楊欣宇,袁佳佳,朱于鵬,傅 琴,莫開菊*

(1.湖北民族大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院,湖北 恩施 445000;2.恩施硒圣植物科技有限公司,湖北 恩施 445000)

近幾十年來,受西方國家飲食和生活方式的影響,全球范圍內(nèi)尤其是西方國家中飲食性肥胖的人數(shù)逐步攀升[1]。其中由不健康飲食(如高脂、高糖、低纖維)導(dǎo)致的肥胖尤其值得重視,高脂飲食不僅會導(dǎo)致體重超重,更可能會引起機體脂質(zhì)代謝紊亂,從而引發(fā)高脂血癥和糖尿病,對軀體健康造成巨大影響[2]。

硒是一種重要的微量營養(yǎng)素,對于人體健康和生存至關(guān)重要。研究表明,硒在預(yù)防肥胖[3]和調(diào)節(jié)血糖[4-5]方面起重要作用,硒蛋白可能是治療2型糖尿病以及動脈粥樣硬化的新靶點[6-7]。富硒小球藻是一種單細胞綠藻,營養(yǎng)豐富,具有熱量低、蛋白高等特點,且培養(yǎng)不需要占用大片耕地,因此在開發(fā)綠色添加劑、功能性食品、保健食品等方面具有較大的潛力[8]。Gómez-Jacinto等[9]利用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry,HPLC-ICP-MS)對富硒小球藻體內(nèi)外的硒代謝物和硒蛋白形態(tài)進行研究。結(jié)果表明,添加富硒小球藻做飼料的小白鼠比單純喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料的小白鼠血清中的硒含量和硒蛋白含量均有升高。李茜等[10]針對現(xiàn)代人多吃少動、高血脂患者日益增多的情況,對富硒螺旋藻的作用進行驗證,結(jié)果表明使用富硒螺旋藻喂養(yǎng)的小鼠血脂水平下降,同時免疫力和抗癌能力均有提高。因此,富硒小球藻兼具硒與小球藻的營養(yǎng)保健功能,是值得推廣的富硒原料。

一些學(xué)者已經(jīng)對硒劑量與肥胖、糖尿病之間的關(guān)系進行了研究。Li等[3]給小鼠分別喂100、200、400mg/kg的富硒綠茶多糖,發(fā)現(xiàn)顯著減輕了高脂飲食引起的小鼠肥胖和相關(guān)代謝紊亂。Zhang等[11]用硒含量為0.83μg/kg的低劑量亞硒酸鈉與硒含量為8.33μg/kg的高劑量亞硒酸鈉給高脂血癥大鼠灌胃,發(fā)現(xiàn)大鼠體重并無明顯變化,但肝重與肝臟系數(shù)均顯著降低了。Gao等[12]發(fā)現(xiàn)富硒紅茶在減輕高脂飲食喂養(yǎng)的SD(Sprague-Dawley)大鼠的高血糖和胰島素抵抗方面比缺硒紅茶的療效更好,但未能更好地消除脂肪堆積。姚雪瓊[13]通過建立妊娠期糖尿病模型,在實驗組用20μg/kg硒溶液灌胃,發(fā)現(xiàn)實驗組大鼠的孕期增重與對照組相比無明顯差異,且血糖顯著降低。翟盼盼[14]通過飼喂高糖高脂飼料建立小鼠糖尿病模型,實驗組用劑量為200、400、600mg/kg的硒多糖(硒含量為0.84mg/kg)給糖尿病小鼠灌胃,發(fā)現(xiàn)與對照組相比各濃度劑量組均可緩解糖尿病小鼠的胰島素抵抗癥狀,同時降低血糖,并存在量效關(guān)系。然而關(guān)于硒對血糖的影響研究結(jié)果并不完全相同,如Steinbrenner等[15]和Vinceti等[16]都曾發(fā)現(xiàn)高劑量攝入硒時,反而會導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生。

硒的攝入應(yīng)該適量,過量會導(dǎo)致硒中毒[17],過少則達不到理想效果。在以往研究中發(fā)現(xiàn)硒抑制高脂飲食所致超重和血糖升高的效果并不明確,主要是有效劑量和劑量依賴性方面研究較少。因此,就不同劑量富硒小球藻提取物對高脂飲食大鼠體重及血糖的不同影響展開研究,擬為膳食預(yù)防或控制肥胖、糖尿病以及富硒小球藻的推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SD大鼠60只,鼠齡為8周,體質(zhì)量為200±20g,購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司,實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(遼)2020-0001,清潔級證書編號為210726220101596013。室溫飼養(yǎng),相對濕度為45%～60%,12h/12h晝夜光照循環(huán),所有大鼠均自由攝食及飲水[18]。

1.2 飼料

普通大鼠維持飼料、高脂飼料(在普通維持飼料中添加20.0%蔗糖、15.0%豬油、1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉,適量的酪蛋白、磷酸氫鈣、石粉)[19],飼料均購于武漢劍悅生物科技有限公司。飼料的能值和主要成分如表1所示。由表1可知,普通大鼠維持飼料與高脂飼料的硒含量相同,后者的能量值、脂肪含量高于前者,蛋白質(zhì)、碳水化合物含量則低于前者。

表1 普通大鼠維持飼料與高脂飼料能值和主要成分Tab.1 Energy values and main components of maintenance feed and high-fat feed for common rats

1.3 主要材料

富硒小球藻提取物(硒含量為3069mg/kg)、無硒小球藻提取物(硒含量為10mg/kg)。材料使用酶解提取法,過程如下:將小球藻干物質(zhì)與20%～30%的水混合,浸泡30min后用30%的磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值為4.0±0.2,加入纖維素酶、果膠酶、蛋白酶,酶解時間為2h,升溫至70℃暫停30～60min并提高攪拌轉(zhuǎn)速,繼續(xù)升溫至90～100℃并保持2h,同時全力開啟攪拌乳化泵,將滅活液裝入管式離心機以10000r/min轉(zhuǎn)速進行固液分離,離心至少30min,固體殘渣按照1∶1的體積比加水,在120℃條件下蒸煮40min,重復(fù)離心,將離心液混合后進行冷凍干燥,得到小球藻提取物。

1.4 儀器

電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司,BSA124S);超凈工作臺(上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司,SW-CJ-2FD)。

1.5 方法

1.5.1 分組 實驗大鼠購回后以普通飼料喂養(yǎng)1周,空腹稱重后隨機分為6組,每組10只,分別為空白對照(control diet,CD)組、模型對照(high fat-diet,HFD)組、低劑量富硒小球藻提取物(low-dose selenium diet,LSD)組、中劑量富硒小球藻提取物(middle-dose selenium supplement diet,MSD)組、高劑量富硒小球藻提取物(high-dose selenium diet,HSD)組、無硒小球藻提取物(selenium-free chlorella diet,SFCD)組,同組一籠飼養(yǎng)。其具體分組及處理情況如表2所示[20]。由表2可知,除CD組為普通大鼠維持飼料飼喂外,其余5組均為高脂飼料飼喂。CD、HFD組灌胃方式相同,其他4組灌胃方式不同。

表2 大鼠分組及處理Tab.2 Rats grouping and handling

1.5.2 實驗過程 實驗期間,每隔2d更換1次墊料,保證籠內(nèi)清潔。大鼠自由飲水與進食,每天同一時間段進行灌胃,每日記錄大鼠的攝食量,每3日記錄大鼠體重。在灌胃60d后,次日處理(禁食不禁水,過夜)大鼠,采用吸入乙醚麻醉的方法進行麻醉,對大鼠稱重,眼球取血后脫臼處死,用血糖試紙檢測空腹血糖(fasting blood glucose,GLU),肝臟和附睪脂肪分別稱重記錄[21]。

1.5.3 臟器指數(shù)及附睪脂肪系數(shù) 臟器指數(shù)及附睪脂肪系數(shù)計算公式如下:

A=(B/W)×100%,

C=(D/W)×100%,

其中,W為體重,單位為g;A為臟器系數(shù);B為臟器濕重,單位為g;C為附睪脂肪系數(shù);D為附睪脂肪濕重,單位為g。

1.5.4 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)結(jié)果以均值±標準差(x±s)表示,使用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,采用單因素方差分析方法進行組間均值比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義,使用Origin 2018作圖。

2 實驗結(jié)果

2.1 大鼠生長情況

整個實驗過程中,動物房環(huán)境控制良好、干凈整潔,溫度、濕度均處于正常范圍。各組大鼠生活和精神狀況良好,正常進食進水,活動自如,對外界刺激反應(yīng)迅速,無腹瀉。各組大鼠糞便的顏色為黑褐色,形狀為長顆粒狀,尿液正常,均無死亡現(xiàn)象。

2.1.1 每日攝食量、能量攝入、硒攝入量 不同組別平均每只大鼠實驗過程中攝食量的變化如圖1所示。由圖1可知,實驗過程中各組大鼠的攝食量均隨著飼養(yǎng)時間的加長而呈現(xiàn)增加趨勢,CD組大鼠的攝食量顯著高于所有高脂組(P<0.05),這是由于高脂飼料中提供的能量高于普通飼料。高脂飲食的5組大鼠中,HFD、LSD、SFCD組大部分時間攝食量高于MSD、HSD組,表明富硒小球藻提取物對大鼠的攝食量及食欲有一定影響。

不同組別平均每只大鼠實驗過程中能量攝入情況的變化如圖2所示。由圖2可知,各組大鼠的能量攝入水平均隨著飼養(yǎng)時間的加長而呈現(xiàn)增加趨勢,HFD與LSD組的能量攝入水平略高于其余各組,SFCD組與MSD、HSD組能量攝入水平相同。在整個實驗過程中,各組之間能量攝入水平相差不大,表明雖然各組大鼠攝食量不同,但日均攝入能量水平相近,不同劑量的富硒小球藻提取物不會影響大鼠的能量攝入水平。

不同組別大鼠日均硒攝入量如圖3所示。由圖3可知,CD、HFD、SFCD組大鼠硒攝入來源主要為飼料,故以上3組硒攝入量較低,日均硒攝入量在20μg/kg以下;LSD、MSD、HSD組大鼠硒攝入來源為飼料和富硒小球藻提取物,日均硒攝入量在60～220μg/kg之間。各組大鼠從飼料中獲取硒的量基本相同,所以不同實驗組與對照組硒攝入量差別主要來源于富硒小球藻提取物。

2.1.2 體重 不同組別平均每只大鼠體重變化如圖4所示。由圖4可知,在整個實驗周期內(nèi),前30d各組大鼠的體重增長趨勢基本相同,36d以后CD組大鼠的體重增長較緩慢,HFD、SFCD組大鼠體重依舊增長較快,LSD、MSD、HSD組增長速度介于CD組與HFD組之間。說明不同硒劑量的富硒小球藻提取物能夠在不同程度上抑制高脂飲食大鼠體重的增長速度。

圖3 不同組別大鼠日均硒攝入量

不同組別平均每只大鼠體重變化數(shù)據(jù)如表3所示。由表3可知,實驗結(jié)束時,HFD、SFCD組大鼠體重顯著高于CD組(P<0.05);LSD、MSD、HSD組大鼠體重低于HFD、SFCD組但高于CD組,其中HSD組體重最低。與HFD組相比,LSD、MSD、HSD、SFCD組大鼠體重分別降低了1.06%、5.33%、6.37%、0.46%。結(jié)果表明富硒小球藻提取物對高脂飲食造成的體重增加具有抑制作用,而無硒小球藻提取物則效果不明顯。

表3 不同組別平均每只大鼠體重變化數(shù)據(jù)Tab.3 Values of average weight change per rat in different groups

2.2 血糖指數(shù)與臟器指數(shù)

各組大鼠臟器濕重及臟器指數(shù)如圖5所示。由圖5可知,CD組的大鼠肝重、附睪脂肪重、肝臟指數(shù)、附睪脂肪系數(shù)均低于其他各組。與HFD組相比,SFCD組大鼠肝重降低了6.87%,附睪脂肪重降低了13.71%;LSD、MSD、HSD組大鼠肝重分別降低了7.03%、8.17%、13.19%,附睪脂肪重分別降低了20.10%、26.67%、27.71%;表明無硒小球藻提取物與富硒小球藻提取物均能控制大鼠的肝重及附睪脂肪重,但富硒小球藻的效果更佳。在所有高脂組中,SFCD組大鼠的肝臟指數(shù)最低,附睪脂肪系數(shù)介于LSD與HFD之間,可能是因為無硒小球藻提取物能夠控制大鼠肝重與附睪脂肪重,但不能控制大鼠體重。在所有富硒小球藻提取物組中,隨著硒劑量的增加,大鼠肝重、肝臟指數(shù)呈現(xiàn)一定的下降趨勢,HSD組大鼠附睪脂肪重和附睪脂肪系數(shù)最低,與CD組相近。表明高脂飲食使臟器指數(shù)與附睪脂肪系數(shù)增加,富硒小球藻提取物能夠控制肝臟指數(shù)和附睪脂肪系數(shù),HSD組效果較明顯。

圖5 各組大鼠臟器濕重及臟器指數(shù)

各組大鼠血糖指數(shù)如圖6所示。由圖6可知,CD組大鼠的血糖指數(shù)低于所有高脂飲食組大鼠;SFCD組大鼠血糖指數(shù)比MSD組高,比HFD組低,說明無硒小球藻提取物有降低血糖效果,但效果不如同等劑量的富硒小球藻提取物。在富硒小球藻提取物組的大鼠中,隨著硒劑量的增加,血糖指數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢,HFD組血糖指數(shù)高于其余各組;LSD、MSD、HSD組大鼠血糖指數(shù)處于同一水平。與HFD組相比,LSD、MSD、HSD組大鼠血糖指數(shù)分別降低了18.06%、21.34%、28.30%。結(jié)果表明富硒小球藻提取物有降低血糖的效果,且具有劑量依賴性,但血糖與其劑量的關(guān)系值得進一步探究。

2.3 相關(guān)性分析

進一步探究硒攝入量與大鼠攝食量、體重、臟器指數(shù)及血糖情況的關(guān)聯(lián),對其進行皮爾遜相關(guān)性分析。為保證飼料類型一致,選取HFD、LSD、MSD、HSD組進行相關(guān)性分析。

硒攝入量與攝食量、能量攝入均有負面影響,皮爾遜相關(guān)系數(shù)均為-0.1673,但無相關(guān)性(P>0.05)。硒攝入量與體重的皮爾遜相關(guān)系數(shù)為-0.3325,且檢驗值P小于0.05,說明硒攝入量的增加對減輕高脂飲食大鼠體重具有顯著抑制作用,在實驗劑量范圍內(nèi),硒攝入量越高,高脂飲食大鼠的體重增長越緩慢。實驗期間雖然每組實驗大鼠體重均呈增長趨勢,但相比之下,HFD組體重增長最大,HSD組體重增長最小,且體重增長與硒攝入量具有量效關(guān)系。肝重、肝臟指數(shù)與硒攝入量呈極顯著負相關(guān)(P<0.01),皮爾遜相關(guān)系數(shù)分別為-0.4891、-0.4092;同理附睪脂肪重、附睪脂肪系數(shù)與硒攝入量呈顯著負相關(guān)(P<0.05),皮爾遜相關(guān)系數(shù)分別為-0.4073、-0.3842。說明硒對肝重及附睪脂肪均有明顯的抑制作用,硒可通過抑制大鼠肝重與體內(nèi)脂肪堆積減輕高脂飲食大鼠體重,且均存在量效關(guān)系。硒攝入量與血糖指數(shù)的皮爾遜相關(guān)系數(shù)為-0.4201,檢驗值P小于0.01,說明硒攝入量對血糖升高存在極顯著抑制作用,在實驗所用硒劑量范圍內(nèi),血糖指數(shù)隨著硒攝入量的增加而降低。

3 討論與結(jié)論

實驗以富硒小球藻提取物為原料,其低、中、高組硒劑量為50、100、200μg/kg,CD、HFD、LSD、MSD、HSD組的實際硒攝入量分別為12.99、10.95、60.99、110.66、210.81μg/kg。研究發(fā)現(xiàn)接受高脂飲食與無硒小球藻提取物的大鼠體重明顯增加,而接受高脂飲食與富硒小球藻提取物的大鼠體重增加幅度較小,與HFD組相比,LSD、MSD、HSD組大鼠體重分別降低了1.06%、5.33%、6.37%,肝重分別降低了7.03%、8.17%、13.19%,有研究表明硒的攝入會促進氧化與糖代謝,導(dǎo)致大鼠體重及肝重下降[22]。進一步分析發(fā)現(xiàn),接受富硒小球藻提取物的大鼠附睪脂肪組織含量較低,與HFD組相比,LSD、MSD、HSD組大鼠附睪脂肪重分別降低了20.10%、26.67%、27.71%,而SFCD組僅降低了13.71%。Nido[23]的研究表明富硒益生菌的攝入可以顯著改善高脂飲食誘導(dǎo)肥胖老鼠的脂質(zhì)分布和氧化狀態(tài),這是由于硒下調(diào)了參與脂質(zhì)代謝的基因表達水平。此外,研究還發(fā)現(xiàn)接受高脂飲食的大鼠血糖水平明顯升高,而接受硒補充的大鼠血糖水平升高幅度較小,與HFD組相比,LSD、MSD、HSD組大鼠血糖指數(shù)分別降低了18.06%、21.34%、28.30%。姚雪瓊[13]研究發(fā)現(xiàn)接受硒補充的大鼠胰島素敏感性較高,胰島素的分泌和利用效率也較高,說明硒可能通過調(diào)節(jié)胰島素信號通路減輕了高脂飲食對血糖的影響。最后,相關(guān)性分析結(jié)果表明硒攝入量與大鼠體重、血糖呈顯著、極顯著負相關(guān),與攝食量無顯著相關(guān)性,說明硒劑量與抑制高脂飲食所致的肥胖與血糖升高效果存在明顯量效關(guān)系,硒劑量越高效果越好且不通過抑制攝食量實現(xiàn)。因此,富硒小球藻提取物可能通過調(diào)節(jié)脂肪代謝和脂肪、血糖代謝合成的方式減輕了高脂飲食對體重的影響[24-25]。

總之,無硒小球藻提取物與硒劑量為50～200μg/kg的富硒小球藻提取物均能使高脂飲食大鼠的生理指標發(fā)生有益變化,影響效果與硒劑量有關(guān),硒劑量為200μg/kg的效果最好。這些研究結(jié)果表明硒的攝入可以降低高脂飲食所帶來的肥胖和高血糖風(fēng)險,為進一步探索硒調(diào)節(jié)高脂飲食所致的肥胖和高血糖的作用機理提供了理論基礎(chǔ)。