蘇琦雅,鄧 蕾,潘 慧,鐘彩虹,劉德江*,李 黎#

(1.佳木斯大學(xué) 生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007;2.中國科學(xué)院 武漢植物園,武漢 430074;3.中國科學(xué)院 植物種質(zhì)創(chuàng)新與特色農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實驗室,武漢 430074;4.中國科學(xué)院 獼猴桃產(chǎn)業(yè)技術(shù)工程實驗室,武漢 430073)

近年來,隨著獼猴桃產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展,獼猴桃炭疽病在我國四川、江西等多省份發(fā)現(xiàn),部分園區(qū)感病超過30%,呈現(xiàn)同一園區(qū)多點(diǎn)發(fā)病的狀況,對獼猴桃產(chǎn)量和品質(zhì)造成了嚴(yán)重影響[1-2]。獼猴桃感病后葉片邊緣卷縮,初期呈現(xiàn)水漬狀病斑,后期為褐色不規(guī)則形病斑,病斑正面散生許多小黑點(diǎn),病健交界明顯。病情嚴(yán)重時多個病斑常連接成片,形成穿孔或大量落葉[3]。此外,該病還會導(dǎo)致獼猴桃果實硬度、維生素C含量迅速下降,果面出現(xiàn)褐色病斑直至完全腐爛,降低果實質(zhì)量[4]。

膠孢炭疽菌[Colletotrichumgloeosporioides(Penz.) Sacc.],有性態(tài)為圍小叢殼菌(Glomerellacingulata),屬子囊菌門,無性態(tài)為膠孢炭疽菌。一般以菌絲體和分生孢子盤形式在宿主上越冬,翌年早春形成分生孢子,借風(fēng)雨和昆蟲傳播,從氣孔、傷口侵入,導(dǎo)致植物發(fā)病[5]。迄今為止,已報道該菌可導(dǎo)致蘋果、桃、芒果、番木瓜、柑橘、黃柏、板栗、枇杷、麥冬、橡膠等200多種植物感染炭疽病,危害重大[6]。2016年9月,基于生物學(xué)特性、致病力驗證及真菌的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internally transcribed spacer,ITS)、β-微管蛋白(beta-tubulin,β-tubulin)及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehydephos phate dehydrogenase,GAPDH)多序列實驗,膠孢炭疽菌被首次鑒定為我國貴州六盤水及浙江泰順等地獼猴桃炭疽病的主要致病菌[7],但該菌對獼猴桃的定殖侵染及致病機(jī)理并未得到深入研究。綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)作為一種全新的非酶報告基因,具有熒光特性穩(wěn)定、實時原位檢測方便、受體細(xì)胞的種屬和類型多樣等優(yōu)點(diǎn),被廣泛用于植物病原菌檢測、侵染與定殖、基因表達(dá)及抗性植株篩選中[8]。然而,綠色熒光蛋白作為報告基因研究炭疽病菌對獼猴桃的侵染過程未見報道。

針對膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)菌株,李思蒙等[9]、張俊等[10]、曾泉等[11]及陸英等[12]分別成功建立了聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介導(dǎo)的楊樹、芒果、辣椒、咖啡膠孢炭疽菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系,獲得了對應(yīng)的GFP熒光轉(zhuǎn)化子。但PEG介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化具有一些缺點(diǎn),譬如步驟繁瑣且轉(zhuǎn)化效率低、易產(chǎn)生部分瞬時轉(zhuǎn)化子和多拷貝整合等。近幾年,農(nóng)桿菌介導(dǎo)構(gòu)建綠色熒光蛋白菌株的技術(shù)因其操作簡單、穩(wěn)定性強(qiáng)、轉(zhuǎn)化效率高、單拷貝插入突變體多等優(yōu)點(diǎn),也被用于膠孢炭疽菌的熒光菌構(gòu)建中。李偉等[13]以篩選致病基因為目的,首次建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的芒果膠孢炭疽菌遺傳轉(zhuǎn)化體系,篩選到多株菌落形態(tài)異?；虍a(chǎn)孢能力下降的突變體;王海艷等[14]構(gòu)建了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘋果炭疽病菌遺傳轉(zhuǎn)化體系;但上述2項研究并未獲得其熒光菌株。畢方鋮等[15]首次篩選到GFP熒光的芒果膠孢炭疽病菌,得到了8株致病力減弱或缺失的轉(zhuǎn)化子。因此,在畢方鋮等[15]研究體系的基礎(chǔ)上,擬針對獼猴桃膠孢炭疽病菌構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化體系,獲得與野生型形態(tài)、致病力一致且可穩(wěn)定遺傳的GFP熒光轉(zhuǎn)化子,為探究該菌對獼猴桃的侵染規(guī)律及致病機(jī)理奠定材料基礎(chǔ)。該研究結(jié)果將有助于盡快減少該病對獼猴桃產(chǎn)業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料與方法

1.1 供試材料

膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)菌株KFCG-W(KF為宿主獼猴桃縮寫,CG為炭疽病拉丁名縮寫,W代表野生菌株)分離自獼猴桃炭疽病感病果實[5]。含GFP基因和潮霉素B抗性基因的雙元質(zhì)粒pCAMBgfp及以其為轉(zhuǎn)化載體的農(nóng)桿菌EHA105菌株,均由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所畢方鋮研究員惠贈[15]。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA)、LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基、誘導(dǎo)培養(yǎng)基(induction medium,IM)及篩選培養(yǎng)基配方與鄧?yán)俚萚16]一致。

1.2 實驗方法

1.2.1 含雙元載體的農(nóng)桿菌液制備 將上述含雙元質(zhì)粒的EHA105農(nóng)桿菌菌株在LB平板上進(jìn)行活化,28℃下培養(yǎng)48h后挑取單菌落至含50μg/mL卡那霉素(kanamycin,Kan)及25μg/mL利福平(rifampicin,Rif)的LB液體培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)基混勻后放入恒溫培養(yǎng)箱,以200r/min條件振蕩培養(yǎng)48h后將菌液在離心機(jī)內(nèi)以5000r/min離心5min,倒掉上清液,將剩余沉淀在IM液體培養(yǎng)基中重懸,調(diào)整重懸濃度至600nm波長下的溶液吸光度(optical density,OD600)為0.2,隨后在28℃下以200r/min條件振蕩培養(yǎng)6h,備用。

1.2.2 膠孢炭疽病菌的孢子懸液制備 將KFCG-W菌株在PDA平板上接種培養(yǎng)2周,觀察平板產(chǎn)孢情況。用無菌涂布棒在平板表面多次輕輕刮擦,逐次加入無菌水,輕輕晃動平板,收集孢子液并用2層無菌紗布過濾,隨后進(jìn)一步用IM液體培養(yǎng)基將孢子重懸混勻,最終通過顯微觀察計數(shù)稀釋得到濃度為1×106個/mL的孢子懸液。

1.2.3 孢子與農(nóng)桿菌菌株共轉(zhuǎn)化 準(zhǔn)備鋪有無菌玻璃紙的IM共培養(yǎng)基+200μmol/L乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)平板,將1.0mL農(nóng)桿菌液及1.0mL孢子懸液均勻混合,取100μL涂布于平板上,在25℃條件下避光共培養(yǎng)48h。隨后,將玻璃紙轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基(含160μg/mL潮霉素和200μmol/L頭孢霉素),置于25℃條件下培養(yǎng)。待長出新菌落后將單菌落挑至含160μg/mL潮霉素的培養(yǎng)基上反復(fù)繼代培養(yǎng),其中仍可穩(wěn)定生長的菌落作為候選轉(zhuǎn)化子[17]。

1.2.4 候選轉(zhuǎn)化子的PCR檢測及熒光驗證 1) GFP基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)檢測:收集轉(zhuǎn)化子菌絲提取脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)。擴(kuò)增引物序列為GFP-F/GFP-R:5′-AGCAAGGGCGAGGAGCTGT-3′/5′-TTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3′。PCR擴(kuò)增體系為模板1μL,10μmol/L正反向引物各0.5μL,2×phanta max master mix(Dye Plus) 12.5μL,加入滅菌超純水補(bǔ)至25μL。反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性3min,95℃變性15s、60℃退火15s、72℃延伸1min,循環(huán)35次;72℃條件下保存10min。使用Tanon 1600全自動數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)觀察PCR產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果,初步確定陽性轉(zhuǎn)化子。2) 轉(zhuǎn)化子的熒光檢測:針對這些初步確定為陽性轉(zhuǎn)化子的材料,在25℃條件下培養(yǎng)4d;先用LUYOR-3410手持熒光儀觀察其菌落,如發(fā)現(xiàn)帶GFP熒光,則挑取菌絲制作成玻片,進(jìn)一步運(yùn)用熒光顯微鏡Leica DFC550進(jìn)行觀察;如仍可觀察到明確的熒光,則被確定為陽性轉(zhuǎn)化子。

1.2.5 陽性轉(zhuǎn)化子的菌落形態(tài)及致病性驗證 1) 轉(zhuǎn)化子的菌落形態(tài)觀察及菌絲生長速率測定:將陽性轉(zhuǎn)化子活化,用打孔器取直徑為0.8cm的菌餅,接種置于PDA平板的中心,在25℃條件下培養(yǎng)4d后運(yùn)用十字交叉法測量菌落的平均直徑,觀察菌落形態(tài),計算標(biāo)準(zhǔn)誤差。以野生型為對照,重復(fù)3次。2) 轉(zhuǎn)化子的致病力測定:參照鄧?yán)俚萚16]的方法,用75%酒精對中華獼猴桃‘東紅’品種果實進(jìn)行消毒,消毒30s后立即用無菌水沖洗3次,自然晾干后用注射器針頭在果實表面刺孔。以野生型KFCG-W菌株為對照,將直徑0.8cm的轉(zhuǎn)化子菌餅接種到果實表面上,菌絲面與果實接觸,在25℃條件下培養(yǎng)6d后測定病斑直徑,計算標(biāo)準(zhǔn)誤差值,重復(fù)8次。將顯著水平設(shè)定為0.05,運(yùn)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)化子PCR檢測

首先,為確定獼猴桃炭疽病菌KFCG-W菌株遺傳轉(zhuǎn)化的最佳潮霉素篩選濃度,設(shè)置了梯度篩選實驗。野生型KFCG-W菌株在不同濃度潮霉素B平板上的菌絲生長情況如圖1所示。由圖1可知,野生型KFCG-W菌株在不含潮霉素的PDA平板上正常生長(A列);當(dāng)潮霉素質(zhì)量濃度分別為60μg/mL(B列)、120μg/mL(C列)時,菌絲受到不同程度的抑制但仍在生長,且隨著潮霉素濃度的增加,菌絲受抑制的程度越來越明顯。當(dāng)潮霉素質(zhì)量濃度增加至140μg/mL(D列)時,菌株已基本停止生長。當(dāng)潮霉素質(zhì)量濃度進(jìn)一步增加至160μg/mL(E列)或180μg/mL(F列)時,菌株完全停止生長。基于實驗結(jié)果可知,潮霉素質(zhì)量濃度為160μg/mL時野生型菌株已完全無法生長,滿足篩選要求,特將轉(zhuǎn)化子篩選質(zhì)量濃度設(shè)定為160μg/mL(E列)。

按照1.2.1～1.2.3步驟進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的獼猴桃炭疽病菌KFCG-W菌株遺傳轉(zhuǎn)化,經(jīng)潮霉素篩選及數(shù)次繼代培養(yǎng)篩選,初步篩選獲得11株轉(zhuǎn)化子。為保證轉(zhuǎn)化子的準(zhǔn)確性,進(jìn)一步利用GFP序列特異性引物對野生型KFCG-W菌株及11株轉(zhuǎn)化子(CG1～CG11)進(jìn)行PCR檢測,PCR擴(kuò)增后能得到目的GFP片段710堿基對(base pair,bp)的轉(zhuǎn)化子被視為遺傳轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)化子。野生型KFCG-W菌株及轉(zhuǎn)化子PCR檢測電泳圖如圖2所示。由圖2可知,與預(yù)期結(jié)果一致,對應(yīng)泳道1的野生型KFCG-W菌株未擴(kuò)增到目的熒光GFP基因條帶中,分別對應(yīng)泳道2～12的轉(zhuǎn)化子CG1～CG11均可擴(kuò)增得到710bp的GFP基因目的條帶中,由此說明GFP片段已穩(wěn)定插入轉(zhuǎn)化子基因組中,可用于進(jìn)行下一步研究。

注:M為電泳;泳道1為KFCG-W野生菌株;泳道2～12依次對應(yīng)轉(zhuǎn)化子CG1～CG11。圖2 野生型KFCG-W菌株及轉(zhuǎn)化子PCR檢測電泳圖Fig.2 PCR verification for wild type stain and transformants of C.gloeosporioides

2.2 熒光顯微檢測

為進(jìn)一步確定遺傳轉(zhuǎn)化子的熒光穩(wěn)定性,對11株轉(zhuǎn)化子在25℃條件下PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4d后的菌絲生長狀態(tài)、孢子及菌絲顯微結(jié)構(gòu)、接種果實后的感病癥狀進(jìn)行分析。結(jié)果表明,11株轉(zhuǎn)化子在激發(fā)光條件下均可表達(dá)穩(wěn)定的綠色熒光,由此證實11株轉(zhuǎn)化子中的外源GFP基因均能正常表達(dá)并遺傳穩(wěn)定。觀察熒光強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)大部分菌株的GFP表達(dá)水平一致,其中CG-10菌株的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)烈。轉(zhuǎn)化子CG-10的熒光顯微觀察結(jié)果如圖3所示。

圖3 轉(zhuǎn)化子CG-10的熒光顯微觀察Fig.3 Fluorescence microscopic observation of transformant CG-10

由圖3(a)可知,在明場條件下CG-10轉(zhuǎn)化子在PDA平板上菌絲生長正常。由圖3(b)可知,在紫外激發(fā)光條件下,該菌株的菌絲熒光明亮穩(wěn)定,菌絲的輪紋較明場下更清晰。由圖3(c)可知,將CG-10轉(zhuǎn)化子接種果實后,在明場條件下果面出現(xiàn)典型的軟腐癥狀,病部果肉呈水漬狀腐爛,病健交界處明顯。由圖3(d)可知,在紫外激發(fā)光條件下,CG-10轉(zhuǎn)化子的病斑呈現(xiàn)明亮的熒光,熒光形狀面積與果實病斑完全一致,有利于更直觀地觀察軟腐病菌對獼猴桃果實的侵染過程。由圖3(e)可知,在明場條件下CG-10轉(zhuǎn)化子菌絲結(jié)構(gòu)正常,孢子萌發(fā)正常。由圖3(f)可知,轉(zhuǎn)化子的菌絲和孢子熒光穩(wěn)定,較明場而言能更清晰地觀察膠孢炭疽病菌的菌絲結(jié)構(gòu)及孢子形態(tài)。

2.3 轉(zhuǎn)化子的菌落形態(tài)分析

為進(jìn)一步篩選出與野生型菌株菌落形態(tài)一致的熒光轉(zhuǎn)化子菌株,對野生型菌株及11株轉(zhuǎn)化子在PDA平板上的菌落特征進(jìn)行了觀察,結(jié)果如圖4所示。觀察接種4d后的平板菌落,由圖4(a)可知,野生型菌株菌絲白色濃密,菌絲生長速度較快。與野生型菌株相比,CG-1(圖4(b))、CG-4(圖4(e))、CG-6(圖4(g))、CG-8(圖4(i))、CG-9(圖4(j))5株轉(zhuǎn)化子的菌落形態(tài)及菌絲生長速度基本一致;CG-2(圖4(c))、CG-3(圖4(d))、CG-5(圖4(f))、CG-7(圖4(h))、CG-10(圖4(k))、CG-11(圖4(l))6株轉(zhuǎn)化子的菌落形態(tài)與野生型菌株存在顯著差異,菌絲扭結(jié)或邊緣不平整,生長速率明顯下降,說明GFP片段的插入對菌絲生長造成了影響。其中,CG-10菌絲呈淺綠色,與轉(zhuǎn)化子的熒光觀察結(jié)果一致,可能與GFP基因顯著高表達(dá)相關(guān)。

圖4 野生型及轉(zhuǎn)化子在PDA平板上的菌落形態(tài)Fig.4 The cultural characteristics wild type stain and transformants of C.gloeosporioides on PDA medium

2.4 致病力測定

為進(jìn)一步篩選出與野生型菌株致病力一致的熒光轉(zhuǎn)化子菌株,將野生型菌株及11株轉(zhuǎn)化子的菌餅接種于獼猴桃果實上,接種6d后觀察果實的感病癥狀,結(jié)果如圖5所示。由圖5(a)可知,野生型菌株會引起明顯的感病癥狀,接種點(diǎn)為病部中心,呈淺褐色或褐色,病斑從接種點(diǎn)向外延展,果肉呈水漬狀腐爛,病健交界處明顯。相對于野生型KFCG-W菌株,11株轉(zhuǎn)化子中CG-7轉(zhuǎn)化子(圖5(h))的致病力增加;CG-4(圖5(e))、CG-5(圖5(f))、CG-9(圖5(j))、CG-10(圖5(k))4株轉(zhuǎn)化子與野生型菌株的致病力基本一致;CG-1(圖5(b))、CG-2(圖5(c))、CG-3(圖5(d))、CG-6(圖5(g))、CG-8(圖5(i))及CG-11(圖5(l))6株轉(zhuǎn)化子的致病力減弱。

圖5 野生型菌株及轉(zhuǎn)化子菌株對獼猴桃果實的致病力表型Fig.5 The pathogenicity of wild type strain and transformants of C.gloeosporioides to kiwifruit

對果實病斑的致病力數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,以進(jìn)一步確定篩選到的轉(zhuǎn)化子與野生型無顯著差異。將顯著水平設(shè)定為0.05,根據(jù)差異顯著性標(biāo)注原理,如果2組標(biāo)注的字母中沒有重疊,說明在95%置信水平兩者具有顯著差異。如果2組標(biāo)注的字母有1個相同標(biāo)記字母,即表示2組差異不顯著。野生型菌株及轉(zhuǎn)化子菌株對獼猴桃果實的致病力差異分析結(jié)果如圖6所示。由圖6可知,與KFCG-W菌株相比,CG-7、CG-1、CG-6、CG-11、CG-3、CG-2、CG-8 7個菌株致病力與野生型差異顯著;CG-5、CG-9、CG-4、CG-10 4個菌株的致病力差異不顯著。

注:字母a～g代表差異顯著性。圖6 野生型菌株及轉(zhuǎn)化子菌株對獼猴桃果實的致病力差異分析Fig.6 The pathogenicity analysis of wild type strain and transformants of C.gloeosporioides to kiwifruit

綜合轉(zhuǎn)化子的熒光觀察、菌落形態(tài)觀察及致病力測試結(jié)果,可知CG-4及CG-9轉(zhuǎn)化子的菌落形態(tài)、菌絲生長速率、分生孢子形態(tài)、致病力與野生型無明顯差異,且熒光穩(wěn)定;其他9株轉(zhuǎn)化子均與野生型KFCG-W菌株存在一定差異。

3 討論

在絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化過程中,載體的選擇、潮霉素篩選濃度、農(nóng)桿菌濃度、培養(yǎng)基及共培養(yǎng)條件等因素直接影響轉(zhuǎn)化效率。此外,由于植物宿主及生存環(huán)境不同,不同宿主上分離得到的同一種真菌菌株在致病力、產(chǎn)孢能力及對潮霉素的敏感程度等均可能存在較大差異。研究主要針對在獼猴桃上分離到的膠孢炭疽病菌,摸索遺傳轉(zhuǎn)化體系條件及參數(shù)細(xì)節(jié)。

近年,針對從不同宿主上分離到的膠孢炭疽病菌構(gòu)建的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系研究十分有限。李偉等[13]針對芒果上分離到的膠孢炭疽菌建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系,發(fā)現(xiàn)當(dāng)潮霉素篩選質(zhì)量濃度為200μg/mL,農(nóng)桿菌在660nm處的吸光度值(optical density,OD660)為0.15,共培養(yǎng)時乙酰丁香酮摩爾濃度為200μmol/L時,選用pH值為5.5的IM共培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化效果最好;篩選到多個炭疽病的轉(zhuǎn)移脫氧核糖核酸(transferred DNA,T-DNA)插入突變體,包含菌落形態(tài)異常突變體3個,產(chǎn)孢能力下降突變體6個。王海艷等[14]以蘋果上分離到的膠孢炭疽病菌為轉(zhuǎn)化受體,利用攜帶雙元載體pBIG3C的農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化及體系優(yōu)化,認(rèn)為病菌分生孢子懸液濃度為1×105個/mL,共培養(yǎng)基中添加200μmol/L乙酰丁香酮,在共培養(yǎng)溫度22℃條件下培養(yǎng)24h時轉(zhuǎn)化效率較高;T-DNA均整合進(jìn)病菌基因組中,以單拷貝形式整合且穩(wěn)定遺傳,篩選到多株生長速率、分生孢子萌發(fā)率、附著胞形成比例、致病力顯著減低或形態(tài)異常的突變子。在此基礎(chǔ)上,畢方鋮等[15]構(gòu)建了含潮霉素抗性基因和GFP基因的雙元載體pCAMBgfp,以其為轉(zhuǎn)化載體對芒果膠孢炭疽病菌進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化,確定了最佳的潮霉素篩選質(zhì)量濃度為150μg/mL,首次篩選得到8株致病力減弱或缺失的熒光轉(zhuǎn)化子。實驗首次針對從獼猴桃宿主上分離到的膠孢炭疽病菌進(jìn)行了體系優(yōu)化,為獲得最佳的轉(zhuǎn)化效果,選用了畢方鋮等[15]構(gòu)建的雙元載體pCAMBgfp,并對病菌的分生孢子濃度、共培養(yǎng)溫度、乙酰丁香酮摩爾濃度等條件進(jìn)行了優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)囊阴６∠阃T導(dǎo)有利于載體的表達(dá)。當(dāng)潮霉素質(zhì)量濃度為160μg/mL,農(nóng)桿菌菌液吸光度OD600調(diào)整為0.2,病菌分生孢子懸浮液濃度為1×106個/mL,共培養(yǎng)基中添加200μmol/L的乙酰丁香酮,在25℃條件下避光共培養(yǎng)48h時,轉(zhuǎn)化效率相對較高且有利于單個轉(zhuǎn)化子的分辨和挑取。

病原菌的侵染過程十分復(fù)雜,涉及一系列基因的表達(dá),菌絲的快速生長、分生孢子的正常產(chǎn)生是病菌侵染和致病的前提。實驗進(jìn)一步對篩選獲得的11個轉(zhuǎn)化子進(jìn)行熒光遺傳穩(wěn)定性、菌落形態(tài)、菌絲生長速率、分生孢子形態(tài)及致病力測定,發(fā)現(xiàn)與野生型菌株相比較,CG-4及CG-9轉(zhuǎn)化子各方面無明顯差異且熒光穩(wěn)定,說明該遺傳轉(zhuǎn)化體系可有效用于構(gòu)建獼猴桃膠孢炭疽病菌的熒光菌株,用于菌株侵染機(jī)制研究。此外,與野生型菌株相比,其他9株轉(zhuǎn)化子或菌落形態(tài)改變,或菌絲生長速率變化,或致病力顯著增減,推測可能是T4轉(zhuǎn)座子的隨機(jī)插入位點(diǎn)與菌絲生長或致病力密切相關(guān),但還有待于進(jìn)一步的深入研究加以證實。其中,CG-1、CG-6、CG-8轉(zhuǎn)化子的菌絲生長速率雖未明顯改變,但致病力顯著減弱;CG-2、CG-3、CG-5、CG-7、CG-10、CG-11轉(zhuǎn)化子的菌絲生長速率顯著下降,對應(yīng)CG-2、CG-3及CG-11致病力下降,但CG-5、CG-10轉(zhuǎn)化子致病力差異不顯著,CG-7轉(zhuǎn)化子致病力反而增強(qiáng),說明菌株致病性不僅與菌絲生長速率相關(guān),還與產(chǎn)孢率、孢子萌發(fā)率、附著胞的形成等多因素綜合關(guān)聯(lián),該現(xiàn)象與蘋果膠孢炭疽病菌轉(zhuǎn)化研究一致[14]。后續(xù)可進(jìn)一步擴(kuò)大獼猴桃膠孢炭疽病菌的轉(zhuǎn)化子庫容量,結(jié)合轉(zhuǎn)化子的生物學(xué)特性及致病性分析,定位克隆病菌關(guān)鍵的生長發(fā)育及致病基因,為全面揭示其致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

該研究首次建立了獼猴桃炭疽病菌的農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化體系,為后續(xù)探索獼猴桃炭疽病菌功能基因組學(xué)研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。同時,獲得了2株菌落形態(tài)、菌絲生長速率、分生孢子形態(tài)及致病力與野生型無明顯差異且熒光穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子(CG-4、CG-9),為系統(tǒng)研究該菌的侵染定殖機(jī)理奠定了材料基礎(chǔ)。此外,獲得了9株菌落形態(tài)及致病力與野生型差異顯著的突變體,可進(jìn)一步用于開展關(guān)鍵致病基因驗證。隨著我國獼猴桃產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展、栽培面積急速增長,對炭疽病的研究需求也日益增加,該研究結(jié)果有助于盡快解析獼猴桃-膠孢炭疽病菌的分子互作機(jī)制,從而提高獼猴桃產(chǎn)業(yè)應(yīng)對該病害的能力。