趙玉霞 劉義 景亞青 付婷 汪子涵 李光

天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)系,天津 300070

成骨不全癥(osteogenisis imperfecta,OI)又稱(chēng)脆骨癥,是一種以骨量減少、骨骼脆性增加和易骨折為主要特征的遺傳性疾病[1]。85%～90%的OI是由COL1A1或COL1A2基因突變所致,表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳[2]。1979年,Sillence等[3]根據(jù)患者的臨床特征將OI分為Ⅰ～Ⅳ型,其中Ⅰ型表型最輕,但發(fā)病率最高,Ⅱ型為胚胎致死型,Ⅲ型反復(fù)骨折常導(dǎo)致骨骼畸形,Ⅳ型嚴(yán)重程度中等。目前,OI尚無(wú)根治療法,臨床治療方案主要包括髓內(nèi)釘內(nèi)固定、手術(shù)矯形和藥物治療。骨骼是一種處于持續(xù)重建過(guò)程的動(dòng)態(tài)活性組織,成骨分化和破骨吸收保持動(dòng)態(tài)平衡是其正常結(jié)構(gòu)和功能維持的基礎(chǔ)[4]。研究發(fā)現(xiàn),OI患者或模型小鼠中均存在單位骨形成下降而破骨細(xì)胞增多的異常表現(xiàn)[5],是一些藥物、干細(xì)胞輸注和基因治療等策略的干預(yù)靶標(biāo)。目前臨床應(yīng)用最為廣泛的雙膦酸鹽類(lèi)藥物主要通過(guò)抑制破骨細(xì)胞活性或誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡來(lái)抑制骨吸收,進(jìn)而使患者骨密度增加,但這類(lèi)藥物在體內(nèi)半衰期長(zhǎng),同時(shí)存在胃腸道刺激、高熱、肌痛、乏力等副作用[6]。因此,尋找促進(jìn)成骨分化、抑制破骨吸收的新藥物對(duì)OI患者意義重大。

替格瑞洛(Ticagrelor)是一種可逆的腺苷二磷酸(adenosine diphosphate,ADP)受體P2Y12拮抗劑,可抑制ADP引起的血小板聚集,主要應(yīng)用于心腦血管疾病的預(yù)防和治療[7]。研究表明P2Y12受體不僅表達(dá)于血小板和腦組織,還表達(dá)于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞,并能影響其細(xì)胞功能[8-9]。Su等[10]將小鼠的P2Y12受體敲除后發(fā)現(xiàn)其破骨細(xì)胞活性降低,并可以部分緩解衰老、卵巢摘除等所致的骨丟失,提示阻斷P2Y12受體可抑制病理性骨吸收。Mediero等[11]研究發(fā)現(xiàn),替格瑞洛不僅可以在體外抑制破骨細(xì)胞分化并促進(jìn)成骨細(xì)胞分化,還可在顱骨缺損小鼠模型中促進(jìn)骨形成。OI中也存在成骨細(xì)胞骨形成下降和破骨細(xì)胞數(shù)量增多、活性增強(qiáng)的異常改變[5],替格瑞洛對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用可能會(huì)使OI患者獲益,但目前尚無(wú)替格瑞洛治療OI的研究報(bào)道。本研究采用灌胃的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的Col1a1雜合突變的Ⅰ型成骨不全小鼠模型(Col1a1+/-365小鼠)進(jìn)行替格瑞洛干預(yù)治療,評(píng)估其促進(jìn)Col1a1+/-365的骨形成的效果,探究其作用機(jī)制,為成骨不全的臨床用藥提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:野生型(WT)C57/BL6雄性小鼠及基因型為Col1a1+/-365的C57/BL6小鼠,8周齡,體質(zhì)量20～22 g。

1.1.2主要試劑:組織基因組提取試劑盒(美國(guó)Biomiga公司);替格瑞洛(上海阿拉丁公司);Trizol試劑(美國(guó)Life Technologies公司);cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Promega公司);熒光定量PCR試劑盒(德國(guó)Qiagen公司);HE染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);抗酒石酸酸性磷酸酶染色液(北京索萊寶科技有限公司)。

1.1.3主要儀器:低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);Rotor-Gene Q實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(德國(guó)Qiagen公司);ABI Veriti PCR儀(美國(guó)Applied biosystems公司);科研級(jí)光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司);Skyscan 1276 Micro-CT分析儀(德國(guó)Bruker公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1Col1a1+/-365小鼠基因型鑒定:新生雄性小鼠10 d時(shí)剪取鼠尾0.3 cm提取鼠尾組織細(xì)胞DNA,以鼠尾DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),Col1a1的擴(kuò)增引物序列為:Forward:5’-CACCTACTGCGTAGGA GCCC-3’,Reverse:5’-CCCAACAGCCAGACTC TTCA-3’)。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,設(shè)置35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

1.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:實(shí)驗(yàn)分WT對(duì)照組、DMSO對(duì)照組、替格瑞洛治療組,每組各6只。DMSO對(duì)照組、替格瑞洛治療組小鼠為Col1a1+/-365小鼠。WT對(duì)照組正常飼養(yǎng),DMSO對(duì)照組給予0.2 mL含同劑量DMSO的玉米油灌胃,替格瑞洛治療組給予0.2 mL含替格瑞洛的玉米油灌胃,給藥劑量為2 mg/(kg·d),藥物干預(yù)時(shí)間為10周。

1.2.3Micro-CT檢測(cè)股骨微觀結(jié)構(gòu)的改變:將三組小鼠的股骨浸泡于4%多聚甲醛中固定24 h,選用動(dòng)物成像專(zhuān)用的Skyscan 1276 Micro-CT分析儀對(duì)小鼠的股骨進(jìn)行掃描,掃描結(jié)束后用CTAn1.15.4軟件對(duì)其進(jìn)行三維立體重構(gòu),并計(jì)算骨體積分?jǐn)?shù)(percent bone volume,BV/TV,%)、骨小梁數(shù)量(trabecular number,Tb.N,n/mm)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th,mm)和骨小梁模式因子(trabecular bone pattern factor,Tb.Pf,1/mm)等參數(shù)。

1.2.4HE、TRAP染色:將各組小鼠股骨浸泡于4%的甲醛中固定3 d,3 d后將股骨浸泡于脫鈣液中進(jìn)行脫鈣,每3 d換一次脫鈣液,脫鈣21 d,直至股骨變軟后進(jìn)行脫水處理,完成后將股骨組織浸于融化的石蠟中進(jìn)行包埋,切片機(jī)切片,厚度約3 μm。常規(guī)HE染色、TRAP染色,顯微鏡下觀察股骨骨小梁和破骨細(xì)胞的變化。

1.2.5破骨特異基因的表達(dá)檢測(cè):采用Trizol法提取各組股骨組織中的RNA,采用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA,使用SYBR Green qPCR Mix于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),檢測(cè)破骨細(xì)胞特異基因Mmp9、Ctsk和Nfatc1的表達(dá)水平,引物序列分別為:Gapdh(forward:5’-CATCACTGCCACCCAGAAGACTG-3’;reverse:5’-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3’);Mmp9(forward:5’-GCAGAGGCATACTTGTACCG-3’;reverse:5’-TGATGTTATGATGGTCCCACTTG-3’);Ctsk(forward:5’-AATA CCTCCCTCTCGATCCTACA-3’;reverse:5’-TGGTTCTTGACTGGAGTAACGTA-3’);Nfatc1(forward:5’-GGAGCGGAGAAACTTT GCG-3’;reverse:5’-GTGACACTAGGGGACACAT AACT-3’)。實(shí)時(shí)定量PCR的反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸20 s(40個(gè)循環(huán))。實(shí)驗(yàn)以Gapdh作為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理,研究數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Col1a1+/-365小鼠基因型鑒定

鼠尾細(xì)胞DNA PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳,WT小鼠PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為1 623 bp,Col1a1+/-365小鼠PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為1 623 bp和594 bp,圖1中1和2號(hào)小鼠為Col1a1+/-365小鼠,3～7號(hào)小鼠為野生型小鼠。

圖1 Col1a1+/-365小鼠基因型鑒定

2.2 替格瑞洛對(duì)小鼠股骨微觀結(jié)構(gòu)的影響

筆者前期研究顯示,與WT小鼠相比,Col1a1+/-365小鼠Ⅰ型膠原表達(dá)下降、皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨骨量均明顯減少,骨小梁數(shù)量和厚度減少、間隙增寬,皮質(zhì)骨變薄[5]。Micro-CT結(jié)果顯示,與WT組比較,DMSO對(duì)照組小鼠BV/TV、Tb.N、和Tb.Th均顯著下降(*P<0.05,**P<0.01),而Tb.Pf明顯增高(***P<0.001),與之前的報(bào)道一致。與DMSO對(duì)照組比較,Ticagrelor治療組BV/TV、Tb.N和Tb.Th均顯著增高(*P<0.05),而Tb.Pf明顯降低(*P<0.05)。而Ticagrelor治療組小鼠與WT組小鼠BV/TV、Tb.N和Tb.Th差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這些結(jié)果說(shuō)明Ticagrelor治療后Col1a1+/-365小鼠松質(zhì)骨骨量增加、骨小梁參數(shù)明顯改善,結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3 替格瑞洛對(duì)小鼠骨小梁形態(tài)的影響

替格瑞洛治療后對(duì)股骨組織切片進(jìn)行HE染色,結(jié)果顯示,與DMSO對(duì)照組相比,Ticagrelor治療組小鼠骨小梁數(shù)量增多、面積增大(圖3A)。使用image pro-plus 6軟件對(duì)骨小梁的面積進(jìn)行測(cè)量,結(jié)果顯示,Ticagrelor治療組小鼠的骨小梁面積與WT對(duì)照組小鼠無(wú)顯著差異(P>0.05);與DMSO對(duì)照組相比,Ticagrelor治療組小鼠骨小梁面積明顯增多(*P<0.05),說(shuō)明Ticagrelor可以有效地促進(jìn)Col1a1+/-365小鼠股骨松質(zhì)骨形成,結(jié)果見(jiàn)圖3B。

2.4 替格瑞洛對(duì)Col1a1+/-365小鼠破骨細(xì)胞數(shù)量的影響

替格瑞洛治療后對(duì)小鼠股骨組織切片進(jìn)行Trap染色,觀察其破骨細(xì)胞分布情況。結(jié)果顯示,與WT組小鼠比較,DMSO對(duì)照組Col1a1+/-365小鼠的破骨細(xì)胞數(shù)量顯著增加(*P<0.05),與筆者之前報(bào)道的Col1a1+/-365小鼠破骨細(xì)胞明顯增多一致。雖然Ticagrelor治療的Col1a1+/-365小鼠破骨細(xì)胞數(shù)量仍明顯高于WT組小鼠,但與DMSO對(duì)照組相比較,Ticagrelor治療組Col1a1+/-365小鼠破骨細(xì)胞顯著減少(*P<0.05),說(shuō)明Ticagrelor可以有效抑制Col1a1+/-365小鼠破骨細(xì)胞的形成,有利于骨量的累積,結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 Ticagrelor對(duì)Col1a1+/-365小鼠股骨破骨細(xì)胞的影響

2.5 替格瑞洛對(duì)小鼠破骨細(xì)胞特異基因的影響

為探究替格瑞洛抑制破骨細(xì)胞生成的潛在機(jī)制,采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)股骨組織的破骨細(xì)胞特異基因Mmp9、Ctsk和Nfatc1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,與WT組或DMSO對(duì)照組相比,Ticagrelor治療組Mmp9、Ctsk、Nfatc1的表達(dá)量均顯著降低(*P<0.05),表明替格瑞洛可以抑制Col1a1+/-365小鼠破骨細(xì)胞特異基因的表達(dá),進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞的分化,減少骨吸收,結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 Ticagrelor對(duì)Col1a1+/-365小鼠股骨破骨細(xì)胞特異性基因的影響

3 討論

OI是較常見(jiàn)的遺傳性骨病之一,以骨量降低、骨脆性增加和反復(fù)骨折為主要特征[12-13],在新生兒中患病率為1/150 000～200 000[14]。OI常常于幼年起病,輕微創(chuàng)傷后即可發(fā)生骨折,反復(fù)骨折常導(dǎo)致骨畸形,致殘率較高,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[15]。研究表明,破骨細(xì)胞骨吸收與成骨細(xì)胞骨形成的相對(duì)平衡對(duì)維持骨穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。Ⅰ型成骨不全由COL1A1基因突變導(dǎo)致的Ⅰ型膠原表達(dá)降低引起,患者主要表現(xiàn)為骨量下降和骨脆性增加,其骨形成減少、骨吸收增加是骨量下降的重要原因,但相關(guān)機(jī)制尚不明確。尋找促進(jìn)成骨分化和(或)抑制破骨吸收的臨床藥物是治療OI的主要方向之一。

作為血小板表面主要的ADP受體,P2Y12可放大血小板的活化信號(hào),其拮抗劑如氯吡格雷(Clopidogrel)和普拉格雷(Prasugrel)等藥物已被廣泛應(yīng)用于臨床心肌梗死和急性冠脈綜合征的治療[16]。近年來(lái),有研究顯示P2Y12也分布在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞表面,而且參與成骨和破骨活動(dòng)的調(diào)控。Su等[10]的報(bào)道顯示P2Y12在破骨分化的過(guò)程中發(fā)揮重要作用,敲除P2Y12受體的P2ry12-/-小鼠破骨細(xì)胞活性減弱并可防止衰老和關(guān)節(jié)炎等引起的骨丟失。同時(shí)研究顯示氯吡格雷可以防止骨腫瘤和卵巢去勢(shì)引起的骨丟失[10]。這些研究提示,P2Y12受體拮抗劑可通過(guò)對(duì)骨形成和骨吸收的調(diào)節(jié)發(fā)揮骨保護(hù)作用。

替格瑞洛是新一代的P2Y12抑制劑,其在成骨分化和破骨吸收方面發(fā)揮的作用也引發(fā)了研究者的關(guān)注。2016年,Mediero等[11]在體外誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞破骨分化過(guò)程中分別加入不同濃度的替格瑞洛進(jìn)行干預(yù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)干預(yù)組的破骨細(xì)胞數(shù)明顯低于對(duì)照組,證明替格瑞洛可以在體外抑制破骨細(xì)胞的形成。為了進(jìn)一步研究替格瑞洛在體內(nèi)的作用,研究者將含替格瑞洛的羥基磷灰石/磷酸三鈣納米材料植入顱骨缺損的小鼠模型,4周后發(fā)現(xiàn)小鼠顱骨新生骨體積明顯多于單純羥基磷灰石/磷酸三鈣植入組,證明替格瑞洛可以有效地促進(jìn)骨形成。然而,目前尚無(wú)替格瑞洛治療成骨不全的相關(guān)研究和報(bào)道。

因此,本實(shí)驗(yàn)選用替格瑞洛對(duì)模擬Ⅰ型成骨不全的小鼠(Col1a1+/-365)進(jìn)行了治療,采用Micro-CT和HE染色等方法對(duì)其促成骨作用進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果顯示與DMSO對(duì)照組相比,替格瑞洛治療組Col1a1+/-365小鼠股骨的BV/TV、Tb.N、Tb.Th增高,Tb.Pf降低,表明替格瑞洛可以增加Col1a1+/-365小鼠的骨量、骨小梁數(shù)目、骨小梁厚度和骨小梁面積,有效改善Col1a1+/-365小鼠骨微觀結(jié)構(gòu),促進(jìn)其骨生成。為了探討替格瑞洛促進(jìn)骨生成的作用機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)采用Trap染色觀察了3組小鼠破骨細(xì)胞數(shù)量的變化,結(jié)果顯示替格瑞洛治療組小鼠破骨細(xì)胞數(shù)量顯著減少,說(shuō)明替格瑞洛有效地抑制了Col1a1+/-365破骨細(xì)胞的生成。研究表明,破骨細(xì)胞分化成熟受到核因子受體活化因子配體-核因子受體活化因子-骨保護(hù)素(RANKL-RANK-OPG)信號(hào)通路等多條信號(hào)通路的精準(zhǔn)調(diào)控,Nfatc1是RANKL-RANK-OPG通路中調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,當(dāng)Nfatc1被激活后便從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi),并與C-Fos、C-Jun等轉(zhuǎn)錄因子共同啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控,誘導(dǎo)破骨分化特異基因Mmp9、Ctsk等的表達(dá),促使單核細(xì)胞或破骨前體細(xì)胞向成熟的破骨細(xì)胞分化[17-19]。因此,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)Mmp9、Ctsk、Nfatc1進(jìn)行了表達(dá)量的檢測(cè)和分析,結(jié)果顯示替格瑞洛治療組Col1a1+/-365小鼠股骨Mmp9、Ctsk、Nfatc1的表達(dá)量明顯降低,表明替格瑞洛可能通過(guò)RANKL-RANK-OPG信號(hào)通路抑制Col1a1+/-365小鼠的破骨分化與生成。

綜上所述,替格瑞洛可以有效改善Col1a1+/-365小鼠的股骨微觀結(jié)構(gòu),促進(jìn)骨形成,其機(jī)制可能與抑制破骨細(xì)胞分化有關(guān)。替格瑞洛具有治療Ⅰ型成骨不全的潛在價(jià)值,但此研究目前處于初步探索階段,具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入探究。