吳梓仟，劉晶晶，鄧高文，周 曉，蔣立文，胡嘉亮，覃業(yè)優(yōu)，劉 洋,*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南壇壇香食品科技有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

豆豉歷史悠久，因其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高且香氣特殊深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。瀏陽(yáng)豆豉是湖南傳統(tǒng)特色發(fā)酵豆制品，其歷史可追溯至唐代。在湘菜中，瀏陽(yáng)豆豉具有增鮮提味的作用，名菜“臘味合蒸”“蒸鮮魚(yú)”，便是以其作佐料，如此才有“南方人不可一日無(wú)豉”[1]的說(shuō)法。瀏陽(yáng)豆豉為曲霉型豆豉代表，以黑豆為原料，經(jīng)過(guò)清洗、浸泡、蒸煮、攤涼冷卻、制曲、晾霉、洗霉、渥堆、轉(zhuǎn)桶、渥堆、出曬等工序制成。傳統(tǒng)的制曲工藝多采用自然發(fā)酵，以曲霉為優(yōu)勢(shì)菌與其他微生物共同作用分泌眾多酶系，將原料中的蛋白質(zhì)、碳水化合物等大分子物質(zhì)降解，經(jīng)過(guò)復(fù)雜的生化反應(yīng)，產(chǎn)生大量的風(fēng)味物質(zhì)[2-3]。然而由于傳統(tǒng)豆豉發(fā)酵呈開(kāi)放式，發(fā)酵過(guò)程中易受氣候、溫度、濕度等自然條件的影響，導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)不穩(wěn)定。

純種發(fā)酵可以提高產(chǎn)品的安全性及縮減產(chǎn)品的生產(chǎn)周期，但是產(chǎn)品品質(zhì)往往不及自然發(fā)酵。文鶴等[4]利用從曲霉型豆豉后發(fā)酵過(guò)程中分離篩選得到的1 株產(chǎn)香酵母WLW用于純種豆豉發(fā)酵，結(jié)果顯示自然發(fā)酵豆豉中共檢測(cè)出87 種揮發(fā)性成分，而純種發(fā)酵豆豉中僅檢測(cè)出44 種揮發(fā)性成分，遠(yuǎn)不如自然發(fā)酵風(fēng)味豐富。李薇[5]因永川豆豉發(fā)酵周期長(zhǎng)，利用純種米曲霉（Aspergillusoryzae）制曲制做“速成豆豉”，盡管生產(chǎn)效率有所提升，但由于純種發(fā)酵參與微生物較少造成酶系單一，“速成豆豉”的揮發(fā)性物質(zhì)的含量與數(shù)量均低于傳統(tǒng)發(fā)酵，導(dǎo)致風(fēng)味不及傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉。相比純種發(fā)酵，強(qiáng)化發(fā)酵（將一種或多種外源微生物接入到未經(jīng)滅菌的原料中進(jìn)行發(fā)酵的方式）既可以模擬自然發(fā)酵過(guò)程中多菌株共同發(fā)酵的特點(diǎn)，又有利于控制微生物，降低品控風(fēng)險(xiǎn)，是實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)發(fā)酵食品工業(yè)化生產(chǎn)的重要途徑。劉琨毅等[6]利用地衣芽孢桿菌強(qiáng)化發(fā)酵普洱茶，結(jié)果顯示強(qiáng)化發(fā)酵可以明顯改善茶葉中的特征成分；Pang Xiaona等[7]選擇具有高酒精耐受性和酯酶活性的本土乳酸菌對(duì)白酒進(jìn)行強(qiáng)化發(fā)酵，最終表明強(qiáng)化發(fā)酵可有效促進(jìn)白酒中關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)乙酸乙酯的形成，從而改善白酒風(fēng)味；Merlo等[8]通過(guò)利用植物乳桿菌強(qiáng)化發(fā)酵果汁，改善了發(fā)酵果汁的味道。但目前瀏陽(yáng)豆豉強(qiáng)化發(fā)酵的研究鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)室前期從瀏陽(yáng)豆豉中鑒定并分離純化出2 株不產(chǎn)毒的優(yōu)勢(shì)黃曲霉（A.flavus）菌株[9]，但其對(duì)瀏陽(yáng)豆豉風(fēng)味品質(zhì)的影響還有待進(jìn)一步研究。鑒于此，以陜西小黑豆為原料，采用自然發(fā)酵（NF）、A.oryzae強(qiáng)化發(fā)酵、優(yōu)勢(shì)菌株（A.flavus7214、A.flavus7622）強(qiáng)化發(fā)酵以及優(yōu)勢(shì)混菌發(fā)酵（A.flavus77，A.flavus7214∶A.flavus7622=1∶1）5 種發(fā)酵方式制備瀏陽(yáng)豆豉。通過(guò)對(duì)比強(qiáng)化發(fā)酵豆豉與NF豆豉的感官評(píng)定、游離氨基酸含量、有機(jī)酸含量、揮發(fā)性成分組成以及電子鼻評(píng)價(jià)結(jié)果，科學(xué)地評(píng)價(jià)強(qiáng)化發(fā)酵對(duì)瀏陽(yáng)豆豉風(fēng)味品質(zhì)的影響。這對(duì)瀏陽(yáng)豆豉的生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化、可控化及數(shù)字化控制具有一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：實(shí)驗(yàn)室從瀏陽(yáng)豆豉分離純化得到的優(yōu)勢(shì)菌株A.flavus7214（實(shí)驗(yàn)室自藏）與A.flavus7622（CGMCC 20735）；A.flavus77（將A.flavus7214和A.flavus7622等比例混合）；A.oryzae購(gòu)于濟(jì)寧玉園生物科技有限公司。

麩皮 億鄉(xiāng)情名優(yōu)農(nóng)產(chǎn)品創(chuàng)業(yè)店；黑豆（陜西腎型小黑豆）湖南壇壇香食品科技有限公司；氯化鈉、乙腈、甲醇、無(wú)水乙醇、磷酸（均為分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；16 種氨基酸標(biāo)品、7 種有機(jī)酸標(biāo)品（均為優(yōu)級(jí)純）長(zhǎng)沙隆和化波實(shí)驗(yàn)用品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1100 services型島津LC-20a液相色譜儀、7890B 5977型氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀美國(guó)Agilent 公司；PEN3 電子鼻 德國(guó)Airsense公司；TG16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī) 湘潭湘儀儀器有限公司；DFY-10000D型搖擺式高速磨粉機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司；BSa224S分析天平 德國(guó)Sartorius有限公司；57330-U型手動(dòng)SPME進(jìn)樣器、57310-U型聚二甲基硅氧烷萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）美國(guó)Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 瀏陽(yáng)豆豉的制備

1.3.1.1 強(qiáng)化菌株制備

按照麩皮∶蒸餾水=1∶0.95混勻作為菌種擴(kuò)配的培養(yǎng)基，加入到300 mL錐形瓶中（1.5 cm厚）；121 ℃高壓蒸汽鍋滅菌25 min。冷卻至室溫，把保存菌種斜面接入到培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h。

1.3.1.2 工藝流程

選擇新鮮的黑豆→清洗→浸泡→蒸煮（2 h）→攤涼冷卻→NF/強(qiáng)化發(fā)酵制曲（3～7 d，28～35 ℃）→晾霉（1～2 d）→洗霉→渥堆（1～2 d，室溫）→轉(zhuǎn)桶（加3%鹽）→渥堆（1～2 d，室溫）→出曬（1～2 d）→成品

1.3.2 游離氨基酸測(cè)定

參照GB/T 30987—2020《植物中游離氨基酸的測(cè)定》[10]，采用高效液相色譜法。

1.3.3 有機(jī)酸測(cè)定

參考GB/T 5009.157—2016《食品中有機(jī)酸的測(cè)定》[11]，采用高效液相色譜法。有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如表1所示。

表1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線特征Table 1 Retention times and quantitative calibration curves for organic acids

1.3.4 電子鼻測(cè)定

參考Wang Shuyan等[12]電子鼻測(cè)定方法并稍作修改。直接將進(jìn)樣針頭插入含樣品的密封樣品瓶中進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定條件：采樣時(shí)間1 s/組；傳感器自清洗時(shí)間120 s；傳感器歸零時(shí)間10 s；樣品準(zhǔn)備時(shí)間5 s；進(jìn)樣流量600 mL/min；分析采樣時(shí)間120 s。電子鼻傳感器性能描述如表2所示。

表2 傳感器性能描述Table 2 Sensor performance description

1.3.5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定

1.3.5.1 豆豉香味物質(zhì)的提取

將萃取頭插入氣相色譜進(jìn)樣口，在250 ℃老化25 min；與此同時(shí)將2 g樣品與20 mL飽和氯化鈉溶液放置于50 mL頂空瓶中，將頂空瓶置于恒溫水浴磁力攪拌鍋中，在70 ℃預(yù)熱10 min，將老化完畢的萃取頭穿過(guò)密封墊插入頂空進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)后推出纖維頭（距離樣品表面約10 mm），頂空吸附40 min后插入氣相色譜進(jìn)樣口解吸5 min即可。

1.3.5.2 豆豉香味物質(zhì)的分析鑒定

采用GC-MS對(duì)提取出來(lái)的香味物質(zhì)進(jìn)行分析。CD-WAX石英毛細(xì)管柱（30 mm×0.25 mm，0.25 μm）；載氣：高純氦氣（He），流速1 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；不分流進(jìn)樣。程序升溫：起始柱溫為40 ℃，保持5 min后，以3 ℃/min的速率升溫至140 ℃保持5 min，再以5 ℃/min的速率升溫至210 ℃保持10 min，最后以5 ℃/min的速率升溫至240 ℃保持3 min。MS條件：電子電離源；接口溫度220 ℃，離子源溫度200 ℃，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍m/z45～500。

1.3.5.3 豆豉香味物質(zhì)的定性定量分析

利用質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)NIST 20對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定，采用面積百分比法計(jì)算揮發(fā)性化合物的相對(duì)含量。

1.3.6 感官評(píng)價(jià)

參考并修改張佳男[13]感官評(píng)定方法。采用排序試驗(yàn)法對(duì)不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵瀏陽(yáng)豆豉成品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，感官評(píng)價(jià)于（25±2）℃的感官評(píng)價(jià)室進(jìn)行，對(duì)5 位來(lái)自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院的科研人員進(jìn)行感官評(píng)定培訓(xùn)。滋味強(qiáng)度采用10 點(diǎn)線性坐標(biāo)，0（極弱）～10（極強(qiáng)），品評(píng)人員對(duì)每個(gè)樣品與標(biāo)品進(jìn)行比較打分，其中2.5/5/7.5/10 分分別對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品含量，具體感官評(píng)價(jià)打分標(biāo)準(zhǔn)參考表3。

表3 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Criteria for sensory evaluation of Douchi

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件、WinMuster、GM-MS分析軟件等分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；用Excel、DataGraph、OmicStudio tools（https://www.omicstudio.cn/tool）等進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉游離氨基酸結(jié)果分析

發(fā)酵時(shí)，大豆中蛋白質(zhì)被微生物分泌的蛋白酶分解為多肽和游離氨基酸[14-15]。由圖1可知，利用A.oryzae強(qiáng)化發(fā)酵豆豉，豆豉中的游離氨基酸總量下降40.70%，而分離菌株強(qiáng)化發(fā)酵可提升游離氨基酸總量，范圍為19.6%～104.3%，其中A.flavus77強(qiáng)化發(fā)酵豆豉和A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中游離氨基酸總量最高，分別為12.30%與10.40%，這可能與A.flavus7214具有高產(chǎn)蛋白酶有關(guān)[9]。通常，游離氨基酸具有一定的呈味特性，如鮮味（天冬氨酸、谷氨酸）、甜味（蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸）和苦味（纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、精氨酸）等，對(duì)形成豆豉的特殊風(fēng)味具有重要意義[8]。豆豉中苦味氨基酸的含量占比最高（A.flavus77強(qiáng)化發(fā)酵豆豉排居首位為4.03%，A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉次之為3.36%，A.oryzae強(qiáng)化發(fā)酵豆豉最低為1.57%），其次是鮮味氨基酸、甜味氨基酸，這與康蕾等[16]對(duì)不同單菌制曲豆醬氨基酸研究分析一致。此外，游離氨基酸中呈鮮味的谷氨酸含量占比最高，結(jié)果與大豆原料中含有較高的谷氨酸結(jié)論吻合[18]，其中，谷氨酸在A.flavus77強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中含量最高（2.23%），A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉次之（1.98%）。甜味氨基酸與鮮味間存在協(xié)同作用，可使鮮味增強(qiáng)[17]。甜味氨基酸含量最高的樣品為A.flavus77強(qiáng)化發(fā)酵豆豉及A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉，最低為A.oryzae強(qiáng)化發(fā)酵豆豉，含量分別為2.03%、1.67%及0.55%。

圖1 不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵瀏陽(yáng)豆豉游離氨基酸含量Fig.1 Free amino acid contents in Liuyang Douchi fermented by different strains

2.2 不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉有機(jī)酸成分分析

有機(jī)酸有助于穩(wěn)定豆豉香氣、提高豆豉品質(zhì)[19]。如圖2所示，按照不同菌種發(fā)酵瀏陽(yáng)豆豉有機(jī)酸總含量由大到小進(jìn)行排序?yàn)锳.flavus7622＞A.flavus77＞A.flavus7214＞A.oryzae＞NF，可知瀏陽(yáng)豆豉有機(jī)酸含量因強(qiáng)化發(fā)酵而提升，增幅范圍在0.08～0.55 mg/g之間。所有樣品中草酸、酒石酸以及蘋(píng)果酸的含量均不足0.05 mg/g，且閾值較高，對(duì)風(fēng)味影響的不明顯。乳酸、乙酸、檸檬酸和丁二酸含量較高且各樣品間差異較大。其中乳酸為酯類物質(zhì)的前體物質(zhì)，酯類香氣化合物可因乳酸含量的增加而增多，并且由于乳酸具有柔和的口感，因此也會(huì)使豆豉的口感順滑綿長(zhǎng)[20]，除A.flavus77強(qiáng)化發(fā)酵豆豉外，其余樣品中乳酸含量較NF豆豉均有增加，A.flavus7622強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中增加幅度最大（57.24%）。乙酸味道刺激[21]，低濃度時(shí)可使豆豉口感豐富，強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中乙酸均出現(xiàn)不同程度的增長(zhǎng)（0.01～0.39 mg/g），上調(diào)最大的為A.flavus77強(qiáng)化發(fā)酵豆豉。有報(bào)道稱乳酸與乙酸比值越大，產(chǎn)品口感越柔和[22]，NF豆豉比值最高，約為119。檸檬酸酸味較強(qiáng)，口感圓潤(rùn)清爽[23]，A.flavus77與A.flavus7622強(qiáng)化發(fā)酵的豆豉中檸檬酸含量分別增加了0.10 mg/g和0.11 mg/g。丁二酸又名琥珀酸，具有酸味、咸味、苦味等特點(diǎn)，且呈味閾值低，對(duì)豆豉的風(fēng)味具有重要影響[21]。A.oryzae、A.flavus7214與A.flavus7622強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中丁二酸的含量較高，特別是A.flavus7622強(qiáng)化發(fā)酵豆豉（0.28 mg/g）。

圖2 不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵瀏陽(yáng)豆豉有機(jī)酸含量Fig.2 Contents of organic acids in Liuyang Douchi fermented by different strains

2.3 不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉揮發(fā)性成分分析

5 種不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵的瀏陽(yáng)豆豉經(jīng)過(guò)GC-MS分析共鑒定出了9 類化合物，共92 種物質(zhì)，分別為酯類（20 種）、酸類（11 種）、醛類（12 種）、酮類（9 種）、醇類（7 種）、吡嗪類（8 種）、烷烴類（10 種）、酚類（7 種）和其他化合物（8 種）。根據(jù)圖3a可知，不同樣品檢出的風(fēng)味物質(zhì)組成差異明顯。NF中吡嗪類及酸類為主要化合物，分別占其總揮發(fā)性物質(zhì)的33.84%與17.48%。A.oryzae強(qiáng)化發(fā)酵豆豉則以酸類（24.62%）、醛類（16.37%）為主；分離菌株中，A.flavus77與A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉的酸類與醛類占比最多，相較于NF均有不同程度提高，A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉分別增長(zhǎng)17.55%和7.9%，A.flavus77強(qiáng)化發(fā)酵豆豉分別提升25.76%和6.28%。A.flavus7622強(qiáng)化發(fā)酵豆豉則以酸類（13.98%）及吡嗪類（13.15%）為主，對(duì)比NF，前者上升11.21%，后者下降6.84%。整體而言，酸類、醛類和吡嗪類是5 種不同菌種發(fā)酵瀏陽(yáng)豆豉的主要化合物。N F 豆豉及強(qiáng)化發(fā)酵豆豉（A.oryzae、A.flavus7214、A.flavus7622和A.flavus77）中分別被檢測(cè)出51、57、46、41、43 種揮發(fā)性化合物，而5 種不同菌種豆豉共有的化合物僅20 種（圖3b），如乙酸、3-甲基丁醛、苯甲醛、苯乙醛、四甲基吡嗪、2-甲氧基苯酚等，而5 種不同菌種豆豉樣品的特有成分分別有12、11、7、5 種以及2 種，表明強(qiáng)化發(fā)酵能夠影響豆豉的揮發(fā)性物質(zhì)的形成，進(jìn)一步影響豆豉香氣。

圖3 不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵瀏陽(yáng)豆豉各揮發(fā)性化合物種類相對(duì)含量（a）和數(shù)量Venn圖（b）Fig.3 Relative contents of volatile compounds (a) and Venn diagram of numbers of volatile compound species (b) in Liuyang Douchi fermented by different strains

大多數(shù)酯類產(chǎn)生香味可使人心情愉悅，能夠賦予豆豉花果的香氣[24-25]。如表4所示，A.oryzae強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中酯類化合物相對(duì)含量最高，A.flavus7214略低，NF與A.flavus7622強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中酯類化合物相對(duì)含量最低。3-甲基-1-丁醇乙酸酯、苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、2-乙酸苯乙酯為5 種樣品共有物質(zhì)，但相對(duì)含量少且樣品間差異不明顯。苯乙酸甲酯、2-羥基-3-苯基丙酸乙酯、十六烷酸甲酯、亞油酸乙酯、2-甲基丁酸乙基酯、9,15-十八碳二烯酸甲酯、十八碳烯酸乙酯、十八烷酸乙酯均為強(qiáng)化發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物。其中亞油酸乙酯僅在A.flavus7622和A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中存在，且在A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中相對(duì)含量較高（4.95%），亞油酸乙酯是一種能產(chǎn)生果香味的高級(jí)脂肪酸[21]，能使瀏陽(yáng)豆豉香味更加協(xié)調(diào)、濃郁。

表4 不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵瀏陽(yáng)豆豉揮發(fā)性成分Table 4 Volatile components of Liuyang Douchi fermented by different strains

醛類物質(zhì)主要由不飽和脂肪酸的氧化以及Strecker降解兩條路徑產(chǎn)生，閾值較低，對(duì)豆豉風(fēng)味貢獻(xiàn)較大[26-27]。如表4所示，5 種樣品的醛類化合物相對(duì)含量由大到小分別為：A.oryzae、A.flavus7214、A.flavus7622、A.flavus77、NF。其中3-甲基丁醛、苯甲醛和苯乙醛相對(duì)含量最高，且為5 種豆豉的共有物質(zhì)。3-甲基丁醛具有獨(dú)特的麥芽味、堅(jiān)果味、巧克力味，閾值較低（0.06 μg/kg）[28-29]，其在A.oryzae與A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中相對(duì)含量最高，比NF分別提升了127.70%與98.65%。苯甲醛廣泛存在于植物中，具有堅(jiān)果香味，可為豆豉提供類似醬油的咸香和醬香[30]。與NF豆豉相比，強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中苯甲醛均有不同程度增加，其中A.flavus7214與A.flavus7622強(qiáng)化發(fā)酵對(duì)苯甲醛相對(duì)含量提升幅度最大（均為69%）。苯乙醛可為豆豉提供花香、甜香、蜂蜜香[31]。強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中苯乙醛相對(duì)含量均高于NF豆豉。強(qiáng)化發(fā)酵還會(huì)產(chǎn)生一些新的物質(zhì)，反-2-壬烯醛為A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉的特征成分，其主要由酯類與游離脂肪酸反應(yīng)及糖化時(shí)不飽和脂肪酸氧化而產(chǎn)生[32]，呈現(xiàn)出黃瓜味與烤肉味[33]。2-庚醛則為A.flavus7622強(qiáng)化發(fā)酵豆豉的特征成分，具有草香氣味[34]。2-八烯醛僅在A.flavus7214及A.flavus77強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中產(chǎn)生，可給予豆豉似黃瓜的清香味[35]。

吡嗪是由蛋白質(zhì)/氨基酸熱分解及蛋白質(zhì)/氨基酸與糖發(fā)生美拉德反應(yīng)產(chǎn)生[36]。如表4所示，5 種樣品中，NF的吡嗪類物質(zhì)相對(duì)含量最高，其次依次是A.flavus7622強(qiáng)化發(fā)酵豆豉、A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉、A.oryzae強(qiáng)化發(fā)酵豆豉及A.flavus77強(qiáng)化發(fā)酵豆豉。四甲基吡嗪與2,3,5-三甲基-6-乙基吡嗪是5 種樣品共有的物質(zhì)。呈現(xiàn)醬香味的四甲基吡嗪相對(duì)含量最多，通常與細(xì)菌代謝有關(guān)[30]，強(qiáng)化發(fā)酵時(shí)曲霉數(shù)量的增加可能導(dǎo)致細(xì)菌增殖和代謝被抑制，因此強(qiáng)化發(fā)酵豆豉所產(chǎn)生的四甲基吡嗪相對(duì)含量不及NF豆豉。

酸類物質(zhì)多具有刺激性氣味[37]，如表4所示，強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中酸類化合物相對(duì)含量均高于NF豆豉，其中A.flavus77強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中酸類化合物相對(duì)含量最高（43.21%）。乙酸是相對(duì)含量最高的酸類化合物，相較于NF豆豉，強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中乙酸相對(duì)含量均有不同程度增加，A.flavus7622強(qiáng)化發(fā)酵豆豉相對(duì)含量提升幅度最大，為9.38%，此結(jié)果與有機(jī)酸結(jié)果不一致，可能由于在發(fā)酵過(guò)程中豆豉會(huì)同時(shí)產(chǎn)生揮發(fā)性和非揮發(fā)性酸，而使用GC-MS檢測(cè)未經(jīng)處理的樣品時(shí)，僅可識(shí)別到樣品中揮發(fā)性酸[38]。

酚類物質(zhì)一般呈現(xiàn)煙熏香與木香[39]，如表4所示，強(qiáng)化發(fā)酵豆豉的酚類化合物相對(duì)含量不及NF豆豉高。醇類物質(zhì)多來(lái)源于微生物對(duì)糖/氨基酸的發(fā)酵代謝作用[26]，其相對(duì)含量總量為A.oryzae＞A.flavus7622＞NF＞A.flavus7214＞A.flavus77。酮類化合物一般通過(guò)不飽和脂肪酸氧化/降解及氨基酸降解產(chǎn)生，通常表現(xiàn)出花香和果香[40]。但其在5 種樣品中整體差異不大，且相對(duì)含量較低，對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn)有限。烴類化合物盡管相對(duì)含量不低，但其閾值通常較高，因此對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味貢獻(xiàn)不大[41]。

2.4 不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉電子鼻結(jié)果分析

如圖4a所示，不同傳感器對(duì)樣品表現(xiàn)出不同的響應(yīng)強(qiáng)度，其中W5S（靈敏度大，對(duì)氮氧化合物靈敏）、W1S（對(duì)短鏈烷烴靈敏）、W1W（對(duì)硫化物靈敏）、W2W（芳香成分，對(duì)有機(jī)硫化物靈敏）四個(gè)傳感器對(duì)豆豉的響應(yīng)值較高（響應(yīng)值＞4）。A.oryzae強(qiáng)化發(fā)酵豆豉在W1S的響應(yīng)值最高，可見(jiàn)其短鏈烷烴含量較多，A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵的瀏陽(yáng)豆豉在W5S、W1W、W2W的響應(yīng)值最高，說(shuō)明A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵的豆豉中氮氧化合物、芳香化合物以及硫化物含量較高。各樣品在其余6 個(gè)傳感器的響應(yīng)值較低且差異較小。整體上看，NF和A.flavus7622強(qiáng)化發(fā)酵豆豉的雷達(dá)分析圖譜幾乎重疊，提示這兩種發(fā)酵方式生產(chǎn)的豆豉主要揮發(fā)性化合物較為相似。

圖4 不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵瀏陽(yáng)豆豉電子鼻雷達(dá)（a）及PCA（b）圖Fig.4 Radar map (a) and PCA plot (b) of Liuyang Douchi fermented by different strains based on electronic nose data

選取80～83 s的信號(hào)作為電子鼻分析的時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)樣品平行測(cè)定4 次進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）。PCA是將采集到的傳感器響應(yīng)值信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換、降維，并將其線性分類，包含PC1、PC2方差貢獻(xiàn)率。方差貢獻(xiàn)率越高，說(shuō)明該指標(biāo)能較好地反映原多指標(biāo)信息。一般情況下，總貢獻(xiàn)率在70%～80%以上時(shí)可使用[42]。由圖4b可知，5 種樣品在PC1貢獻(xiàn)率為91.61%，PC2貢獻(xiàn)率為7.78%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為99.39%，基本涵蓋了樣品的大部分原始信息，且差異主要表現(xiàn)在PC1上。不同菌種瀏陽(yáng)豆豉樣品在氣味上有所差異，A.flavus7622強(qiáng)化發(fā)酵豆豉與NF豆豉部分重疊，可見(jiàn)其氣味相近。A.flavus7214樣品與其他4 種樣品相互之間距離相對(duì)較遠(yuǎn)，其氣味與其他4 種樣品區(qū)別較大。

2.5 不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉感官評(píng)價(jià)結(jié)果分析

如圖5所示，A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉香味得分明顯高于其他樣品，A.flavus7622強(qiáng)化發(fā)酵豆豉評(píng)分最低。這可能因?yàn)锳.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中對(duì)香味貢獻(xiàn)最大的酯類、醛類以及酸類成分均明顯高于NF（圖3a）。在滋味方面，強(qiáng)化發(fā)酵豆豉的鮮味與咸味增加最明顯。鮮味在5 種樣品中普遍較強(qiáng)，根據(jù)李學(xué)賢等[17]對(duì)游離氨基酸改善作物風(fēng)味的綜述內(nèi)容可推測(cè)與甜味氨基酸與鮮味的協(xié)同作用有關(guān)（圖1）。從結(jié)果看，分離菌株強(qiáng)化發(fā)酵可以增進(jìn)豆豉的鮮味，尤其是A.flavus7214及A.flavus77強(qiáng)化發(fā)酵豆豉鮮味強(qiáng)度較高，較NF相比評(píng)分高約30%，與鮮味游離氨基酸結(jié)果一致（圖1）。A.flavus77的咸味提升最明顯（從3.6 分升至5.0 分），這可能是由于豆豉中濃度較高的鮮味氨基酸提升了舌頭對(duì)咸味的感知[43]。適當(dāng)?shù)乃嵛犊梢越o豆豉滋味增加一定層次感，僅A.flavus77發(fā)酵豆豉強(qiáng)度低于NF，A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉酸味較強(qiáng)（4.0 分），與有機(jī)酸結(jié)果有較小差異，可能與有機(jī)酸之間的協(xié)同、掩蔽及抑制作用有關(guān)[22]，同時(shí)有機(jī)酸閾值高低也會(huì)對(duì)感官結(jié)果產(chǎn)生影響[44-45]?？辔峨m不愉悅，但是可以增加一定的豐富度。除A.oryzae強(qiáng)化發(fā)酵豆豉外，其余樣品豆豉的苦味均強(qiáng)于NF豆豉，其中A.flavus77強(qiáng)化發(fā)酵豆豉苦味感知最強(qiáng)，為4.8 分，這可能與豆豉中呈苦味游離氨基酸的增加有關(guān)（圖1）。甜味作為大眾接受度最高的滋味，只有A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉強(qiáng)于NF豆豉，其余樣品甜味均弱于NF豆豉。綜上，風(fēng)味變化最明顯的為A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉。

圖5 不同菌種強(qiáng)化發(fā)酵瀏陽(yáng)豆豉感官雷達(dá)圖Fig.5 Sensory evaluation radar map of Liuyang Douchi fermented by different strains

3 結(jié)論

分離菌株強(qiáng)化發(fā)酵豆豉對(duì)比NF豆豉，游離氨基酸與有機(jī)酸總量分別提升19.6%～104.3%和0.08～0.55 mg/g。特別是A.flavus77菌株強(qiáng)化發(fā)酵對(duì)谷氨酸以及乙酸釋放的促進(jìn)效果明顯（分別提升108.41%和182.24%），說(shuō)明強(qiáng)化發(fā)酵有助于瀏陽(yáng)豆豉的蛋白降解及有機(jī)酸的形成。通過(guò)GC-MS從各豆豉樣品中鑒定出9 類化合物共92 種物質(zhì)，其中酯類化合物種類最豐富（20 種），酸類化合物總計(jì)相對(duì)含量最高，共有的揮發(fā)性化合物僅20 種。較NF相比，強(qiáng)化發(fā)酵豆豉的酯類、醛類以及酸類化合物含量有明顯增長(zhǎng)，特別是苯乙醛與苯甲醛，給予豆豉花香、堅(jiān)果香。此外，強(qiáng)化發(fā)酵還會(huì)生成一些新的揮發(fā)性化合物，如散發(fā)果香味的亞油酸乙酯、帶來(lái)清香的2-八烯醛。電子鼻數(shù)據(jù)顯示，A.flavus7622強(qiáng)化發(fā)酵豆豉與NF豆豉差異最小。而A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉與其他樣品差異明顯，且對(duì)氮氧化合物、芳香成分及有機(jī)硫化物更為靈敏。感官評(píng)價(jià)結(jié)果亦顯示，A.flavus7214強(qiáng)化發(fā)酵豆豉整體風(fēng)味更好，香味突出（6.0 分），鮮味與甜味也較強(qiáng)（分別為6.0 分和3.6 分）。綜上，強(qiáng)化發(fā)酵可以通過(guò)促進(jìn)游離氨基酸、有機(jī)酸以及揮發(fā)性化合物質(zhì)的釋放，實(shí)現(xiàn)對(duì)豆豉風(fēng)味的調(diào)控。本研究有助于揭示強(qiáng)化發(fā)酵對(duì)瀏陽(yáng)豆豉品質(zhì)的影響，可為瀏陽(yáng)豆豉的生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化、可控化以及工廠化生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。