蘇娟娟 ，王 旭 ，陳洪婷 ，翟遠坤 ，靳 強 ，王 琳 （1.河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔科，河南 開封 475000；.河南大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，河南 開封 475000）

牙周炎是一種流行的慢性炎癥性疾病，其特征是牙周組織持續(xù)發(fā)炎和不可逆的牙槽骨丟失，最終導(dǎo)致牙齒脫落[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，牙周炎與其他慢性炎癥驅(qū)動的疾病有關(guān)，例如糖尿病、阿爾茨海默病和某些癌癥等[2]。目前可用于牙周炎的措施包括非手術(shù)治療（如洗牙、牙周袋沖洗和牙根整平）和再生手術(shù)，從而再生牙周組織。此外，含有抗生素和抗微生物劑的輔助藥物被應(yīng)用于牙周的局部治療。然而上述方法的治療結(jié)果并不盡如人意[3]。因此，開發(fā)新的藥物抑制牙周炎過程中的牙周組織炎性損傷和牙槽骨丟失具有重要意義。

蒼術(shù)素是從植物蒼術(shù)的根莖中提取的一種活性成分，據(jù)報道，其可通過抑制炎癥反應(yīng)減輕小鼠結(jié)腸炎[4]，通過抑制炎癥改善大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎[5]。以上研究提示，蒼術(shù)素可通過抑制炎癥延緩多種疾病的進展。但關(guān)于蒼術(shù)素能否改善牙周炎的研究鮮有報道。相關(guān)研究顯示，激活基質(zhì)細胞衍生因子1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）/CXC 型趨化因子受體4（CXC chemokine receptor-4，CXCR4）通路可促進牙周炎模型大鼠牙周修復(fù)[6]。但蒼術(shù)素能否調(diào)控SDF-1/CXCR4 信號通路影響牙周炎模型大鼠牙周組織炎性損傷和牙槽骨丟失尚不明確?；诖耍狙芯恐饕骄可n術(shù)素對牙周炎模型大鼠牙周組織炎性損傷和牙槽骨丟失的影響，并從SDF-1/CXCR4 信號通路著手探索其可能的作用機制，為牙周炎的治療提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有：7696 型牙周探針（德國Kohler牙科器械有限公司）、ST-360型酶標儀（上?？迫A實驗系統(tǒng)有限公司）、CX53 型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）、165-8001型蛋白電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用的主要藥品與試劑有：蒼術(shù)素對照品（上海晅科生物科技有限公司，批號20221223，純度≥98%）；甲硝唑（亞寶藥業(yè)集團股份有限公司，批號20221001，規(guī)格0.2 g）；白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附檢測（ELISA）試劑盒（上海廣銳生物科技有限公司，批號分別為20220506、20220816）；SDF-1/CXCR4 通路抑制劑AMD3100（北京索萊寶科技有限公司，批號20221123，純度≥97%）；亞甲藍染色液（上海源葉生物科技有限公司，批號20220928）；抗酒石酸磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司，批號20220830）；骨保護素（osteoprotegerin，OPG）、核因子κB受體活化因子配基（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）、SDF-1、CXCR4、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）兔單克隆抗體及辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗（英國Abcam 公司，批號分別為ab183910、ab239607、ab25117、ab124824、ab8245、ab205718）。

1.3 動物與細菌

本研究所用動物為SPF級雄性SD大鼠，共144只，7周齡，體重250～260 g，購自鄭州大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（豫）2022-0001。實驗動物飼養(yǎng)于溫度22～24 ℃、相對濕度50%～60%、光照12 h/黑暗12 h 交替的環(huán)境中。本研究獲得了河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物倫理委員會的批準，倫理編號為2022-03-016。

本研究所用細菌為牙齦卟啉單胞菌（上海名勁生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 牙周炎大鼠模型的構(gòu)建

采用牙齦內(nèi)接種牙齦卟啉單胞菌法構(gòu)建牙周炎大鼠模型。具體操作為：用2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，用棉線雙側(cè)結(jié)扎大鼠上頜第一磨牙牙齦下部，并于磨牙區(qū)接種1×1010CFU牙齦卟啉單胞菌液，隔日接種1次，7 d后移除棉線[7]。當觀察到大鼠牙齦紅腫、探診出血、有深牙周袋形成則認為牙周炎大鼠模型構(gòu)建成功[8]。

2.2 動物分組與給藥

按照隨機數(shù)字表法將144 只大鼠隨機分為對照組，模型組，蒼術(shù)素低、中、高劑量組，甲硝唑組（陽性對照組），AMD3100（SDF-1/CXCR4通路抑制劑）組和蒼術(shù)素高劑量+AMD3100組，每組18只。對照組大鼠用棉線雙側(cè)結(jié)扎大鼠上頜第一磨牙牙齦下部，并于磨牙區(qū)注射等量的生理鹽水代替牙齦卟啉單胞菌液，隔日注射1次，7 d 后移除棉線。其余各組大鼠均按照“2.1”項下方法構(gòu)建牙周炎模型。建模成功后，進行給藥處理：蒼術(shù)素低、中、高劑量組大鼠分別腹腔注射6.665、13.33、26.66 mg/kg 蒼術(shù)素[9]，且同時灌胃等體積的生理鹽水；甲硝唑組大鼠灌胃0.05 g/kg甲硝唑[10]，且同時腹腔注射等體積的生理鹽水；AMD3100組大鼠灌胃1 mg/kg AMD3100[11]，且同時腹腔注射等體積的生理鹽水；蒼術(shù)素高劑量+AMD3100 組大鼠腹腔注射26.66 mg/kg 蒼術(shù)素，且同時灌胃1 mg/kg AMD3100；對照組、模型組大鼠均需灌胃且腹腔注射等量的生理鹽水。各組大鼠每天給藥（或生理鹽水）1次，持續(xù)4周。

2.3 大鼠牙齦指數(shù)評定

末次給藥（或生理鹽水）24 h后，全部大鼠均進行牙齦指數(shù)評定。利用牙周探針探測牙齦邊緣，根據(jù)大鼠牙齦出血、水腫、潰瘍形成等情況來評定牙齦指數(shù)。評定標準如下[12]：牙齦正常，記0 分；牙齦輕微水腫但探針滑動后無出血現(xiàn)象，記1分；探針滑動后牙齦出血，記2分；牙齦自發(fā)出血或有潰瘍形成，記3分。

2.4 標本收集與處理

牙齦指數(shù)評定結(jié)束后，麻醉所有大鼠（每組18 只），腹主動脈取血，經(jīng)離心后得血清，用于ELISA 實驗。血液收集完成后，每組隨機選取6只大鼠，處死，收集大鼠上頜骨組織用于亞甲藍染色。處死各組剩余的12 只大鼠，收集大鼠的牙周組織，分為兩部分（每部分包含各組6 只大鼠的牙周組織），一部分固定于4%多聚甲醛中用于HE 染色和TRAP 染色，另一部分凍存于-80 ℃冰箱中用于Western blot實驗。

2.5 大鼠血清中IL-6、TNF-α水平檢測

采用ELISA 法進行檢測。取“2.4”項下血清，冰上解凍后，嚴格按照試劑盒說明書操作步驟檢測大鼠血清中IL-6、TNF-α水平。

2.6 大鼠牙槽骨吸收檢測

采用亞甲藍染色法進行檢測。將“2.4”項下的大鼠上頜骨組織煮沸后剝離軟組織，然后加入0.1%亞甲藍孵育2 min，通過光學(xué)顯微鏡觀察并記錄第一磨牙到第三磨牙處釉-牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂?shù)木嚯x，將該距離作為牙槽骨吸收值。

2.7 大鼠牙周組織病理損傷觀察

采用HE 染色法進行觀察。將“2.4”項下固定于4%多聚甲醛的牙周組織脫鈣后包埋在石蠟中，用切片機切成4 μm厚的切片，經(jīng)HE染色、磷酸鹽緩沖液沖洗切片、梯度乙醇和二甲苯脫水、中性樹脂封片并晾干后，通過光學(xué)顯微鏡觀察牙周組織的病理變化。

2.8 大鼠牙周組織中破骨細胞數(shù)檢測

采用TRAP染色法進行檢測。取“2.7”項下切片，按照TRAP 染色試劑盒操作步驟進行染色、吹干后，利用中性明膠封片，通過光學(xué)顯微鏡觀察牙周組織中破骨細胞并統(tǒng)計細胞數(shù)。

2.9 大鼠牙周組織中OPG、RANKL、SDF-1、CXCR4蛋白表達的檢測

采用Western blot法進行檢測。利用RIPA裂解緩沖液提取“2.4”項下牙周組織總蛋白。經(jīng)BCA法對蛋白進行定量后，將蛋白進行煮沸變性。取40 μg 蛋白樣品進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳（電壓100 V，電泳時間2 h）分離，轉(zhuǎn)移（電流250 mA，轉(zhuǎn)膜時間1.5 h）到聚偏二氟乙烯膜上，以5%脫脂牛奶進行封閉；加入一抗OPG（稀釋比例1∶3 000）、RANKL（稀釋比例1∶2 000）、SDF-1（稀釋比例1∶3 000）、CXCR4（稀釋比例1∶2 000）、GAPDH（稀釋比例1∶4 000），4 °C 孵育過夜；洗膜后，加入二抗（稀釋比例1∶2 000），室溫孵育1 h；加入ECL試劑顯色，利用Image J軟件評估蛋白灰度值。目的蛋白的相對表達水平用目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白（GAPDH）條帶灰度值的比值表示。

2.10 統(tǒng)計學(xué)方法

利用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布且方差齊性的數(shù)據(jù)以±s表示。多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析，進一步兩組數(shù)據(jù)間的比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 蒼術(shù)素對大鼠牙齦指數(shù)的影響

與對照組比較，模型組大鼠牙齦指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，蒼術(shù)素低、中、高劑量組和甲硝唑組大鼠牙齦指數(shù)顯著降低（P＜0.05），AMD3100 組大鼠牙齦指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與蒼術(shù)素高劑量組比較，蒼術(shù)素高劑量+AMD3100 組大鼠牙齦指數(shù)顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠牙齦指數(shù)及血清中IL-6、TNF-α 水平比較（±s，n＝18）

表1 各組大鼠牙齦指數(shù)及血清中IL-6、TNF-α 水平比較（±s，n＝18）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與蒼術(shù)素高劑量組比較，P＜0.05。

分組對照組模型組蒼術(shù)素低劑量組蒼術(shù)素中劑量組蒼術(shù)素高劑量組甲硝唑組AMD3100組蒼術(shù)素高劑量+AMD3100組牙齦指數(shù)/分0.00±0.00 2.15±0.13a 1.78±0.12b 1.29±0.12b 0.28±0.02b 0.26±0.01b 2.58±0.10b 1.51±0.13c IL-6/（pg/mL）65.53±3.15 132.27±7.34a 115.58±5.36b 98.85±4.23b 77.64±3.15b 78.86±4.03b 179.93±6.58b 107.72±4.87 c TNF-α/（pg/mL）128.65±5.74 259.45±11.73a 214.43±10.05b 179.94±9.03b 149.25±7.05b 148.87±7.11b 301.45±13.39b 193.36±8.72 c

3.2 蒼術(shù)素對大鼠血清中IL-6、TNF-α水平的影響

與對照組比較，模型組大鼠血清中IL-6、TNF-α 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，蒼術(shù)素低、中、高劑量組和甲硝唑組大鼠血清中IL-6、TNF-α水平均顯著降低（P＜0.05），AMD3100組大鼠血清中IL-6、TNF-α水平顯著升高（P＜0.05）；與蒼術(shù)素高劑量組比較，蒼術(shù)素高劑量+AMD3100 組大鼠血清中IL-6、TNF-α 水平顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

3.3 蒼術(shù)素對大鼠牙槽骨吸收值的影響

與對照組[（0.09±0.01）mm，n＝6]比較，模型組大鼠牙槽骨吸收值[（0.94±0.08）mm，n＝6]顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，蒼術(shù)素低、中、高劑量組和甲硝唑組大鼠牙槽骨吸收值[分別為（0.76±0.07）、（0.52±0.04）、（0.21±0.02）、（0.19±0.02）mm，n＝6]均顯著降低（P＜0.05），AMD3100組大鼠牙槽骨吸收值[（1.20±0.11）mm，n＝6]顯著升高（P＜0.05）；與蒼術(shù)素高劑量組比較，蒼術(shù)素高劑量+AMD3100組大鼠牙槽骨吸收值[（0.67±0.06）mm，n＝6]顯著升高（P＜0.05）。亞甲藍染色結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠牙槽骨吸收檢測的亞甲藍染色圖（×5）

3.4 蒼術(shù)素對大鼠牙周組織病理損傷的影響

對照組大鼠牙周組織結(jié)構(gòu)正常，幾乎無炎癥細胞浸潤；模型組大鼠牙周組織中有大量炎癥細胞浸潤；與模型組比較，蒼術(shù)素低、中、高劑量組和甲硝唑組大鼠牙周組織病理損傷減輕，AMD3100 組大鼠牙周組織病理損傷加重；與蒼術(shù)素高劑量組比較，蒼術(shù)素高劑量+AMD3100組大鼠牙周組織病理損傷嚴重。結(jié)果見圖2。

3.5 蒼術(shù)素對大鼠牙周組織中破骨細胞數(shù)的影響

與對照組[（1.78±0.13）個，n＝6]比較，模型組大鼠牙周組織中破骨細胞數(shù)[（15.56±0.44）個，n＝6]顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，蒼術(shù)素低、中、高劑量組和甲硝唑組大鼠牙周組織中破骨細胞數(shù)[分別為（11.78±0.29）、（8.68±0.23）、（3.77±0.15）、（3.81±0.17）個，n＝6]顯著減少（P＜0.05），AMD3100 組大鼠牙周組織中破骨細胞數(shù)[（19.06±0.61）個，n＝6]顯著增加（P＜0.05）；與蒼術(shù)素高劑量組比較，蒼術(shù)素高劑量+AMD3100組大鼠牙周組織中破骨細胞數(shù)[（9.88±0.34）個，n＝6]顯著增加（P＜0.05）。結(jié)果見圖3。

圖3 各組大鼠牙周組織中破骨細胞數(shù)測定的TRAP染色圖

3.6 蒼術(shù)素對大鼠牙周組織中OPG、RANKL、SDF-1、CXCR4蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠牙周組織中OPG、SDF-1、CXCR4蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），RANKL蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，蒼術(shù)素低、中、高劑量組和甲硝唑組大鼠牙周組織中OPG、SDF-1、CXCR4 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05），RANKL蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）；AMD3100組大鼠牙周組織中OPG、SDF-1、CXCR4蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），RANKL 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。與蒼術(shù)素高劑量組比較，蒼術(shù)素高劑量+AMD3100組大鼠牙周組織中OPG、SDF-1、CXCR4蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），RANKL蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖4和表2。

圖4 各組大鼠牙周組織中OPG、RANKL、SDF-1、CXCR4蛋白表達的電泳圖

表2 各組大鼠牙周組織中OPG、RANKL、SDF-1、CXCR4蛋白表達水平比較（±s，n＝6）

表2 各組大鼠牙周組織中OPG、RANKL、SDF-1、CXCR4蛋白表達水平比較（±s，n＝6）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與蒼術(shù)素高劑量組比較，P＜0.05。

分組對照組模型組蒼術(shù)素低劑量組蒼術(shù)素中劑量組蒼術(shù)素高劑量組甲硝唑組AMD3100組蒼術(shù)素高劑量+AMD3100組OPG/GAPDH 1.56±0.13 0.45±0.04a 0.68±0.06b 0.97±0.09b 1.36±0.12b 1.38±0.13b 0.23±0.02b 0.81±0.08c RANKL/GAPDH 0.26±0.02 1.21±0.11a 0.97±0.09b 0.76±0.07b 0.41±0.04b 0.39±0.04b 1.53±0.12b 0.82±0.08c SDF-1/GAPDH 1.26±0.14 0.36±0.04a 0.57±0.05b 0.89±0.09b 1.05±0.11b 1.07±0.12b 0.19±0.01b 0.72±0.06c CXCR4/GAPDH 1.01±0.11 0.21±0.02a 0.43±0.04b 0.67±0.05b 0.85±0.07b 0.87±0.06b 0.11±0.02b 0.55±0.04c

4 討論

牙齦卟啉單胞菌被認為是一種典型的致病菌，其在口腔群落中的定植會導(dǎo)致炎癥免疫反應(yīng)失調(diào)，并最終對牙周組織造成不可逆的損傷[13]。本研究采用牙齦內(nèi)接種牙齦卟啉單胞菌的方式構(gòu)建牙周炎大鼠模型，結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠牙齦指數(shù)、牙槽骨吸收值升高，牙周組織中出現(xiàn)大量炎癥細胞浸潤，這提示牙周炎大鼠模型構(gòu)建成功。而使用低、中、高劑量蒼術(shù)素及甲硝唑干預(yù)后，模型大鼠牙齦指數(shù)、牙槽骨吸收值降低，牙周組織中炎癥細胞浸潤減少，這表明蒼術(shù)素可改善牙周炎引起的牙周組織損傷。

IL-6、TNF-α是常見的促炎細胞因子，可加重機體的炎癥反應(yīng)[14]。破骨細胞的分化和活性受RANKL和OPG調(diào)節(jié)。RANKL 可通過激活破骨細胞促進骨吸收；而OPG 作為RANKL 的受體，可與RANKL 結(jié)合抑制RANKL 的功能，進而促進破骨細胞的凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠的IL-6、TNF-α水平和破骨細胞數(shù)、RANKL蛋白表達水平升高，OPG蛋白表達水平降低，這表明牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的牙周炎模型大鼠存在炎癥反應(yīng)及牙槽骨丟失。而經(jīng)低、中、高劑量蒼術(shù)素及甲硝唑干預(yù)后，給藥大鼠的IL-6、TNF-α 水平和破骨細胞數(shù)、RANKL 蛋白表達水平均低于模型大鼠，OPG 蛋白表達水平高于模型大鼠，這提示蒼術(shù)素可抑制牙周炎大鼠炎癥反應(yīng)及牙槽骨丟失。

SDF-1 屬于CXC 趨化因子家族成員，其與CXCR4結(jié)合后可在干細胞成骨分化中起到重要的促進作用[16]。據(jù)報道，激活SDF-1/CXCR4 信號通路募集內(nèi)源性干細胞可促進牙髓再生[17]；激活SDF-1/CXCR4信號通路能夠抑制急性心肌梗死大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)[18]。上述研究表明，SDF-1/CXCR4信號通路在牙周組織修復(fù)及抑制炎癥反應(yīng)中具有重要作用。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果是一致的——本研究顯示，與模型組比較，AMD3100組大鼠牙周組織中SDF-1、CXCR4 蛋白表達下調(diào)，大鼠炎癥反應(yīng)及牙槽骨丟失現(xiàn)象進一步增強，這表明在牙周炎大鼠炎癥反應(yīng)及牙槽骨丟失過程中SDF-1/CXCR4信號通路處于抑制狀態(tài)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，蒼術(shù)素可上調(diào)牙周炎大鼠牙周組織中SDF-1、CXCR4 蛋白表達。因此，筆者推測蒼術(shù)素可能是通過激活SDF-1/CXCR4 信號通路來改善牙周炎大鼠炎癥反應(yīng)及牙槽骨丟失的。為了驗證該推測，本研究在高劑量蒼術(shù)素作用的基礎(chǔ)上再加上SDF-1/CXCR4 信號通路抑制劑AMD3100 來干預(yù)牙周炎大鼠，結(jié)果顯示，AMD3100減弱了高劑量蒼術(shù)素對牙周炎大鼠炎癥反應(yīng)及牙槽骨丟失的抑制作用。這一結(jié)果證實了蒼術(shù)素可能是通過激活SDF-1/CXCR4信號通路來改善牙周炎大鼠炎癥反應(yīng)及牙槽骨丟失的。

綜上所述，蒼術(shù)素可能通過激活SDF-1/CXCR4 信號通路來改善牙周炎大鼠炎癥反應(yīng)及牙槽骨丟失，但蒼術(shù)素對牙周炎大鼠炎癥反應(yīng)及牙槽骨丟失的抑制作用涉及的機制較為復(fù)雜，具體通過SDF-1/CXCR4 信號通路下游的哪些蛋白來發(fā)揮作用有待進一步實驗探究。