次,棄上清,保留菌體沉淀物;樣品經(jīng)3%戊二醛預(yù)固定,1%四氧化鋨再固定,丙酮按30%、50%、70%、90%、100%的梯度逐級脫水,采用環(huán)氧樹脂-812(epikote 812,Ep812)包埋,使用鉆石刀制作超薄切片,以醋酸鈾、枸櫞酸鉛進(jìn)行染色,使用透射電鏡觀察C.albicans內(nèi)部細(xì)胞壁、細(xì)胞膜形態(tài)的變化。

1.2.5Mt-22S3對C.albicans細(xì)胞膜通透性的作用 取對數(shù)生長期的C.albicans菌懸液,與終濃度為0、125、250 及 500 mg/L Mt-22S3作用,置于37 ℃溫箱培養(yǎng)12 h,4 000 r/min離心5 min,獲取C.albicans菌體,PBS緩沖液(pH=7.4)洗滌3次,棄上清,保留菌體沉淀物;各組加碘化丙啶(propidium iodide,PI)溶液,使終濃度為10 mg/L,混勻,置于37 ℃培養(yǎng)箱避光染色5 min;無菌PBS緩沖液(pH=7.4)洗滌3次,重懸菌懸液;使用正置熒光顯微鏡于535 nm激發(fā)光、615 nm發(fā)射光下觀察細(xì)胞膜通透性的變化。

1.2.6Mt-22S3對C.albicans細(xì)胞壁及細(xì)胞膜麥角甾醇合成相關(guān)基因擴(kuò)增引物的合成 參照文獻(xiàn)[16-17]中的內(nèi)參基因[肌動蛋白1基因(actin 1,ACT1)],細(xì)胞壁合成相關(guān)基因[幾丁質(zhì)合成酶基因1(chitin synthase gene 1,CHS1)、幾丁質(zhì)合成酶基因2(chitin synthase gene 2,CHS2)、幾丁質(zhì)合成酶基因3(chitin synthase gene 3,CHS3)、β-葡聚糖合成相關(guān)蛋白KRE1基因 (beta-glucan synthesis-associated protein kre1 gene,KRE1)、β-葡聚糖合成相關(guān)蛋白KRE6基因(beta-glucan synthesis-associated protein kre6 gene,KRE6)及甘露糖蛋白65基因(65-kD mannoprotein gene,MP65)]和細(xì)胞膜麥角甾醇合成相關(guān)基因[角鯊烯環(huán)氧化酶基因(squalene monooxygenase gene,ERG1)、C-22甾醇去飽和酶基因(C-22 sterol desaturase gene,ERG5)、甾醇24-C-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(sterol 24-C-methyltransferase gene,ERG6)及5-甲基四氫蝶酰基三谷氨酸-高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因 (5-methyltetrahydropteroyltriglutamate-homocysteine S-methyltransferase gene,MET6)]的引物序列,用美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)數(shù)據(jù)庫對引物序列進(jìn)行比對、驗證后,送生工生物工程(上海)有限公司合成,引物詳見表1。

表1 C. albicans細(xì)胞壁、細(xì)胞膜合成相關(guān)基因的qPCR反應(yīng)引物序列

1.2.7Mt-22S3對C.albicans細(xì)胞壁及細(xì)胞膜麥角甾醇合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平影響的檢測 與終濃度為0、250 mg/L Mt-22S3作用C.albicans24 h,以終濃度為0 mg/L Mt-22S3組為對照組,終濃度為250 mg/L Mt-22S3組為實驗組。根據(jù)試劑盒方法提取C.albicans的總RNA,以ND2000測定其總量和純度,取260 nm和280 nm下光密度(optical densit,OD)的比值于1.80～2.20內(nèi)的 RNA溶液合成互補(bǔ)DNA(complementary DNA,cDNA);參照熒光定量試劑盒說明書在熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction,qPCR)儀上進(jìn)行qPCR反應(yīng),設(shè)置反應(yīng)程序為:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、40個循環(huán)。實驗設(shè)置3個重復(fù),C.albicans細(xì)胞壁合成相關(guān)基因(CHS1、CHS2、CHS3、KRE1、KRE6及MP65)及細(xì)胞膜麥角甾醇合成相關(guān)基因(ERG1、ERG6、ERG5及MET6)信使RNA(messenger RNA,mRNA)水平的相對表達(dá)量依據(jù)公式為2-ΔΔCt的相對定量法進(jìn)行計算,以log2(2-ΔΔCt)為縱坐標(biāo)、作用時間為橫坐標(biāo)作圖。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Mt-22S3抗C. albicans的活性

抗真菌活性檢測結(jié)果顯示,Mt-22S3抗C.albicansATCC10231的MIC值為125 mg/L,MFC值為250 mg/L;模板肽MAF-1A的MIC值為 625 mg/L,MFC值為1 250 mg/L。

2.2 掃描電鏡下C. albicans的細(xì)胞形態(tài)

經(jīng)過0 mg/L Mt-22S3處理后,可見菌細(xì)胞呈現(xiàn)健康的橢圓形,菌細(xì)胞密集且呈現(xiàn)條狀,表面光滑;經(jīng)過125 mg/L的Mt-22S3處理后,大部分菌細(xì)胞表面仍然光滑飽滿,有少數(shù)菌細(xì)胞出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象;經(jīng)過250 mg/L的Mt-22S3處理后,大部分菌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生不規(guī)則改變,表面出現(xiàn)皺縮,菌細(xì)胞數(shù)量明顯減少,且菌細(xì)胞表面產(chǎn)生少量氣泡狀改變;經(jīng)過500 mg/L的Mt-22S3處理后,菌體形態(tài)均發(fā)生不規(guī)則變化,菌細(xì)胞皺縮明顯,菌細(xì)胞形成數(shù)量大量減少,菌細(xì)胞表面出現(xiàn)大量氣泡狀結(jié)構(gòu)見圖1。

注：白色箭頭代表細(xì)胞出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象。

2.3 透射電鏡下C. albicans細(xì)胞形態(tài)

0 mg/L Mt-22S3組菌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,細(xì)胞壁厚度均一,完整光滑,細(xì)胞膜連續(xù)清晰,胞漿電子密度均勻,細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常;125 mg/L Mt-22S3組菌細(xì)胞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較完整,細(xì)胞膜和細(xì)胞壁分離,細(xì)胞膜不連續(xù),且胞漿內(nèi)容物丟失;250 mg/L Mt-22S3組菌細(xì)胞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較完整,細(xì)胞膜和細(xì)胞壁分離,細(xì)胞膜松弛,細(xì)胞膜上出現(xiàn)孔洞,胞漿內(nèi)容物丟失,電子密度不均勻;500 mg/L Mt-22S3組菌細(xì)胞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)仍較完整,細(xì)胞膜和細(xì)胞壁分離,細(xì)胞膜碎裂,胞漿內(nèi)容物大量丟失,甚至僅剩細(xì)胞壁。見圖2。

注：黑色箭頭指示細(xì)胞壁;白色箭頭指示細(xì)胞膜出現(xiàn)不連續(xù)現(xiàn)象。

2.4 細(xì)胞膜通透性

125、250、500 mg/L Mt-22S3作用C.albicans后,被熒光染料PI染上紅色熒光的C.albicans細(xì)胞與0 mg/L Mt-22S3組相比較明顯增多,且隨著Mt-22S3濃度的升高,產(chǎn)生紅色熒光的C.albicans細(xì)胞數(shù)逐漸增加(圖3)。

圖3 不同濃度Mt-22S3組對C. albicans細(xì)胞膜通透性的影響(PI染色,×1 000)

2.5 細(xì)胞壁多糖合成相關(guān)基因mRNA表達(dá)

實驗組C.albicans細(xì)胞壁CHS1(t=2.02,P=0.355)、CHS2(t=1.87,P=0.439)、CHS3(t=2.69,P=0.123)、KRE1(t=2.00,P=0.366)、KRE6(t=2.55,P=0.996)及MP65(t=2.11,P=0.362)的mRNA相對表達(dá)量與對照組比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,圖4)。

圖4 對照組和實驗組C. albicans細(xì)胞壁合成相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

2.6 細(xì)胞膜麥角甾醇相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

實驗組C.albicans細(xì)胞膜麥角甾醇有關(guān)基因ERG1(t=28.26,P<0.000 1)、ERG6(t=21.03,P<0.000 1)、ERG5(t=25.16,P<0.000 1)和MET6(t=26.10,P<0.000 1)mRNA的相應(yīng)表達(dá)量較對照組(0 mg/L Mt-22S3組)明顯降低,其中以ERG1表達(dá)量降低最為明顯(圖5)。

注：(1)與對照組比較,P<0.000 1。

3 討論

目前,研究和開發(fā)安全、高效的新型抗真菌藥物具有十分重要的意義[19]。C.albicans是人類常見的一種機(jī)會致病性真菌,正?？梢远ㄖ苍跈C(jī)體皮膚和黏膜,當(dāng)機(jī)體內(nèi)菌群失衡以及免疫系統(tǒng)功能下降等情況出現(xiàn)時,C.albicans不僅可引起體表粘膜感染,而且可侵入口腔、胃腸道、陰部等器官,甚至可以侵入血液循環(huán)而導(dǎo)致多組織器官的感染[20]。

近年來,C.albicans的耐藥性日趨嚴(yán)重,尋找新的抗菌藥物成為必然需求[21]。AMPs因其抗菌活性高、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn),從而成為重要的新型抗菌藥物候選物之一[22]。Mt-22S3是本課題組通過對模板肽MAF-1A構(gòu)效優(yōu)化后所獲得一個新型AMPs分子,本研究結(jié)果顯示,Mt-22S3對C.albicans的 MIC、MFC值分別為125 mg/L和250 mg/L,表明Mt-22S3抗C.albicans活性優(yōu)于模板肽MAF-1A(MIC為 625 mg/L,MFC為1 250 mg/L),提示Mt-22S3具有新型抗真菌藥物的開發(fā)潛力。

細(xì)胞壁除了維持固有形態(tài)的作用外,還可幫助菌細(xì)胞抵抗外界物理、化學(xué)及生物等多種因素的影響,是保護(hù)真菌細(xì)胞的重要屏障[23]。真菌細(xì)胞壁主要由甘露糖蛋白、β-葡聚糖和幾丁質(zhì)等化學(xué)成分組成,有研究發(fā)現(xiàn),某些AMPs能通過與真菌細(xì)胞壁多糖成分作用,破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)來發(fā)揮其抗菌作用[7-9]。本研究通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn),C.albicans經(jīng)不同濃度的Mt-22S3作用后,其細(xì)胞壁的完整性未見明顯改變,表明Mt-22S3不能直接破壞C.albicans細(xì)胞壁的完整性。文獻(xiàn)報道,CHS1、CHS2、CHS3是C.albicans幾丁質(zhì)合酶的編碼基因[24-25];KRE1、KRE6的編碼產(chǎn)物參與β-葡聚糖的生物合成[26];MP65則編碼甘露糖蛋白的合成[27]。通過C.albicans細(xì)胞壁多糖合成相關(guān)基因的mRNA表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn),在Mt-22S3作用前后,CHS1、CHS2、CHS3、KRE1、KRE6及MP65的轉(zhuǎn)錄水平無明顯變化(P>0.05),表明Mt-22S3不能通過阻礙細(xì)胞壁多糖合成發(fā)揮抗菌活性,提示對細(xì)胞壁的破壞可能不是Mt-22S3抗C.albicans的主要作用機(jī)制。

真菌細(xì)胞的正常生長繁殖和新陳代謝,離不開細(xì)胞膜這一至關(guān)重要的生理結(jié)構(gòu)。目前普遍認(rèn)為,AMPs可以通過破壞真菌細(xì)胞膜的完整性而導(dǎo)致真菌細(xì)胞死亡。Song等[28]報道,一種新的蝎毒AMPs類似物GK-19可以通過破壞真菌的細(xì)胞膜,使真菌細(xì)胞膜出現(xiàn)孔洞、破裂,最終導(dǎo)致真菌細(xì)胞的死亡。PI是一種核酸染色劑,其作用機(jī)制為進(jìn)入真菌細(xì)胞的細(xì)胞壁,而不能進(jìn)入其細(xì)胞膜內(nèi)部。但當(dāng)細(xì)胞膜遭受損傷時,其通透性會顯著提高,從而使得PI穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),特異性結(jié)合核酸分子,使菌細(xì)胞出現(xiàn)紅色熒光,因此,可以通過PI實驗反映細(xì)胞膜的通透性與完整性[16]。本研究結(jié)果顯示,Mt-22S3作用后的C.albicans細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)紅色熒光,并且隨著Mt-22S3濃度的增加,發(fā)出紅色熒光的C.albicans細(xì)胞數(shù)量逐漸增加,說明PI染料可以穿透經(jīng)Mt-22S3作用后的C.albicans細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi);同時,透射電鏡結(jié)果顯示,經(jīng)過Mt-22S3作用后,C.albicans細(xì)胞膜與細(xì)胞壁發(fā)生分離,并且細(xì)胞膜出現(xiàn)松弛、不連續(xù)、產(chǎn)生孔洞、膜碎裂等細(xì)胞改變,以上結(jié)果表明Mt-22S3能夠破壞C.albicans細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性,增加細(xì)胞膜的通透性。

麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜的重要化學(xué)組分,可以保持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性、流動性與細(xì)胞膜結(jié)合酶的活性,參與菌細(xì)胞物質(zhì)交換、細(xì)胞分裂等多項重要的生命活動[29-30]。ERG1、ERG5、ERG6及MET6等基因與麥角甾醇合成密切相關(guān),它們是麥角甾醇生物合成途徑的重要調(diào)控基因,其中ERG1所編碼的角鯊烯環(huán)氧化酶基因為細(xì)胞膜麥角甾醇合成途徑中的限速酶,ERG6、ERG5、MET6分別編碼的甾醇24-C-甲基轉(zhuǎn)移酶基因、C-22甾醇去飽和酶基因和5-甲基四氫蝶?；劝彼?高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)?xì)胞膜麥角甾醇的合成具有調(diào)節(jié)作用[30]。本研究表明,C.albicans經(jīng)Mt-22S3作用后,其細(xì)胞膜麥角甾醇合成相關(guān)基因ERG1、ERG5、ERG6及MET6 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.0001),提示Mt-22S3能抑制C.albicans細(xì)胞膜麥角甾醇合成過程,表明Mt-22S3能夠通過抑制相關(guān)基因mRNA的表達(dá),使C.albicans細(xì)胞膜的穩(wěn)定性破壞,從而發(fā)揮其抗C.albicans作用。

綜上所述,AMPsMt-22S3可以通過直接破壞細(xì)胞膜以及阻礙細(xì)胞膜麥角甾醇的合成來發(fā)揮其抗C.albicans作用,但細(xì)胞壁可能不是Mt-22S3抗C.albicans的主要作用部位。