李俊杰 賈鵬 劉功穩(wěn) 張睿智 劉寶山 王愛飛 徐又佳*

1.蘇州大學附屬第二醫(yī)院骨科/骨質疏松癥臨床中心,江蘇 蘇州 215004 2.南京中醫(yī)藥大學蘇州附屬醫(yī)院骨傷科,江蘇 蘇州 215004

骨質疏松癥是一種嚴重危害中老年人群骨骼健康的慢性疾病。隨著社會人口老齡化日益加劇,我國骨質疏松癥患病率逐漸攀升,骨質疏松癥負擔逐年增加[1-2]。2018年我國居民骨質疏松癥流行病學調查顯示,65歲以上人群骨質疏松癥患病率為32.0%,其中女性人群的骨質疏松癥患病率高達51.6%[3]。因此,骨質疏松癥的長期管理亟待解決。

口服遞送是利用人體的生理腔道進行全身性治療的一種給藥途徑,具有非侵入性、低成本和給藥方便等特點[4]。因此,口服藥物遞送是目前大多數慢性疾病的主要給藥方式。然而,復雜的胃腸道生理環(huán)境(胃內酸性環(huán)境、大量消化酶和腸道的黏液/黏膜屏障等)可導致口服藥物降解失活及生物利用度降低。所以,口服藥物遞送在“藥物制劑”領域一直是臨床工作的研究重點[5-6]。為了克服胃腸道屏障的限制,目前利用微/納米技術已經開發(fā)了多種口服遞送載體,包括納米顆粒、微球、微針及微型注射器等,在口服遞送領域取得許多進展[7]。

在抗骨質疏松癥藥物研究領域,口服制劑的改良既要克服復雜的胃腸道環(huán)境,保持藥物活性,還要將藥物精準遞送至骨組織并產生作用,目前口服骨靶向遞送的相關研究鮮有報道。天冬氨酸八肽(Asp8)是具有8個重復序列天冬氨酸的寡肽,能夠特異性結合羥基磷灰石,從而靶向破骨細胞覆蓋的骨吸收表面[8]。多面體低聚倍半硅氧烷(POSS)作為一種新型納米材料,獨特的Si-O-Si三維籠狀結構上可以修飾不同功能基團,是構筑智能復合材料的理想平臺[9]。此外,POSS具有良好的生物相容性和生物降解性等優(yōu)點,廣泛用于藥物遞送、組織再生和細胞成像等[10-11]。為避免納米顆粒在胃腸道中降解及促進腸道吸收,使用海藻酸鹽和殼聚糖形成的水凝膠微球包裹納米顆粒,有助于提高口服藥物的生物利用度[12]。

本研究以新型納米材料POSS為平臺,通過點擊化學將去鐵胺(DFO)、Asp8和聚乙二醇(PEG)接枝到POSS,合成具有骨靶向的納米顆粒(BTNP)。進一步基于氣體微流控和離子交聯技術制備一種新型口服骨靶向微/納水凝膠微球(BTNP@Alg/Cs),并探討其在體外的生物相容性以及對雌性去勢小鼠骨質量的影響,為防治絕經后骨質疏松癥提供一種新的策略。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1主要試劑:甲磺酸去鐵胺(美國Sigma-Aldrich公司);天冬氨酸八肽(上海強耀生物科技有限公司);聚乙二醇、丙烯酰氯、四氫呋喃和安息香二甲醚(國藥集團有限公司);海藻酸鈉(美國Sigma-Aldrich公司);殼聚糖(上海麥克林公司);大鼠骨髓間充質干細胞(蘇州賽業(yè)生物科技有限公司);DMEM高糖培養(yǎng)基(美國HyClone公司);胎牛血清(以色列Biological Industries公司);活/死細胞染色試劑盒(武漢Proteintech公司);巰基化POSS(POSS-SH,由上海市傷骨科研究所再生醫(yī)學材料實驗室提供)。

1.1.2主要儀器:透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司);熒光顯微鏡(德國ZEISS公司);掃描電子顯微鏡觀察(德國ZEISS公司);小動物活體成像系統(tǒng)(美國PerkinElmer公司);微型計算機斷層掃描(Micro-CT;比利時Skyscan公司);Instron 5569材料測試系統(tǒng)(美國Instron公司)。

1.2 材料制備及性能表征

1.2.1骨靶向納米顆粒的制備及表征方法:參考之前的方法[13],取50.0 mL三口燒瓶,將2.032 g POSS-SH、0.363 mg PEG-Ac和0.015 g安息香二甲醚溶解在20.0 mL的四氫呋喃中。室溫條件下,使用365 nm紫外燈照射反應2.5 h,隨后將溶解在10.0 mL四氫呋喃中的0.032 g DFO-Ac、0.120 g 安息香二甲醚和0.097 g Asp8-Ac加入,紫外燈照射反應8 h,旋轉蒸發(fā)去除溶劑,得到目標產物骨靶向納米顆粒(圖1)。采用透射電子顯微鏡觀察骨靶向納米顆粒形態(tài)。

圖1 合成骨靶向納米顆粒的化學反應

1.2.2微/納水凝膠微球的制備與表征方法:采用氣體微流控和離子交聯技術制備水凝膠微球[14]。簡言之,1%海藻酸鈉溶液(w/v)通過同軸針頭注入,同軸針頭的另一端連接氮氣,氮氣流產生的剪切力(1.0 L/min)將其切割成均質液滴,液滴在重力作用下滴落到氯化鈣水溶液(100 mmol/L)中。由于鈣離子交聯海藻酸鹽,形成水凝膠微球的核心。收集海藻酸鈣水凝膠微球,去離子水洗滌,清除表面殘留的離子。然后將其浸于1%殼聚糖水溶液(w/v)中,37 ℃中100 r/min恒溫震蕩30 min。殼聚糖均勻覆蓋在海藻酸鈣水凝膠微球表面。收集水凝膠微球,去離子水洗滌3次,清除多余的殼聚糖溶液。制備微/納水凝膠微球時,將骨靶向納米顆粒溶于海藻酸鈉溶液,超聲30 min,形成分散均一的混合液,其余步驟相同。

水凝膠微球避光保存在4 ℃中,采用光學顯微鏡觀察水凝膠微球形態(tài)。水凝膠微球在-80 ℃中過夜,然后放置在真空冷凍干燥機進行干燥72 h,采用掃描電子顯微鏡觀察凍干的水凝膠微球表面形貌。

1.3 水凝膠微球的生物相容性實驗

采用活/死細胞染色評估水凝膠微球的細胞毒性。簡言之,取無菌空白水凝膠微球和微/納水凝膠微球浸于DMEM高糖培養(yǎng)基中,浸泡3 d后過濾得到浸出液。將大鼠骨髓間充質干細胞種板于24孔板,分別加入相應浸出液,將細胞置于37 ℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中,并于第1和3天用Calcein AM/PI緩沖液孵育15 min后,在熒光顯微鏡下觀察活細胞(綠色)或死細胞(紅色)數目。

1.4 骨靶向性能檢測

本研究采用FITC分別標記骨靶向納米顆粒和無骨靶向納米顆粒(相比于骨靶向納米顆粒,制備時不加入Asp8)。通過尾靜脈注射至8周齡雌性C57BL/6小鼠,8 h后處死小鼠,收集小鼠股骨,采用小動物活體成像系統(tǒng)觀察藥物在骨組織中的分布情況。

1.5 實驗動物

1.5.1模型制作:動物實驗研究由蘇州大學附屬第二醫(yī)院倫理委員會批準(SUDA20200424A04)。選用8周齡雌性C57BL/6小鼠18只,隨機分為去卵巢組(A組)、空白水凝膠微球組(B組)和微/納水凝膠微球組(C組),每組6只。骨質疏松癥模型構建方法參考之前的報道[15],3組小鼠麻醉后取仰臥位,于下腹部作一長約1.5 cm的橫行切口,打開腹腔后可見輸卵管,逆行找到卵巢,結扎輸卵管后完整切除卵巢,逐層縫合切口。所有小鼠均飼養(yǎng)于蘇州大學SPF級動物中心,溫度維持在23 ℃～25 ℃,相對空氣濕度保持在45%～55%,每天光照時間為12 h。

1.5.2藥物干預:模型制作成功后休息1周,1周后3組小鼠均給予灌胃。將水凝膠微球浸于1%羧甲基纖維素鈉溶液,空白水凝膠微球組小鼠給予20 mg空白水凝膠微球+2 mL 1%羧甲基纖維素鈉溶液,微/納水凝膠微球組小鼠給予20 mg微/納水凝膠微球+2 mL 1%羧甲基纖維素鈉溶液,去卵巢組小鼠僅給予2 mL 1%羧甲基纖維素鈉溶液。灌胃時間:每日1次,連續(xù)干預8周后收集小鼠股骨標本。

1.5.3Micro-CT檢測:收集小鼠股骨并剔除骨組織周圍肌肉,然后將股骨置于Micro-CT樣品檢測板中固定。參考文獻選取股骨遠端松質骨感興趣區(qū)域進行掃描及三維重建[16]。掃描條件:9 μm分辨率,50 kV電壓,500 mA電流。測量以下骨小梁參數并進行組間比較,包括骨密度(g/cm3)、骨體積分數(%)、骨小梁數目(1/mm)和骨小梁間隙(μm)。

1.5.4三點彎曲測試:將制備好的股骨放置于Instron 5569材料測試系統(tǒng)兩點支架上,髕骨面朝上,進行股骨三點彎曲測試。調整載荷和位移,設置實驗速度為3 mm/min,開始對股骨施加負荷,直至股骨斷裂結束。記錄最大載荷(N)和斷裂能(mJ)。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 9.0 對數據進行統(tǒng)計學處理和分析。計量資料以均數±標準差表示。3組之間采用單因素方差分析,多重比較采用Tukey檢驗,P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 骨靶向納米顆粒的合成及表征

本研究通過硫醇-烯烴點擊化學將去鐵胺,Asp8和聚乙二醇接枝到POSS-SH,一鍋法合成具有骨靶向的納米顆粒。透射電子顯微鏡圖像顯示,骨靶向納米顆粒具有均勻的球形形貌,平均粒徑為40.6 nm(圖2)。

圖2 骨靶向納米顆粒的透射電子顯微鏡圖像

2.2 微/納水凝膠微球的制備與表征

將上述制備的骨靶向納米顆粒溶于海藻酸鈉溶液中,通過氣體微流控技術制備海藻酸鈉水凝膠微球,微球在氯化鈣溶液中迅速成膠。然后基于靜電作用,殼聚糖均勻包裹在海藻酸鈣微球表面,形成殼-核結構的微/納水凝膠微球。光學顯微鏡圖像顯示,微/納水凝膠微球呈球形形貌,平均粒徑為250.8 μm(圖3A)。掃描電子顯微鏡圖像顯示,微/納水凝膠微球表面粗糙,形成較多皺褶,這是由水凝膠微球表面包裹的殼聚糖形成(圖3B)。

圖3 微/納水凝膠微球的形態(tài)

2.3 微/納水凝膠微球的生物相容性實驗

本研究采用活/死細胞染色評估微/納水凝膠微球對大鼠骨髓間充質干細胞的毒性影響[17]。活/死細胞染色結果顯示,與對照組相比,在第1天和第3天,空白水凝膠微球浸出液和微/納水凝膠微球浸出液對大鼠骨髓間充質干細胞均無明顯毒性(圖4)。以上結果表明,本研究制備的微/納水凝膠微球具有良好的生物相容性。

圖4 微/納水凝膠微球的生物相容性

2.4 骨靶向性能檢測

如圖5所示,相比于注射無骨靶向納米顆粒,尾靜脈注射骨靶向納米顆粒的小鼠股骨中信號分布均勻,呈現明顯的高信號。因此,本研究制備的含有Asp8的骨靶向納米顆粒具有明顯的骨靶向性能。

圖5 不同納米顆粒在小鼠股骨內的熒光分布

2.5 微/納水凝膠微球對雌性去勢小鼠骨質量的影響

本研究選取小鼠股骨行Micro-CT掃描并進行股骨遠端三維重建,評估小鼠骨質量變化情況。Micro-CT結果顯示,A組小鼠股骨遠端表現為骨密度降低,骨小梁數量減少及骨小梁稀疏,表明成功構建絕經后骨質疏松癥模型(圖6)。C組小鼠的骨密度、骨體積分數和骨小梁數目顯著高于A組和B組小鼠,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);C組小鼠的骨小梁間隙顯著低于A組和B組小鼠,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。A組小鼠的骨密度、骨體積分數、骨小梁數目和骨小梁間隙和B組小鼠相比,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 三組小鼠骨小梁參數比較

圖6 三組小鼠股骨遠端的Micro-CT三維重建

2.6 微/納水凝膠微球對股骨生物力學性能的影響

本研究選取小鼠股骨進行三點彎曲測試評估股骨生物力學性能。C組小鼠的最大載荷和斷裂能顯著優(yōu)于A組和B組小鼠,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。A組小鼠的最大載荷和斷裂能和B組小鼠相比,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 三組小鼠骨生物力學性能比較

3 討論

藥物干預是防治骨質疏松癥和骨質疏松性骨折發(fā)生的有效措施,當前抗骨質疏松癥藥物的給藥方式以口服遞送為主。然而,傳統(tǒng)口服制劑存在胃腸道不良反應、腸道吸收速度慢和生物利用度低等缺點,導致患者依從性下降。隨著生物材料的不斷發(fā)展,利用微/納米技術和骨靶向性基團開發(fā)的新型口服遞送系統(tǒng)可以實現克服生理屏障、藥物緩/控釋和精準遞送,是目前藥物遞送領域的研究熱點。

去鐵胺是一種臨床上應用的Fe3+螯合劑,通過靜脈或肌肉注射治療各種原因引起的鐵過載疾病。已有研究報道,去鐵胺可以促進雌性去勢小鼠骨內H型血管生成,緩解骨量丟失[18-19]。國內學者進行的前瞻性臨床試驗也證實了去鐵胺在治療絕經后骨質疏松癥的可行性[20]。然而,去鐵胺口服吸收差,體內半衰期短,持續(xù)給藥會引起諸多副作用[21]。骨靶向藥物遞送系統(tǒng)是利用骨靶向基團將藥物遞送至骨組織或骨特異性細胞,以增強治療效果和減少藥物帶來的副作用[22]。Guo等[23]合成一種具有骨靶向的去鐵胺衍生物(SF-DFO),給予腹腔注射SF-DFO后明顯提高去勢小鼠骨量,且減少生物毒性。因此,本研究創(chuàng)新性地通過硫醇-烯烴點擊化學將去鐵胺和Asp8接枝到納米顆粒,實現口服藥物的骨靶向遞送。點擊化學通過模塊化的拼接,簡單、快速且可靠地完成化學合成。由于點擊化學反應條件溫和、副產物無害等優(yōu)勢,在生物醫(yī)學領域同樣發(fā)揮著重要作用[24]。

海藻酸鈉和殼聚糖是兩種美國食品藥品管理局批準的天然多糖,具有良好的生物相容性,被廣泛用于口服遞送藥物和細胞等[25]。由于海藻酸鹽的羧基和殼聚糖的氨基之間形成聚電解質復合物,水凝膠微球在酸性環(huán)境中收縮,可以保護藥物免受胃酸破壞。此外,殼聚糖結構中的氨基攜帶正電荷,通過靜電作用與腸道黏膜表面的黏蛋白結合,同時還可以打開腸上皮細胞間的緊密連接,延長藥物滯留時間,增強藥物細胞旁滲透,從而提高藥物腸道吸收率[26]?；诤Ｔ逅猁}和殼聚糖開發(fā)的腸道部位定向釋放藥物的水凝膠微球具有重要的應用潛能,該水凝膠微球有助于提高藥物生物利用度,高效治療慢性炎癥性疾病,如類風濕性關節(jié)炎和炎癥性腸病[27-28]。本研究中的活/死細胞染色實驗證實,空白水凝膠微球和微/納水凝膠微球與大鼠骨髓間充質干細胞共培養(yǎng)時均表現出良好的生物相容性,為進行體內研究奠定了生物安全性基礎?；诤Ｔ逅猁}和殼聚糖制備的水凝膠微球使納米顆粒在復雜的胃腸道環(huán)境中仍保持活性。Micro-CT和三點彎曲測試結果顯示,口服微/納水凝膠微球小鼠的骨量和生物力學性能顯著高于去卵巢小鼠,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這些結果表明,本研究制備的微/納水凝膠微球經口服遞送后,有效緩解雌性去勢小鼠骨質量丟失。

本研究尚存在一些不足之處,主要觀察新型口服骨靶向微/納水凝膠微球緩解雌性去勢小鼠骨質量丟失的效果,并未在體外研究微/納水凝膠微球對骨形成、骨吸收和血管生成的影響,將在今后的研究中進一步完善上述不足。

綜上所述,本研究以新型納米材料POSS為平臺,通過點擊化學合成具有骨靶向的納米顆粒;進一步基于氣體微流控和離子交聯技術制備一種新型口服骨靶向微/納水凝膠微球。該新型口服骨靶向微/納水凝膠微球具有良好的生物相容性,其負載的骨靶向納米顆粒有效緩解雌性去勢小鼠骨質量丟失,有望為絕經后骨質疏松癥的治療提供新的策略。