趙瑄,甘婷,王雨虹,巨佳曦,朱貴明*

(貴州醫(yī)科大學(xué) 生物與工程學(xué)院,貴州 貴陽 550025; 貴州醫(yī)科大學(xué) 健康醫(yī)藥現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)學(xué)院,貴州 貴陽 550025)

多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)具有多種生理、藥理以及營養(yǎng)學(xué)的價值,是人體不可或缺的營養(yǎng)成分[1-2]。花生四烯酸 (arachidonic acid,ARA)是人體組織中水平最多的PUFAs,體內(nèi)游離的ARA是從細胞膜上的膜磷脂中經(jīng)過磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)的催化分解而釋放出來,在環(huán)氧合酶-1(cyclooxygenase-1,COX-1)和環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)的催化作用下形成內(nèi)過氧化物前列腺素G2(prostaglandin G2,PGG2)和前列腺素H2(prostaglandin H2,PGH2),但二者性質(zhì)不穩(wěn)定,進而在前列腺素E合酶(prostaglandin E synthetase,PTGES)的催化下生成一系列的前列腺素(prostaglandins,PGs)[3-4]。前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)的生物合成途徑中有3個重要的酶參與,分別是PLA2、環(huán)氧合酶及PTGES[5-7]。PTGES是PGE2合成途徑中重要的末端限速酶,現(xiàn)已明確的PTGES主要有胞質(zhì)型PTGES (cytoplasmic PTGES,cPTGES)、膜結(jié)合型PTGES(membrane-bonded PTGES,mPTGES)[8]。cPTGES通過與COX-1偶聯(lián),介導(dǎo)生理狀態(tài)下PGE2的產(chǎn)生,多表達于各種細胞中;mPTGES1通常與COX-2偶聯(lián),參與疼痛、炎癥和腫瘤等病理生理過程;mPTGES2與COX-1/COX-2都可以偶聯(lián),且功能上不受病理性生理因素的影響[9-10]。PUFAs與PGE2對人體機能都有一定程度的調(diào)節(jié),在預(yù)防和治療心腦血管、腫瘤、炎癥等疾病方面發(fā)揮著重要的作用[11-12]。因此,本研究利用能夠?qū)W米伽-6PUFAs(omega-6 PUFAs,ω-6PUFAs或n-6 PUFAs)轉(zhuǎn)化為歐米伽-3PUFAs(omega-3 PUFAs,ω-3PUFAs或n-3 PUFAs)的Δ15脂肪酸去飽和酶(Δ15 fatty acid desaturase,Δ15 Des)轉(zhuǎn)基因小鼠,探究PUFAs對小鼠體內(nèi)PGE2水平的影響,為闡明PUFAs與PGE2在Δ15 Des轉(zhuǎn)基因小鼠生理功能之間的聯(lián)系提供基礎(chǔ)理論研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物來源 4周齡SPF級C57BL/6野生型(wild type,WT)雄性小鼠5只,實驗室前期使用PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)構(gòu)建表達Δ15 Des活性的轉(zhuǎn)基因4周齡雄性小鼠(即Δ15 Des轉(zhuǎn)基因小鼠)5只,體質(zhì)量為18～22 g,飼養(yǎng)于學(xué)校實驗動物中心[SYXK(黔)2018-0001],飼養(yǎng)條件為平均溫度23 ℃,相對濕度70%,光照12 h。

1.1.2主要儀器及試劑 HP5890氣相色譜儀(昆山塞特科學(xué)儀器有限公司),定制小鼠飼料(6%ARA),動物組織總RNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司),小鼠PGE2酶聯(lián)免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒[酶聯(lián)生物科技(上海)有限公司]。

1.2 研究方法

1.2.1實驗分組和體質(zhì)量測量 C57BL/6 WT小鼠為對照組(n=5,WT組),Δ15 Des轉(zhuǎn)基因小鼠為實驗組(n=5,TG組),統(tǒng)一飼喂含6% ARA的定制飼料,飼喂8周,每周同時間測量并記錄2組小鼠體質(zhì)量的變化。

1.2.2取樣 取“1.2.1”項下2組小鼠每周檢測體質(zhì)量后,采用麻醉法處死小鼠,在冰上迅速分離小鼠完整的肝臟組織、睪丸組織及腓腸肌組織,分析天平稱重記錄后,將組織凍存于-80 ℃ 用于后續(xù)實驗。

1.2.3氣相色譜(gas chromatography,GC)檢測各組織中總脂肪酸的組成及水平 取“1.2.2”項下2組小鼠的肝臟、肌肉、睪丸組織各200 mg,充分研磨后置于反應(yīng)瓶,采用三氟化硼/甲醇(boron trifluoride/methyl alcohol,CH3OH/BF3)法提取上述組織的總脂肪酸,利用氣相色譜儀分析各組織中脂肪酸的組成及水平。氣相色譜分析條件:使用的分析儀器為HP5890氣相色譜儀,色譜柱為Omegawax 250氣象色譜毛細管柱,檢測器為火焰離子化檢測器(flame ionization detector,FID),柱溫為200 ℃,進樣器溫度為260 ℃,檢測器溫度為280 ℃;升溫條件按照程序運行,初始爐溫為200 ℃,以1.5 ℃/min升溫至260 ℃,載氣為氮氣(99.999%),保持30 min后等待儀器運行平穩(wěn)后進樣;進樣量為1 μL,樣品與標(biāo)準(zhǔn)品(PUFA no.3)在同一根色譜柱上用相同色譜條件進行分析。使用N2000色譜數(shù)據(jù)工作站采集色譜圖圖像處理。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法檢測PGE2的水平 取“1.2.2”項下2組小鼠的肝臟、肌肉及睪丸組織20 mg,按照質(zhì)量(mg)∶體積(μL)為1∶9的比例加9倍體積pH7.4磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS),勻漿器充分勻漿;2 000～3 000 r/min離心20 min,收集上清,分裝后1份待檢測,其余冷凍備用;酶標(biāo)儀在450 nm的波長檢測PGE2的吸光度;實驗過程中嚴格按照小鼠PGE2ELISA試劑盒說明書操作。

1.2.5實時熒光定量PCR(real time quantitative,RT-qPCR)檢測PTGES1和PTGES2的表達 取“1.2.2”項下2組小鼠肝臟、肌肉及睪丸組織,按照試劑盒操作步驟進行總RNA的提取,采用NanoDropTMOne/OneC超微量紫外分光光度計測定總RNA的質(zhì)量和濃度,將RNA溶液分裝存儲于-80 ℃?zhèn)溆?。將總RNA反轉(zhuǎn)錄成互補DNA(complementary DNA,cDNA),定量到1 μg,后續(xù)用于RT-qPCR檢測;反應(yīng)體系為cDNA樣品1 μL,上下游引物各0.4 μL,TB Green 5 μL,超純(diethyl pyrocarbonate,DEPC)水3.2 μL;反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 30 s,變性95 ℃ 5 s、退火60 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 30 s、40個循環(huán);在儀器上測出各個樣品的循環(huán)閾值(cycle threshold,Ct)后,根據(jù)2-ΔΔCt計算PTGES1、PTGES2的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量

第1～8周,2組小鼠體質(zhì)量均在增長,其中第1～3周時增長迅速,第4～8周時增長趨于平穩(wěn),但2組小鼠體質(zhì)量比較、差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,圖1)。

注：WT組和TG組小鼠體質(zhì)量的變化

2.2 脂肪酸的組成及水平

肝臟、肌肉及睪丸組織中脂肪酸組成及水平的GC分析結(jié)果顯示(圖2、3及4),WT組小鼠各組織中PUFAs主要是n-6 PUFAs,n-3 PUFAs水平較低;與WT組相比,TG組小鼠肝臟、肌肉組織中ARA(20∶4n-6)的水平降低,二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA; 20∶5n-3)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA; 22∶6n-3)的富集量升高(P<0.05或P<0.01);TG組小鼠睪丸組織中亞油酸(linoleic acid,LA; 18∶2n-6)的水平明顯升高(P<0.01),ARA與二十二碳四烯酸(docosatetraenoic acid,DTA; 22∶4n-6)的富集量明顯降低(P<0.01),EPA、DHA的富集量升高(P<0.05)。上述結(jié)果表明Δ15 Des轉(zhuǎn)基因小鼠已成功將體內(nèi)的ARA轉(zhuǎn)化為EPA,且進一步轉(zhuǎn)化為長鏈的DHA。

注：A為WT組,B為TG組,C為脂肪酸的定量結(jié)果;與同脂肪酸WT組比較,(1)P<0.01,(2)P<0.05。

注：A為WT組,B為TG組,C為脂肪酸的定量結(jié)果;與同脂肪酸WT組比較,(1)P<0.01,(2)P<0.05。

注：A為WT組,B為TG組,C為脂肪酸的定量結(jié)果;與同脂肪酸WT組比較,(1)P<0.01,(2)P<0.05。

2.3 PGE2的水平

采用ELISA檢測小鼠肝臟、肌肉及睪丸組織中PGE2的水平,結(jié)果表明(圖5),與WT組相比,TG組小鼠肌肉、睪丸組織中PGE2的水平降低(P<0.05或P<0.01),肝臟組織中PGE2的水平有一定程度的下降、差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

注：與同組織WT組比較,(1)P<0.01,(2)P<0.05。

2.4 PTGES1和PTGES2 mRNA的表達

RT-qPCR結(jié)果顯示(圖6),TG組小鼠肝臟組織與睪丸組織中PTGES1、PTGES2 mRNA表達下調(diào)(P<0.05或P<0.01);TG組小鼠肌肉組織中PTGES1、PTGES2 mRNA表達與WT組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

注：與同組織WT組同指標(biāo)比較,(1)P<0.001,(2)P<0.05。

3 討論

PUFAs可分為n-3、n-6、n-7及n-9等系列,其中n-3 PUFAs和n-6 PUFAs在調(diào)節(jié)機體的生命活動中有重要作用,在生理學(xué)功能上起相互協(xié)同或相互拮抗作用,富含n-6 PUFAs或缺少n-3 PUFAs都會對機體造成不良影響[13-14]。本研究所用的Δ15 Des轉(zhuǎn)基因小鼠自身可以將n-6 PUFAs轉(zhuǎn)化為n-3 PUFAs,從而使轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的組織和器官中n-3 PUFAs的水平增多,使Δ15 Des轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)n-6 PUFAs/n-3 PUFAs的比值降低,這一相似結(jié)論在其他研究中也得到了驗證[15]。本研究中,與WT組小鼠相比,TG組小鼠肝臟、肌肉和睪丸組織中ARA水平減少,DHA水平增多,n-3 PUFAs富集量明顯升高。

ARA是PGE2的前體物質(zhì),ARA水平減少極大可能會使得其脂質(zhì)衍生物PGE2合成降低[16-18]。ARA在體內(nèi)的代謝物包括PGE2、血栓素(thromboxane,TX)A2(TXA2)和白三烯(leukotriene,LT)B4(LTB4)等,肝臟是這些代謝物降解及消除的主要器官。已有體外實驗表明,PGE2、PGD2和LTC4可結(jié)合到鼠肝細胞表面而被迅速降解代謝[19];TXA2和6-酮前列腺素F1α(6-keto-prostaglandin F1α,6-keto-PGF1α)也能結(jié)合到肝細胞表面,但降解速度較慢,提示肝細胞膜存在區(qū)別有活性與非活性PGs的結(jié)合部位[20]。也有研究表明,PGE2發(fā)揮其生物學(xué)活性需要與相應(yīng)的跨膜G蛋白耦聯(lián)受體PTGER1-4結(jié)合[21-22]。關(guān)于PGE2及其受體的化學(xué)結(jié)構(gòu)、功能方面已有大量文獻報道,有關(guān)Δ15 Des轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)肝臟、肌肉和睪丸組織中PGE2的合成代謝方面資料仍較少。本研究中,相較于WT組小鼠,TG組小鼠肝臟組織中PGE2的水平無明顯變化,在肌肉與睪丸組織中PGE2的水平明顯降低。

本研究進一步檢測PTGES1與PTGES2在小鼠肝臟、肌肉和睪丸組織中的相對表達,以此了解PUFAs組成比值的變化對上述組織中PGE2水平變化的調(diào)節(jié)方式。前列腺素是一種局部性激素,在機體的許多組織內(nèi)都可以合成,PGE2是ARA的衍生物,在其相關(guān)酶的作用下迅速合成,一般不儲備于組織內(nèi),在某個組織內(nèi)合成就僅作用于該組織[23]。本研究的相關(guān)分析顯示,與WT組小鼠相比,TG組小鼠肝臟組織與睪丸組織中PTGES1、PTGES2的表達明顯下降,在肌肉組織中則有下調(diào)的趨勢,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。以上結(jié)果表明,Δ15 Des轉(zhuǎn)基因小鼠各組織內(nèi)PTGES1、PTGES2表達下降會對PGE2的合成產(chǎn)生一定的影響。

綜上所述,PUFAs可能是通過調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)ARA的水平而降低PGE2的合成,該調(diào)節(jié)方式可能與PTGES1/PGE2/PTGERs通路有關(guān),但不同組織中的分子調(diào)節(jié)機制尚需深入研究。