王楷揚(yáng) ，袁 烈 ，宋 燚 ，劉慶龍 ，鐘佩伶 ，李文軍 ，蔡永青 ，李小麗 ，曾夢(mèng)華 ，陳劍鴻 #（.陸軍特色醫(yī)學(xué)中心藥劑科，重慶 0002；2.重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)系，重慶 0006；3.藥物代謝研究重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 0006；.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院藥劑科，重慶 020；.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科，重慶 0006）

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種較為常見的慢性肝臟疾病。當(dāng)肝臟中脂質(zhì)沉積超過肝臟質(zhì)量的5%，同時(shí)排除過量飲酒或其他已知的肝臟疾病誘因時(shí)，即可判定為NAFLD[1]。目前統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)表明，世界范圍內(nèi)NAFLD 的發(fā)病率約為25%[2]。而我國隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展，不同地區(qū)的NAFLD發(fā)病率自1990年以來也逐漸升高[3]。NAFLD最典型的特征是脂質(zhì)的積累和沉積。脂質(zhì)在肝臟中不斷積累，會(huì)引起肝臟炎癥；同時(shí)，隨著脂質(zhì)沉積的進(jìn)一步增加，脂滴逐漸在肝臟中形成，導(dǎo)致肝纖維化甚至肝硬化的發(fā)生[4]。NAFLD 已成為威脅人類健康的危險(xiǎn)因素之一，而目前尚無有效的治療方法，因此尋找有效的治療藥物迫在眉睫。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）相關(guān)信號(hào)通路是一類高度保守的信號(hào)通路，由3個(gè)亞群組成，包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、c-Jun 氨基末端激酶（c-JunN-terminal kinase，JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK），在細(xì)胞增殖、應(yīng)激、炎癥和凋亡中發(fā)揮著核心作用[5]。當(dāng)NAFLD發(fā)生后，由于肝脂質(zhì)沉積誘發(fā)了肝臟炎癥，MAPK 信號(hào)通路可能會(huì)被激活[6]。MAPK通路的活化可以使核轉(zhuǎn)錄因子紅系2 相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）磷酸化，促進(jìn)Nrf2 的核轉(zhuǎn)位或增加Nrf2 的表達(dá)，繼而促進(jìn)Nrf2的下游基因血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。抑制MAPK相關(guān)信號(hào)通路表達(dá)，可使機(jī)體氧化應(yīng)激水平或炎癥水平降低，從而延緩NAFLD 的發(fā)生發(fā)展[6―7]。

圣草酚化學(xué)名為3'，4'，5，7-四羥二氫黃酮，是一種天然二氫黃酮類化合物，廣泛存在于蔬菜、水果和中藥中，特別是在柑橘類水果中的含量最為豐富。在北美，印第安人常使用富含圣草酚的植物作為藥物治療氣喘、過敏性鼻炎、風(fēng)濕等疾病[8]。隨著對(duì)圣草酚研究的進(jìn)一步深入，其被發(fā)現(xiàn)具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等多種藥理活性[8]。同時(shí)，也有研究表明圣草酚能夠緩解胰島素抵抗[9]，對(duì)抗糖尿病引發(fā)的肝損傷[10]。本研究擬用C57BL/6J 小鼠構(gòu)建NAFLD 體內(nèi)模型，用HepG2 細(xì)胞構(gòu)建NAFLD 體外模型，探究圣草酚緩解NAFLD的作用，并從MAPK和Nrf2/HO-1信號(hào)通路角度初步探究其可能的作用機(jī)制，為圣草酚的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有：AE163型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）、IX51型熒光倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）、TDL-5A 型離心機(jī)（上海菲恰爾分析儀器有限公司）、Multiskan 型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）、Mini-PROTEAN 型垂直電泳設(shè)備電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 主要藥品與試劑

圣草酚對(duì)照品（批號(hào)20201011，純度≥98%）為重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院藥劑科劉松青教授課題組惠贈(zèng)；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、甘油三酯（triglyceride，TG）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)分別為20220506、20220504、20220506、20220508）均購自南京建成生物工程研究所；兔源過氧化物ERK、兔源磷酸化ERK（p-ERK）、兔源JNK、兔源磷酸化JNK（p-JNK）、兔源Nrf2、兔源HO-1、兔源β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）一抗均購自美國Cell Signaling 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)BB22041）購自上海貝博生物科技有限公司；BCA 定量試劑盒（批號(hào)020123230510）購自上海碧云天生物科技有限公司；尼羅紅染色試劑購自美國Sigma公司。

1.3 動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為SPF 級(jí)健康C57BL/6J 小鼠，共16 只，雄性，6～8 周齡，體重18～22 g，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（渝）2018-0003。所有小鼠均飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（22±2）℃、相對(duì)濕度為55%、12 h 光照/12 h 黑暗循環(huán)。經(jīng)過1 周基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)陸軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，倫理批件編號(hào)為AMUWEC20223914。

1.4 細(xì)胞系

人肝癌HepG2 細(xì)胞系（貨號(hào)CL-0103）購自武漢普諾賽生命科技有限公司，經(jīng)STR鑒定正確。

2 方法

2.1 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

2.1.1 動(dòng)物分組、造模與給藥

將16 只小鼠按照體重隨機(jī)分為4 組，分別為對(duì)照組、NAFLD 模型組和圣草酚低、高劑量組（50、100 mg/kg）[11]，每組4 只。對(duì)照組小鼠提供常規(guī)飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，其余3組小鼠提供高脂飼料喂養(yǎng)4周誘導(dǎo)NAFLD模型[12]；在預(yù)處理4周后，采取腹腔注射方式（0.01 mL/g）進(jìn)行給藥，每日1次，連續(xù)6周。對(duì)照組小鼠每日注射生理鹽水，NAFLD 模型組小鼠每日注射玉米油，圣草酚低、高劑量組小鼠每日分別注射相應(yīng)劑量的圣草酚玉米油溶液。

2.1.2 動(dòng)物一般情況觀察

實(shí)驗(yàn)過程中，每日觀察小鼠狀況，每周記錄小鼠體重變化，每2日稱定并記錄小鼠進(jìn)食飼料的質(zhì)量。

2.1.3 動(dòng)物標(biāo)本采集與處理

給藥結(jié)束后，各組小鼠禁食不禁水24 h，經(jīng)眼球取血，以3 000 r/min離心10 min，分離血清，-20 ℃冰箱中保存。取血后，脫頸處死小鼠，取出肝臟，用冷生理鹽水沖洗，用濾紙吸干后對(duì)小鼠肝臟大體進(jìn)行觀察并拍照。稱定肝臟質(zhì)量，取部分肝組織用4%多聚甲醛固定，其余組織分裝在EP管內(nèi)，置于-80 ℃冰箱中保存。

2.1.4 血清中AST、ALT和TG水平測(cè)定

取凍存的血清，常規(guī)解凍后，按照相應(yīng)試劑盒說明書操作，檢測(cè)小鼠血清中AST、ALT和TG水平。

2.1.5 肝組織病理變化觀察

取“2.1.3”項(xiàng)下經(jīng)固定處理的肝組織，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋切片（4 μm）后行常規(guī)蘇木素-伊紅（HE）染色，在熒光倒置顯微鏡下觀察肝組織病變情況。

2.1.6 肝組織中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用Western blot 法進(jìn)行檢測(cè)。取“2.1.3”項(xiàng)下凍存的小鼠肝組織，使用高通量勻漿機(jī)將肝組織研磨后，加入Western及IP細(xì)胞裂解液提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定總蛋白濃度。將蛋白高溫變性后，取40 μg 變性蛋白進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（電壓80 V、電泳時(shí)間20 min；電壓120 V、電泳時(shí)間40 min），濕法轉(zhuǎn)膜（電流 400 mA、轉(zhuǎn)膜120 min），加入5%脫脂奶粉封閉2 h；使用TBST 洗膜3 次、5 min/次，加入Nrf2、HO-1 和β-actin 一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜；TBST 洗膜，加入對(duì)應(yīng)二抗（稀釋比例1∶8 000），ECL化學(xué)發(fā)光顯影。采用ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行信號(hào)掃描，并使用Image J 軟件對(duì)掃描的蛋白條帶灰度值進(jìn)行定量分析。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2.2 體外實(shí)驗(yàn)

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組、造模、給藥

使用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。體外實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)組，分別為正常對(duì)照組、NAFLD 模型組和圣草酚低、中、高濃度組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。正常對(duì)照組細(xì)胞正常培養(yǎng)，NAFLD模型組使用0.5 mmol/L油酸處理細(xì)胞，誘導(dǎo)體外NAFLD模型[13]。圣草酚低、中、高濃度組在使用0.5 mmol/L 油酸處理細(xì)胞的同時(shí)，根據(jù)培養(yǎng)體系，分別加入濃度為0.05 mmol/L 的圣草酚母液（使用二甲基亞砜溶解），使培養(yǎng)體系中圣草酚終濃度分別為50、100、150 μmol/L[11]。處理24 h 后，收取細(xì)胞樣本，凍存于-80 ℃冰箱中。

2.2.2 細(xì)胞中脂質(zhì)沉積觀察

采用尼羅紅染色法進(jìn)行觀察。取HepG2 細(xì)胞進(jìn)行鋪板（1×105個(gè)/孔），按 “2.2.1”項(xiàng)下進(jìn)行分組、處理細(xì)胞，然后用4%多聚甲醛固定30 min，按照尼羅紅染色試劑操作說明進(jìn)行染色，最后在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞中脂滴沉積情況，如有脂滴沉積可見細(xì)胞內(nèi)有綠色高亮熒光。

2.2.3 細(xì)胞中TG、MDA和ROS水平測(cè)定

取“2.2.1”項(xiàng)下凍存的細(xì)胞樣本，復(fù)溫，以功率300 W超聲（超聲5 s 間隔30 s，重復(fù)5 次）破碎細(xì)胞，按照試劑盒說明書操作，測(cè)定細(xì)胞中TG、MDA和ROS水平。

2.2.4 細(xì)胞中MAPK和Nrf2/HO-1信號(hào)通路蛋白表達(dá)檢測(cè)

取“2.2.1”項(xiàng)下凍存的細(xì)胞樣本，復(fù)溫后加入蛋白裂解液，冰上裂解30 min提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白高溫變性后，取40 μg 蛋白上樣，參照“2.1.6”項(xiàng)下方法檢測(cè)細(xì)胞中MAPK和Nrf2/HO-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。其中，ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、Nrf2、HO-1 和β-actin（內(nèi)參）一抗的稀釋比例均為1∶1 000，二抗的稀釋比例為1∶8 000。使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平，以p-ERK 與ERK、p-JNK與JNK蛋白表達(dá)的比值分別表示ERK、JNK蛋白的磷酸化水平。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 小鼠體重和肝臟質(zhì)量測(cè)定結(jié)果

與對(duì)照組比較，NAFLD模型組小鼠體重、肝臟質(zhì)量均明顯升高（P＜0.01）。與NAFLD模型組比較，圣草酚低、高劑量組小鼠體重、肝臟質(zhì)量均顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠的體重和肝臟質(zhì)量測(cè)定結(jié)果（±s，g）

表1 各組小鼠的體重和肝臟質(zhì)量測(cè)定結(jié)果（±s，g）

a：與對(duì)照組比較，P＜0.01；b：與NAFLD模型組比較，P＜0.01。

組別對(duì)照組NAFLD模型組圣草酚低劑量組圣草酚高劑量組n4 4 4 4體重32.63±0.83 44.55±1.34a 32.43±1.32b 30.20±1.55b肝臟質(zhì)量1.24±0.08 1.68±0.10a 1.11±0.06b 1.08±0.08b

3.1.2 小鼠血清中AST、ALT和TG水平測(cè)定結(jié)果

與對(duì)照組比較，NAFLD 模型組小鼠血清中AST、ALT 和TG 水平顯著升高（P＜0.01）；與NAFLD 模型組比較，圣草酚低、高劑量組小鼠血清中ALT、TG 水平和圣草酚高劑量組小鼠血清中AST 水平均顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠血清中AST、ALT 和TG 水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝4）

表2 各組小鼠血清中AST、ALT 和TG 水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝4）

a：與對(duì)照組比較，P＜0.01；b：與NAFLD模型組比較，P＜0.01。

組別對(duì)照組NAFLD模型組圣草酚低劑量組圣草酚高劑量組AST/（U/L）98.50±11.69 162.80±21.31a 130.50±18.70 113.50±9.75b ALT/（U/L）27.75±3.10 84.00±11.34a 32.75±9.22b 30.00±5.23b TG/（mmol/L）0.84±0.10 1.58±0.08a 1.18±0.06b 1.30±0.08b

3.1.3 小鼠肝臟大體觀察結(jié)果

對(duì)照組小鼠肝臟表面光滑，呈深紅色，質(zhì)地柔韌；NAFLD模型組小鼠肝臟體積明顯增大，表面呈淺紅色，同時(shí)可見灰白色小結(jié)節(jié)；圣草酚低、高劑量組小鼠肝臟與NAFLD 模型組比較，體積明顯減小，表面紅潤(rùn)，質(zhì)地柔韌，灰白色小結(jié)節(jié)數(shù)量減少。結(jié)果見圖1。

圖1 各組小鼠肝臟大體形態(tài)觀察結(jié)果

3.1.4 小鼠肝組織病理觀察結(jié)果

對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞索在中心靜脈周圍呈放射狀排列，細(xì)胞質(zhì)均勻，未出現(xiàn)脂肪空泡；NAFLD模型組小鼠肝組織發(fā)生病理性改變，出現(xiàn)大量脂滴沉積形成的空泡；與NAFLD模型組比較，圣草酚低、高劑量組小鼠肝組織病理變化得到顯著改善，脂滴沉積形成的空泡數(shù)量顯著減少。結(jié)果見圖2。

圖2 各組小鼠肝組織病理形態(tài)觀察結(jié)果（HE染色）

3.1.5 小鼠肝組織中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)測(cè)定結(jié)果

與對(duì)照組比較，NAFLD模型組小鼠肝組織中Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與NAFLD 模型組比較，各給藥組小鼠肝組織中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平均進(jìn)一步升高（P＜0.01）。結(jié)果見圖3、表3。

圖3 各組小鼠肝組織中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)的電泳圖

表3 各組小鼠肝組織中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝4）

表3 各組小鼠肝組織中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝4）

a：與對(duì)照組比較，P＜0.01；b：與NAFLD模型組比較，P＜0.01。

組別對(duì)照組NAFLD模型組圣草酚低劑量組圣草酚高劑量組Nrf2/β-actin 1.00±0.00 1.49±0.04a 2.28±0.11b 4.62±0.19b HO-1/β-actin 1.00±0.00 1.12±0.04a 1.76±0.02b 4.20±0.78b

3.2 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 細(xì)胞中脂質(zhì)沉積觀察結(jié)果

正常對(duì)照組細(xì)胞中未見尼羅紅特異性染色的高亮脂滴（熒光強(qiáng)度11.10±0.21）；NAFLD 模型組細(xì)胞中可見尼羅紅特異性染色呈現(xiàn)的綠色熒光高亮區(qū)域，且熒光強(qiáng)度（76.73±0.93）顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）；與NAFLD 模型組比較，圣草酚低、中、高濃度組細(xì)胞中脂質(zhì)沉積減少，熒光強(qiáng)度（分別為24.11±1.63、24.88±0.69、24.88±0.30）均顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見圖4。

圖4 各組細(xì)胞的尼羅紅染色觀察結(jié)果（×200）

3.2.2 細(xì)胞中MDA、ROS和TG水平測(cè)定結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，NAFLD 模型組細(xì)胞中MDA、ROS 和TG 水平顯著升高（P＜0.01）；與NAFLD 模型組比較，各給藥組細(xì)胞中MDA、ROS 和TG 水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表4。

表4 各組細(xì)胞中MDA、ROS和TG水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝3，nmol/mg port）

表4 各組細(xì)胞中MDA、ROS和TG水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝3，nmol/mg port）

a：與正常對(duì)照組比較，P＜0.01；b：與NAFLD模型組比較，P＜0.01；c：與NAFLD模型組比較，P＜0.05。

組別正常對(duì)照組NAFLD模型組圣草酚低濃度組圣草酚中濃度組圣草酚高濃度組MDA 0.87±0.09 2.11±0.17a 1.56±0.20b 1.13±0.08b 0.92±0.11b ROS 89.90±11.64 236.50±55.30a 133.50±32.24c 124.30±22.74b 110.60±24.45b TG 0.14±0.01 0.32±0.02a 0.25±0.01b 0.24±0.03b 0.17±0.01b

3.2.3 細(xì)胞中MAPK和Nrf2/HO-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，NAFLD 模型組細(xì)胞中ERK、JNK磷酸化水平顯著上調(diào)（P＜0.01），Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.01）。與NAFLD模型組比較，圣草酚低、中、高濃度組細(xì)胞中ERK、JNK磷酸化水平均顯著下調(diào)（P＜0.01），Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)（P＜0.01）。結(jié)果見圖5、表5。

圖5 各組細(xì)胞中MAPK和Nrf2/HO-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)的電泳圖

表5 各組細(xì)胞中MAPK和Nrf2/HO-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝3）

表5 各組細(xì)胞中MAPK和Nrf2/HO-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝3）

a：與正常對(duì)照組比較，P＜0.01；b：與NAFLD模型組比較，P＜0.01。

組別正常對(duì)照組NAFLD模型組圣草酚低濃度組圣草酚中濃度組圣草酚高濃度組p-ERK/ERK 1.00±0.00 1.98±0.04a 1.27±0.06b 1.40±0.04b 1.15±0.03b p-JNK/JNK 1.00±0.00 1.11±0.03a 0.69±0.02b 0.49±0.05b 0.24±0.04b Nrf2/β-actin 1.00±0.00 0.67±0.01a 1.00±0.02b 0.73±0.02b 0.75±0.01b HO-1/β-actin 1.00±0.00 0.81±0.05a 1.26±0.06b 1.23±0.05b 1.17±0.04b

4 討論

NAFLD 不僅是肝病致殘和死亡的重要原因，而且與代謝綜合征、2型糖尿病、動(dòng)脈硬化性心腦血管疾病和肝癌的高發(fā)密切相關(guān)。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)其治療靶點(diǎn)并開發(fā)有效的治療藥物來防治NAFLD。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，圣草酚給藥后能夠緩解高脂飼料誘導(dǎo)的NAFLD模型小鼠肝臟中的脂質(zhì)堆積，降低其體重、肝臟質(zhì)量及血清中AST、ALT水平；體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，使用圣草酚處理后同樣能夠減少HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，同時(shí)降低胞內(nèi)ROS、MDA 和TG 水平。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，圣草酚能夠緩解NAFLD。

研究表明，肝臟內(nèi)脂質(zhì)沉積變性會(huì)導(dǎo)致ROS 過表達(dá)，進(jìn)而激活MAPK 信號(hào)通路，誘發(fā)氧化應(yīng)激促進(jìn)NAFLD 的發(fā)展[14]。另有文獻(xiàn)報(bào)道，抑制MAPK 信號(hào)通路后會(huì)使Nrf2/HO-1信號(hào)通路激活，進(jìn)而發(fā)揮抗炎、抗氧化等作用[15―16]。ERK 和JNK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的經(jīng)典通路[17]，抑制ERK、JNK 的蛋白表達(dá)和磷酸化能夠緩解炎癥和氧化應(yīng)激[18]。Nrf2 是細(xì)胞調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子[19]。當(dāng)出現(xiàn)氧化應(yīng)激時(shí)，Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1）構(gòu)象改變，從而使Nrf2從Keap1-Nrf2復(fù)合物中解離出來，由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到胞核，啟動(dòng)下游的抗氧化應(yīng)答元件，從而上調(diào)細(xì)胞的抗氧化因子HO-1 等細(xì)胞保護(hù)蛋白的活性，以避免氧化應(yīng)激對(duì)肝的損傷[19―20]。在體內(nèi)外研究中，筆者通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了圣草酚給藥后能夠有效抑制細(xì)胞中ERK、JNK的活性，上調(diào)模型動(dòng)物/細(xì)胞中Nrf2、HO-1的表達(dá)。該結(jié)果表明，圣草酚能夠抑制MAPK 信號(hào)通路，進(jìn)而激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用，從而緩解NAFLD。

綜上所述，筆者通過體內(nèi)外NAFLD 模型初步驗(yàn)證了圣草酚緩解NAFLD 的效果，且其作用可能與抑制MAPK 信號(hào)通路，進(jìn)而激活Nrf2/HO-1 信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化應(yīng)激有關(guān)。但本研究尚未通過加入抑制劑等方式進(jìn)行反向驗(yàn)證，機(jī)制方面尚需進(jìn)一步確證。同時(shí)，本研究還存在著動(dòng)物樣本量較少的局限性，需要在后續(xù)研究中進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，從而進(jìn)一步確證圣草酚緩解NAFLD的作用及機(jī)制。