潘旭芳,周大寨,朱玉昌*

(1.硒食品營養(yǎng)與健康智能技術(shù)湖北省工程研究中心,湖北 恩施 445000;2.湖北民族大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院,湖北 恩施 445000;3.生物資源保護與利用湖北省重點實驗室,湖北 恩施 445000)

衰老是一種自發(fā)的生物過程,在機體的生命中是不可避免的。衰老的過程往往伴隨著身體機能的下降,即身體的生理完整性下降,導(dǎo)致身體器官功能性損傷或死亡等風(fēng)險增加[1]。一些疾病因素也能引發(fā)這種身體機能的漸進性喪失[2],如心血管疾病、糖尿病、神經(jīng)性退行性疾病、帕金森病等。盡管這種衰老的生物過程是不可逆的,但可通過攝入一些活性物質(zhì)來延緩衰老。大量研究表明水提取物、醇提取物等活性物質(zhì)具有延緩秀麗隱桿線蟲壽命的作用[3-5]。尋找延長壽命的化合物或藥物成為了當(dāng)代科研人員研究的熱點。

秀麗隱桿線蟲作為模式生物模型,以大腸埃希氏菌為食物,按生長時期分為3個時期,胚胎期(L1)、幼蟲期(L2、L3、L4)和成蟲期,其已被廣泛用于抗衰老相關(guān)疾病的研究[6-7]。秀麗隱桿線蟲具有生命周期短(易于在實驗室大量培養(yǎng))、身體透明(便于實驗觀察)、繁殖能力強、全基因組和遺傳背景清晰、對外界環(huán)境敏感等優(yōu)點,使其更適合延緩衰老方面的研究。呂晨豪等[8]研究發(fā)現(xiàn)陳皮水提取物可以延長秀麗隱桿線蟲壽命。楊帆等[9]發(fā)現(xiàn)益智仁提取物可以通過提高抗氧化酶活力和抗氧化基因的表達水平,延緩線蟲衰老。王軼菲等[10]發(fā)現(xiàn)山楂提取物可以有效延緩秀麗隱桿線蟲衰老。目前秀麗隱桿線蟲作為模式生物在水提取物[4]、醇提取物[11]、多糖[12]、毒性物質(zhì)評估[13]等方面均有研究。

狐臭柴(PremnapuberulaPamp.),別名長柄臭黃荊、豆腐柴、臭黃荊、臭樹、斑鳩占等,屬馬鞭草科豆腐柴屬植物[14-15],在我國廣泛分布于華東、中南、華南及西南等地,是一種藥食兼用的植物。湖北、湖南等地常用其葉制作涼粉食用,名曰“神仙豆腐”。其功能性成分主要包括黃酮類、多酚類及多糖類等[16],具有降暑消炎、抗氧化、降血糖等[17]藥理活性。其葉的水提液中主要含有多糖、黃酮、多酚及氨基酸類物質(zhì),具有顯著的抗炎、抑菌以及抗氧化效果。Li等[18]發(fā)現(xiàn)豆腐柴果膠具有抗氧化和抗炎作用。Song等[19]發(fā)現(xiàn)豆腐柴多糖可以通過增強宿主的腸道抵抗力來改善炎癥。李爽等[20]發(fā)現(xiàn)狐臭柴揮發(fā)油具有較強的抗氧化、抗菌和抗腫瘤活性。而狐臭柴葉片功能性成分的研究主要集中在果膠、蛋白質(zhì)、多酚及黃酮類化合物的提取與抗氧化活性研究,對狐臭柴葉水提取液(PremnapuberulaPamp.leaves water extract,PPW)抗衰老活性方面的研究鮮有報道。

以模式生物秀麗隱桿線蟲作為研究對象,測定狐臭柴葉水提取液對線蟲壽命、蟲體長度、運動能力、紫外應(yīng)激能力以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的影響,進而以苯酚-硫酸法、酒石酸鐵法、硝酸鈉-硝酸鋁法及考馬斯亮藍法分別測定PPW中多糖、總黃酮、總酚、蛋白質(zhì)的含量,對延緩線蟲衰老機制做了初步研究。以期探究PPW延緩秀麗隱桿線蟲衰老的作用,為狐臭柴資源的綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

狐臭柴鮮葉于2022年8月采摘于湖北省利川市湖北雄展農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司種植基地,經(jīng)湖北民族大學(xué)易詠梅教授鑒定為狐臭柴(PremnapuberulaPamp.)的葉片。鮮葉洗凈后于55℃烘干,超微粉碎過60目篩,密封后于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

N2野生型秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)、大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)OP50由湖北民族大學(xué)方慶老師惠助;其他試劑有5-氟尿嘧啶(上海麥克林生化科技有限公司,分析純),膽固醇(上海源葉生物有限公司,分析純),瓊脂粉、LB肉湯、胰蛋白胨(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司,生物試劑)等。

實驗儀器有生化培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司,SPX-1505H-II)、高速冷凍離心機(湘儀離心機有限公司,H2050R)、超凈工作臺(蘇潔凈化設(shè)備有限公司,SJ-CJ-2FDQ)、超微粉碎機(廣州市旭朗機械設(shè)備有限公司,XL-30C)、超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司,KQ5200E)。

1.2 PPW對秀麗隱桿線蟲抗衰老活性的測定

1.2.1 線蟲培養(yǎng)及同期化 線蟲的培養(yǎng)在線蟲生長固體培養(yǎng)基(nematode growth medium,NGM)上進行,稱量1.0g胰蛋白胨、6.8g瓊脂粉、1.2g NaCl,溶于400mL去離子水中,高溫高壓滅菌20min,冷卻至60℃左右,于超凈工作臺中加入無菌的400μL1mol/L CaCl2、400μL1mol/L MgSO4、400μL 5mg/mL膽固醇和10mL 1mol/L磷酸鉀緩沖液,混勻后倒入培養(yǎng)皿中,每個平板加入100μLE.coliOP50菌液作為線蟲食物,置于20℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

線蟲同期化參照文獻[21]略有改動,采用裂解法,裂解液為2.5mL無菌水、1.5mL次氯酸鈉和1mL 2mol/L NaOH的混合液。用M9緩沖溶液將大量蟲卵及成蟲期線蟲沖洗至14mL無菌離心管中,以6000r/min轉(zhuǎn)速離心3min,用M9緩沖溶液沖洗2次,最后留1mL蟲液,加入裂解液后,反復(fù)振蕩 10min,中間停留30s左右,待看到?jīng)]有明顯蟲體時,離心去除上清液,用M9清洗2次,無菌水清洗1次,最后留1mL蟲液,將其轉(zhuǎn)到涂有E.coliOP50的NGM培養(yǎng)基上,連續(xù)培養(yǎng)72h,即得到同期化的L4期線蟲。

1.2.2 PPW制備及給藥途徑 按狐臭柴粉末與去離子水比例為1∶60(g/mL)在45℃恒溫的磁力攪拌器中水浴提取1h,提取結(jié)束后以8000r/min轉(zhuǎn)速離心10min,得到上清液備用。以上清液為母液,命名為PPW,用E.coliOP50菌液將其稀釋為25%、50%、75%的狐臭柴葉水提取液備用。

給藥途徑:在24孔板的NGM培養(yǎng)基中加入20μL樣品和20μL 5-氟尿嘧啶;在直徑為6cm的培養(yǎng)皿中加入1mL樣品和1mL 5-氟尿嘧啶?？瞻捉M以E.coliOP50菌液為對照,開蓋紫外滅菌2h,待其自然晾干。

1.2.3 線蟲壽命測定 參照文獻[7]略有改動,將L4期的秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)移至空白組和含PPW分別為25%、50%、75%的24孔板,從轉(zhuǎn)移當(dāng)天開始記為0d,每24h轉(zhuǎn)移線蟲至對應(yīng)的實驗組新平皿中,每孔線蟲約30條,共90條線蟲,每天記錄死亡數(shù)和存活數(shù),直到線蟲全部死亡。判斷死亡的標準為:無運動及無食物吞咽行為且用挑蟲器拍打蟲體無反應(yīng)。運用SPSS軟件繪制生存曲線,計算最長壽命(最后10%存活線蟲的平均值)、平均壽命。

1.2.4 線蟲蟲體長度的測定 培養(yǎng)方法同1.2.3節(jié)中的線蟲培養(yǎng)步驟,培養(yǎng)4d后收集秀麗隱桿線蟲,用NaN3麻醉之后在顯微鏡下拍照。實驗至少重復(fù)3次,每組至少30條。

1.2.5 運動能力的測定 培養(yǎng)方法與1.2.3節(jié)中的方法相同,培養(yǎng)4d后收集秀麗隱桿線蟲,轉(zhuǎn)入加有M9緩沖溶液而不含E.coliOP50菌液的48孔NGM培養(yǎng)基中,每孔1條,每組10條,讓其自由運動1min,觀察線蟲20s內(nèi)身體彎曲的次數(shù),彎曲標準為秀麗隱桿線蟲往蟲體長軸方向1個波動記為1次身體彎曲。

1.2.6 線蟲抗紫外應(yīng)激能力的測定 參照文獻[22]略有改動,培養(yǎng)方法同1.2.3節(jié)中的方法,培養(yǎng)4d后轉(zhuǎn)入到空白的NGM培養(yǎng)基,放在超凈工作臺(紫外燈的直徑為19mm、功率為18W,培養(yǎng)基距紫外燈的距離為135cm)。開蓋紫外滅菌,每30min觀察并計數(shù)各組線蟲的生存情況,至所有線蟲全部死亡,線蟲死亡評判標準與壽命實驗標準相同。每孔10條,每組至少30條,每次重復(fù)3次平行實驗。

1.2.7 線蟲體內(nèi)MDA含量的測定 MDA為脂膜過氧化程度的指標。在高溫條件下,可以與硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)反應(yīng)生成紅棕色的三甲川,在532nm處有最大吸光度,運用該原理可測得MDA的含量。將L4期的秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)移至空白組和PPW含量為25%、50%、75%的直徑為6 cm的培養(yǎng)皿,每板至少1000條線蟲,培養(yǎng)4d之后收集線蟲,無菌水清洗2次,去掉上清液。加入提取液,用超聲波清洗器破碎蟲體,以8000r/min轉(zhuǎn)速離心10min,得到上清液待測。根據(jù)雙組分分光光度計法,計算MDA的含量,計算公式為

C=[6.45×(A1-A2)-0.56×A3]/Cpr。

其中,C為MDA的含量,單位為μmol/mg;A1、A2、A3分別代表532、450、600nm處的吸光度值;Cpr為線蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度,單位為mg/mL。

1.3 PPW中主要成分測定

1.3.1 多糖的測定 采用苯酚-硫酸法測定PPW中多糖的含量,以葡萄糖醛酸作為標準品,繪制質(zhì)量濃度為0.2～1.8mg/mL的標準曲線。反應(yīng)體系中加入2mL標準品、1mL 9%苯酚、5mL硫酸,暗反應(yīng)30min,在490nm處測吸光度值。得到標準曲線為y=0.0046x+0.0223,R2=0.9941。按標準曲線制作方式加入狐臭柴葉水提取液,根據(jù)標準曲線計算PPW中多糖的含量。

1.3.2 總酚的測定 采用酒石酸鐵法,繪制沒食子酸質(zhì)量濃度為200～800μg/mL的標準曲線,得到標準曲線為y=0.001x+0.0373,R2=0.9917。按標準曲線制備的方法加入狐臭柴葉水提取液,根據(jù)標準曲線計算PPW中總酚的含量。

1.3.3 總黃酮的測定 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁分光光度法,繪制蘆丁標準品質(zhì)量濃度為50～250μg/mL的標準曲線,得到標準曲線為y=0.0038x+0.0157,R2=0.9959。按標準曲線的制作方法加入狐臭柴葉水提取液,根據(jù)標準曲線計算PPW中總酚的含量。

1.3.4 蛋白質(zhì)的測定 采用考馬斯亮藍法,繪制牛血清蛋白標準品質(zhì)量濃度為0.02～0.12mg/mL的標準曲線,得到標準曲線為y=7.3357x+0.0363,R2=0.9941。按標準曲線的制作方法加入狐臭柴葉水提取液,根據(jù)標準曲線計算水提取液中蛋白質(zhì)的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運用SPSS 26.0軟件對實驗結(jié)果進行單因素方差分析(analysis of variance,ANOVA),采用鄧肯式多重比較對差異顯著性進行比較分析,P<0.05表示差異顯著。運用Origin 2022進行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPW對線蟲自然壽命的影響

壽命是評價機體是否衰老的最直接體現(xiàn)。PPW對線蟲壽命影響的生存曲線如圖1所示。由圖1可知,與空白組相比,用不同含量的PPW喂養(yǎng)線蟲均可使線蟲的生存曲線右移,延長最長壽命。PPW對線蟲壽命影響的統(tǒng)計分析如表1所示。由表1可知,使用25%、75%的PPW喂養(yǎng)線蟲之后,線蟲的平均壽命在13.08d左右,最長壽命上升至19.00d以上,與空白組相比,其平均壽命有顯著性差異。當(dāng)喂養(yǎng)PPW含量為50%時,其最長壽命為20.33d,平均壽命為13.47d,與空白組相比平均壽命延長了16.42%。由此可見,狐臭柴葉水提取液可以顯著延緩線蟲的自然壽命。該結(jié)果與孫翌等[23]研究豆腐柴提取物在適當(dāng)濃度下可以延長果蠅壽命相似。

表1 PPW對線蟲壽命影響的統(tǒng)計分析Tab.1 Statistical analysis of effects of PPW on longevity of Caenorhabditis elegans

圖1 PPW對線蟲壽命影響的生存曲線Fig.1 Survival plot of the effect of PPW on the lifespan of Caenorhabditis elegans

2.2 PPW對線蟲蟲體長度的影響

機體的生長狀態(tài)可以體現(xiàn)喂養(yǎng)濃度對線蟲生長的影響,PPW對線蟲的體長影響如圖2(a)所示。由圖2(a)可知,不同含量的PPW對線蟲的蟲體長度有增長作用。與對照組相比,當(dāng)喂養(yǎng)PPW含量為25%時,蟲體長度得到了顯著性上升(P<0.05);當(dāng)喂養(yǎng)PPW含量為50%、75%時,蟲體長度不再增加,表明PPW對線蟲的蟲體長度沒有濃度依賴性。由此得出,PPW可以促進其生長發(fā)育,對線蟲的生長發(fā)育沒有毒害作用。

注:不同的字母代表差異顯著,P<0.05。注:不同的字母代表差異顯著,P<0.05。(a) PPW對線蟲蟲體長度的影響 (b) PPW對線蟲身體彎曲頻率的影響圖2 PPW對線蟲的蟲體長度及身體彎曲頻率影響Fig.2 Effects of PPW on body length and bending frequency of Caenorhabditis elegans

2.3 PPW對線蟲運動能力的影響

運動給機體帶來健康的同時也可以延長壽命,陳媛麗[24]發(fā)現(xiàn)運動可以通過激活線蟲的自噬行為從而延長秀麗隱桿線蟲的壽命。以線蟲身體的彎曲頻率表示線蟲的運動能力,其頻率越大表明運動能力越強。PPW對線蟲身體彎曲頻率影響如圖2(b)所示。由圖2(b)可知,不同含量的狐臭柴葉水提取液對線蟲的身體彎曲頻率有提高作用。當(dāng)PPW含量為25%時,與空白組相比,線蟲運動能力有差異但差異沒有顯著性;當(dāng)PPW含量為50%時,運動能力得到顯著性提升,從空白組的1.01次/s上升到1.18次/s,繼續(xù)增加喂養(yǎng)含量,運動能力不再增加。綜上可知,PPW可以顯著提高線蟲的身體彎曲頻率,增強運動能力。

2.4 PPW對線蟲抗紫外應(yīng)激的影響

紫外應(yīng)激能力可以反映機體對紫外逆環(huán)境的適應(yīng)能力。PPW對線蟲紫外損傷的生存曲線如圖3所示。由圖3可知,對喂養(yǎng)之后的線蟲進行紫外損傷測定,與空白組相比,其受紫外損傷的生存曲線向右移,說明PPW飼喂可以顯著提高線蟲對抗紫外損傷的能力。PPW對線蟲紫外損傷影響的統(tǒng)計如表2所示。由表2可知,PPW喂養(yǎng)線蟲可使其平均壽命、最長壽命顯著性增加(P<0.05),壽命最長達到5.31±0.45h,相對空白組,25%、50%和75%的PPW喂養(yǎng)的線蟲平均壽命分別延長21.12%、16.81%和32.96%。綜上可知,PPW可以提高秀麗隱桿線蟲的抗紫外損傷能力。

表2 PPW對線蟲紫外損傷影響的統(tǒng)計分析Tab.2 Statistical analysis of effects of PPW against UV damage of Caenorhabditis elegans

圖3 PPW對線蟲紫外損傷的生存曲線Fig.3 Survival curves of PPW against UV of Caenorhabditis elegans

2.5 PPW對線蟲體內(nèi)MDA的影響

MDA是衡量氧化損傷程度的指標,反映過氧化程度,其為自由基與脂質(zhì)發(fā)生過氧化而產(chǎn)生的物質(zhì),具有細胞毒性,影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物及線粒體體內(nèi)關(guān)鍵酶的活性,從而影響機體壽命[25]。PPW對線蟲體內(nèi)MDA含量的影響如圖4所示。由圖4可知,PPW可以顯著降低MDA的含量(P<0.05)。當(dāng)PPW的含量為25%時,與空白組相比MDA降低最為明顯,隨著PPW含量的增加,MDA含量上升達到平衡,說明PPW降低線蟲體內(nèi)的MDA且沒有濃度依賴性。綜上可知,PPW可以降低MDA對線蟲細胞的毒害作用、減少細胞損傷、延緩衰老。這可能與水提取液中多糖含量較高相關(guān)。黃少杰等[26]研究發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛葉多糖可通過減緩細胞氧化損傷,進而發(fā)揮其延長壽命的功效。

注:不同的字母代表差異顯著,P<0.05。圖4 PPW對線蟲體內(nèi)MDA含量的影響Fig.4 Effect of PPW on MDA content in Caenorhabditis elegans

2.6 PPW中主要成分分析

PPW中多糖、總酚、總黃酮、蛋白質(zhì)分別為54.30±3.39、15.52±0.53、13.52±0.90、13.87±0.30mg/g,亦即PPW中含量最多的為多糖類物質(zhì),其次為總酚、蛋白質(zhì)及總黃酮。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

研究發(fā)現(xiàn),天然植物里面的許多天然化學(xué)物質(zhì)具有抗氧化、抗炎、抑菌等藥理活性,并且可以調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、延緩衰老。黃少杰等[26]研究發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛葉多糖能夠提高秀麗隱桿線蟲抗應(yīng)激能力和減緩細胞氧化損傷,進而發(fā)揮其延長壽命的功效。王猛等[27]研究發(fā)現(xiàn)褐藻多糖可通過延長秀麗隱桿線蟲的壽命,提高其運動能力,提升線蟲抗氧化酶活性,調(diào)控關(guān)鍵基因的表達。熊磊[28]發(fā)現(xiàn)枸杞多酚提取物能增強秀麗隱桿線蟲在紫外條件下的應(yīng)激能力,從而延緩秀麗隱桿線蟲的衰老。陳宇[22]研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉黃酮提取物可以通過改善線蟲運動狀況、抗氧化能力等,從而發(fā)揮延緩衰老的作用。綜上所述,PPW延緩秀麗隱桿線蟲衰老,可能是狐臭柴葉水提取液中多糖、多酚、黃酮等活性物質(zhì)相互作用的結(jié)果。

3.2 結(jié)論

為了研究狐臭柴葉水提取液對秀麗隱桿線蟲的抗衰老活性,以模式生物秀麗隱桿線蟲作為研究對象,測定狐臭柴葉水提取液對秀麗隱桿線蟲自然壽命、蟲體長度、運動能力、紫外應(yīng)激能力及丙二醛含量的影響,以苯酚-硫酸法、酒石酸鐵法、硝酸鈉-硝酸鋁法及考馬斯亮藍法分別測定PPW中多糖、總黃酮、總酚、蛋白質(zhì)的含量,對PPW延緩線蟲衰老的機理做了初步研究。結(jié)果表明與空白組相比,當(dāng)PPW含量為25%、50%、75%時,延長了秀麗隱桿線蟲平均壽命的13.83%、16.42%、12.27%,在紫外損傷條件下延長了線蟲平均壽命的21.12%、16.81%、32.96%。顯著增強了線蟲的運動能力、延長了蟲體長度、顯著降低了線蟲體內(nèi)丙二醛的含量。綜上所述,狐臭柴葉水提取液可以延緩秀麗隱桿線蟲的衰老、降低體內(nèi)丙二醛含量、促進線蟲生長發(fā)育、提高運動能力和抗紫外應(yīng)激能力。該結(jié)論可為狐臭柴資源的綜合開發(fā)利用提供參考。