李小軍,姜龍龍,呂超超,閆文朝

(1.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院,河南洛陽 471023;2.濟源市動物衛(wèi)生監(jiān)督所,河南濟源 454650)

片形吸蟲隸屬于復(fù)殖目的片形科片形屬,是反芻動物體內(nèi)的常見寄生蟲。牛、羊等動物感染片形吸蟲后因肝臟功能紊亂導(dǎo)致生產(chǎn)力下降,給畜牧業(yè)造成較為嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[1]。肝片形吸蟲還可感染人,全球有高達(dá)9 000萬人面臨片形吸蟲感染的風(fēng)險[2]。

片形吸蟲主要是肝片形吸蟲(Fasciolahepatica)和大片形吸蟲(F.gigantica)。近年來,在埃及、伊朗、日本、韓國和中國等地發(fā)現(xiàn)有雜合型片形吸蟲[3-5]。由于肝片形吸蟲與大片形吸蟲的大小指標(biāo)實際上存在相當(dāng)大的變化及重疊,傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類對于二者的準(zhǔn)確鑒定和區(qū)分是不可靠的[4]。PCR和測序等分子技術(shù)已應(yīng)用于片形吸蟲的鑒定和分類[6]。目前用于片形吸蟲種類鑒定的分子標(biāo)記主要有核糖體和線粒體DNA序列。其中的核糖體小亞基的第1和第2內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS1、ITS2)和線粒體cox1、nad1基因常被用于片形吸蟲的種類鑒定[5-7]。

據(jù)文獻(xiàn)報道,河南省奶牛中存在肝片形吸蟲和大片形吸蟲[8-9],但目前尚未見雜合型片形吸蟲的報道。本研究對濟源地區(qū)1例黃牛感染的片形吸蟲在形態(tài)學(xué)鑒定基礎(chǔ)上,對蟲體的核糖體ITS1、ITS2以及線粒體cox1、nad1基因進(jìn)行PCR擴增、測序和序列分析,確定了其種類,為片形吸蟲病的流行病學(xué)及其防控補充了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 2019年10月從河南省濟源市某肉牛屠宰廠采集疑似片形吸蟲感染的肝臟,帶回實驗室進(jìn)行檢查。從肝臟中采集到片形吸蟲蟲體,保存于70%乙醇,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查,該病牛為3歲本地黃牛,生前消瘦,常年在濟源市太行山區(qū)放牧生活。

1.1.2 主要試劑 基因組DNA提取試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品;2×EasyTaqPCR SuperMix、Trans2K?DNA Marker和核酸染料GelStain,北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 PCR擴增儀(Genesy 96T),西安天隆科技有限公司產(chǎn)品;電泳儀DYY-6C,北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品;凝膠成像儀(Tanon-2500),上海天能科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 肝臟病變與蟲體形態(tài)的觀察 眼觀肝臟的大體病理變化。肉眼及解剖鏡觀察蟲體的形態(tài)結(jié)構(gòu),直尺測量蟲體的大小,參考相關(guān)文獻(xiàn)[10]對蟲體種類進(jìn)行初步的形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.2 蟲體基因組DNA提取 挑取4條形態(tài)大小差異較大的蟲體用于DNA的提取,分別命名為JY001～JY004。參考文獻(xiàn)所述方法[11]處理蟲體后按照組織DNA提取試劑盒說明書提取蟲體DNA,保存于-20 ℃冰箱,備用。

1.2.3 PCR擴增 采用參考文獻(xiàn)[7,12-13]報道的引物分別擴增片形吸蟲的核糖體ITS1和ITS2區(qū)域、線粒體基因nad1和cox1,引物(表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應(yīng)體系為25 μL,包括2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5 μL、上游引物和下游引物(10 pmol/μL)各1 μL、滅菌超純水8.5 μL和模板2 μL。反應(yīng)程序為:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55～57℃(表1) 30 s,72 ℃ 30～60 s(表1),共35個循環(huán);72 ℃ 7 min。取5 μL PCR產(chǎn)物,10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后,用凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照。

表1 片形吸蟲PCR檢測引物

1.2.4 測序與序列分析 將陽性PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行雙向測序。將所得序列用軟件Chromas和DNA Star 7.1 SeqMan校對拼接,在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast,對本研究所得序列與GenBank中序列相似性作初步分析。利用軟件BioEdit、DNA Star 7.1 MegAlign對所得序列和片形吸蟲的參考序列進(jìn)行截短和序列比對。利用軟件MEGA 6以鄰接法構(gòu)建nad1和cox1基因的遺傳進(jìn)化樹,作Bootstrap分析,重復(fù)次數(shù)設(shè)置為1 000次。

本研究獲得的黃牛源片形吸蟲代表分離株JY004的ITS1、ITS2、cox1和nad1基因序列已提交至GenBank,登錄號分別為OP850829、OP850586、OP837076和OP837184。

2 結(jié)果

2.1 肝臟病理變化及蟲體形態(tài)觀察結(jié)果

肉眼觀察,病牛肝臟腫大,可見明顯結(jié)節(jié)囊腫。切開結(jié)節(jié)囊腫,膽管內(nèi)可見淡黃色膿性分泌物和黑色鈣化塊狀物。從膽囊和膽管中分離的蟲體呈淡紅色片狀,蟲體肥厚,大小為(27～44) mm×(7～16) mm,平均長寬比為2.73(測量了12個完整蟲體的數(shù)據(jù))。蟲體頭錐明顯,靠近前端有口吸盤和腹吸盤,二者距離較近,蟲體前寬后窄,兩側(cè)不平行,肩部特征不明顯。該形態(tài)學(xué)符合片形吸蟲的特征,但尚不能準(zhǔn)確定種。

2.2 PCR擴增結(jié)果

對提取的4份DNA樣品JY001～JY004進(jìn)行PCR擴增,得到了ITS1、ITS2、nad1和cox1的條帶,分別約為600、470、619、474 bp(圖1),均與預(yù)期大小相符。

A～D.ITS1、ITS2、nad1、cox1; M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1～4.JY001-JY004

2.3 分子鑒定結(jié)果

根據(jù)測序結(jié)果,JY001和JY002兩份樣品的ITS1、ITS2測序色譜圖存在較多噪音信號,無法獲得完整可靠的序列,剩余兩份樣品JY003和JY004四個基因均獲得完整準(zhǔn)確序列。因此,選擇樣品JY003和JY004用于后續(xù)序列比對分析和進(jìn)化樹構(gòu)建。

2.3.1 ITS1和ITS2序列分析結(jié)果 序列比對結(jié)果顯示,JY003和JY004的ITS1序列和ITS2序列均完全一致。JY003和JY004的ITS1序列與大片形吸蟲序列相似性在99.5%以上,與肝片形吸蟲序列相似性為98.9%～99.2%。測序色譜圖顯示,這兩份樣品在6個位點存在雜合套峰,且每個雜合位點的堿基與肝片形吸蟲和大片形吸蟲的堿基一致(表2和圖2)。

▲:所指為雜合位點,出現(xiàn)套峰

表2 片形吸蟲ITS1核苷酸變異情況

JY003和JY004的ITS2序列與肝片形吸蟲和大片形吸蟲序列相似性均在98.8%以上。測序色譜圖顯示,這兩份樣品有4個位點存在雜合套峰,且每個雜合位點的堿基與肝片形吸蟲和大片形吸蟲的堿基一致(表3)。

表3 片形吸蟲ITS2核苷酸變異情況

根據(jù)ITS1和ITS2序列分析結(jié)果,參考有關(guān)文獻(xiàn),提示河南濟源片形吸蟲分離株JY003和JY004為雜合型片形吸蟲。

2.3.2nad1和cox1基因序列分析結(jié)果 JY003與JY004的nad1基因序列相同。二者與GenBank上已發(fā)布的肝片形吸蟲序列的相似性為91.4%～91.6%,與大片形吸蟲序列相似性為96.8%～100%,其中與大片形吸蟲中國云南、日本和韓國分離株的序列相似性高達(dá)100%。在系統(tǒng)進(jìn)化樹上,JY003和JY004與大片形吸蟲處于同一分支上(圖3)。

圖3 基于片形吸蟲nad1基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

JY003與JY004的cox1基因序列也相同。二者與GenBank上已發(fā)布的肝片形吸蟲序列的相似性為93.1%～93.4%,與大片形吸蟲序列相似性為97.3%～99.2%,其中與大片形吸蟲越南和泰國分離株的相似性達(dá)99%以上。在系統(tǒng)進(jìn)化樹上JY003和JY004與大片形吸蟲處于同一分支(圖4)。

圖4 基于片形吸蟲cox1基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

片形吸蟲病是危害牛、羊等反芻動物的常見寄生蟲病,也是一種重要的人畜共患病[2]。片形吸蟲主要是肝片形吸蟲和大片形吸蟲,也有近年來發(fā)現(xiàn)的位于二者之間的雜合型[5,13-14]。片形吸蟲成蟲的頭錐、肩部和長寬比等特征常作為形態(tài)學(xué)種類鑒定的指標(biāo),但由于蟲體發(fā)育階段等因素會影響其形態(tài)學(xué)鑒定的準(zhǔn)確性[4,15]。本研究對采集到的河南省濟源市本地黃牛肝臟中片形吸蟲蟲體,首先通過傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)觀察,發(fā)現(xiàn)其與片形吸蟲的形態(tài)特征基本吻合,但由于肩部特征不明顯,蟲體兩側(cè)不平行,未能確定其為何種片形吸蟲。為更確切地鑒定其種類,從分子水平上做了進(jìn)一步鑒定。

針對片形吸蟲的ITS1和ITS2區(qū)域,我們對河南濟源黃牛源分離株進(jìn)行了分子鑒定,結(jié)果為Fh/Fg雜合型片形吸蟲。相較與核糖體DNA,線粒體基因如nad1和cox1系母系遺傳,具有進(jìn)化速率較快,不易發(fā)生基因重組等特點,也被廣泛用于片形吸蟲的種類鑒定和遺傳進(jìn)化分析[6,5],但無法區(qū)分片形吸蟲是否存在雜合型[13-15]。因此,本研究除了用標(biāo)記分子ITS1和ITS2外,還利用線粒體nad1和cox1基因進(jìn)行序列和遺傳進(jìn)化分析。分析結(jié)果顯示,濟源黃牛源分離株JY003和JY004的nad1和cox1基因均與大片形吸蟲進(jìn)化關(guān)系最近,其中nad1序列與大片形吸蟲中國云南、日本和韓國分離株相似性高達(dá)100%。這表明本研究分離的黃牛源片形吸蟲分離株為大片形吸蟲作為母系的Fh/Fg雜合型片形吸蟲。

一般認(rèn)為中國南方反芻動物和人群感染大片形吸蟲,北方地區(qū)流行肝片形吸蟲[5,16-17]。后來發(fā)現(xiàn),肝片形吸蟲和大片形吸蟲地理隔離性已被打破,在黑龍江、吉林、云南、廣西、福建、貴州、湖北、湖南、廣東和青海等地區(qū)均存在Fh/Fg雜合型片形吸蟲,其中大片形吸蟲作為母系的Fh/Fg雜合型片形吸蟲占據(jù)優(yōu)勢地位[13-15,18]。Ichikawa-Seki M等[19]分析了來自中國各地共211株片形吸蟲,發(fā)現(xiàn)Fh/Fg雜合型片形吸蟲為優(yōu)勢蟲株,占比高達(dá)63.0%。本研究從中原地區(qū)黃牛體內(nèi)發(fā)現(xiàn)存在Fh/Fg雜合型片形吸蟲,進(jìn)一步驗證了“Fh/Fg雜合型片形吸蟲成為中國大陸流行的優(yōu)勢蟲株”的推論。

有關(guān)河南地區(qū)動物片形吸蟲感染情況的報道很少。李明[8]曾對濟源地區(qū)奶牛肝片形吸蟲感染情況做過調(diào)查,基于nad1基因分析結(jié)果顯示,奶牛肝片形吸蟲感染率為5.42%。劉復(fù)生報道[9],基于nad1基因分析表明,河南省中牟縣奶牛存在大片形吸蟲和肝片形吸蟲。由于上述兩項調(diào)查研究僅采用線粒體基因nad1進(jìn)行分子鑒定,無法鑒定出Fh/Fg雜合型片形吸蟲。本研究采用核糖體和線粒體標(biāo)記分子對來自河南省濟源市本地黃牛的蟲株進(jìn)行分子鑒定,首次確定了在河南地區(qū)存在Fh/Fg雜合型片形吸蟲,為我國片形吸蟲的流行病學(xué)研究提供了重要補充,為動物和人片形吸蟲病的防控提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。