梁萬徽 ，陶舒悅 ，左池靖 ，汪 杰 ，劉 艷 ，余衛(wèi)東 ，彭 燦 ，2，3，4，5#，王 茜 ，5（.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥 23002；2.省部共建安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心，合肥 23002；3.安徽省鄉(xiāng)村振興協(xié)同技術(shù)服務(wù)中心，合肥 23002；4.安徽省現(xiàn)代中藥產(chǎn)業(yè)共性技術(shù)研究中心，合肥 23002；5.藥物制劑技術(shù)與應(yīng)用安徽省重點(diǎn)實(shí)驗室，合肥 23002）

心痛舒噴霧劑（國藥準(zhǔn)字Z20194075）由牡丹皮、川芎及冰片3味中藥制備而成，在臨床上用于治療痰濁瘀血痹阻心脈而致的冠心病心絞痛；其經(jīng)舌下噴霧給藥，被毛細(xì)血管吸收后直接進(jìn)入體循環(huán)，起效快，療效確切，在心血管疾病急救方面具有獨(dú)特優(yōu)勢[1―2]。

中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)、綜合作用的特點(diǎn)，其藥效的發(fā)揮是多成分協(xié)同作用的結(jié)果[3]。現(xiàn)行的心痛舒噴霧劑質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)收載于《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)》第42 冊[4]，主要為單味中藥薄層鑒定及單一成分含量測定，無法反映出整體的質(zhì)量情況，同時也未見國內(nèi)外關(guān)于心痛舒噴霧劑質(zhì)量控制的研究。為保障中藥復(fù)方的質(zhì)量及臨床藥效的發(fā)揮，有必要建立一種簡單、高效、準(zhǔn)確的指紋圖譜和多成分含量測定方法，以應(yīng)用于企業(yè)的生產(chǎn)和質(zhì)檢。

中藥復(fù)方指紋圖譜和多成分含量測定研究是保障其質(zhì)量的基礎(chǔ)，而對中藥復(fù)方質(zhì)量的提升研究也同樣重要。中藥復(fù)方質(zhì)量的提升離不開對其制備工藝的研究和優(yōu)化，而通過探究“指標(biāo)成分”在中藥復(fù)方制備過程中的傳遞規(guī)律，則有利于發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化影響其質(zhì)量的關(guān)鍵工藝。基于此，本研究建立心痛舒噴霧劑高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，對其指認(rèn)成分進(jìn)行含量測定；再以該噴霧劑中牡丹皮、川芎藥材的質(zhì)控成分丹皮酚和阿魏酸為“指標(biāo)成分”[5]，探究指標(biāo)成分在飲片、中間體、噴霧劑中的傳遞規(guī)律，以期為心痛舒噴霧劑的工藝把關(guān)和質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

Waters ACQITY Arc 型HPLC 儀購自美國Waters 公司；YL-060ST 型超聲波清洗器購自深圳市語路清洗設(shè)備有限公司；AB135-S型電子分析天平購自賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；BT-25S型高速離心機(jī)購自常州市萬豐儀器制造有限公司；HX-200 型中藥粉碎機(jī)購自永康市溪岸五金藥具廠。

1.2 主要藥品與試劑

沒食子酸、氧化芍藥苷、綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ的對照品（批號分別為J05GB153704、N26GB169459、A22GB158496、G13S11L124423、PZ7A11F122339，純度均≥98.0%）均購于上海源葉生物科技有限公司；咖啡酸、芍藥苷、丹皮酚的對照品（批號分別為PS010522、PS000825、PS000281，純度均≥98.0%）均購于成都普思生物科技有限公司；吐溫-80（藥用級）購于上海麥克林生化科技有限公司；乙腈、甲醇為色譜純，甲酸為分析純，水為娃哈哈純凈水。牡丹皮、川芎、冰片飲片和13批心痛舒噴霧劑（批號分別為20221001、20221002、20221003、20221004、20221005、20221006、20221007、20221008、20221009、20221010、20220101、20220201、20220202，編號S1～S13）均由華佗國藥股份有限公司提供。另外，本實(shí)驗室自制了心痛舒噴霧劑6 批，編號S14～S19。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為East Laboratory Epic C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，10%A→15%A；10～24 min，15%A→25%A；24～28 min，25%A→26%A；28～30 min，26%A→30%A；30～48 min，30%A→57%A；48～52 min，57%A→80%A；52～57 min，80%A→10%A；57～62 min，10%A）；流速為0.8 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；檢測波長分別為254、320 nm（指紋圖譜研究時選擇254 nm；含量測定時選擇254 nm作為沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥苷、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、丹皮酚的檢測波長，320 nm作為綠原酸、咖啡酸、阿魏酸的檢測波長）。

2.2 心痛舒噴霧劑的制備

按心痛舒噴霧劑現(xiàn)行工藝進(jìn)行制備[4]，具體為：取牡丹皮235 g，用80%乙醇浸漬48 h，再用65%乙醇緩緩滲漉（料液比約為1∶12），收集漉液，減壓回收乙醇，得牡丹皮流浸膏，備用。取川芎392 g，用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，揮發(fā)油用乙醇溶解后，備用；提取揮發(fā)油后的藥液濾出，藥渣再加水煎煮2 h，煎液與上述藥液合并，濾過，得川芎水提液；將該水提液減壓濃縮至適當(dāng)相對密度，加乙醇使含醇量達(dá)60%，靜置48 h，濾過；濾液減壓回收乙醇，并濃縮至適量，得川芎醇沉濃縮液，備用。取19 g冰片與20 mL 吐溫-80，加適量乙醇混勻，備用。將上述備用的藥液合并，用乙醇及蒸餾水調(diào)整藥液總量為1 000 mL并使含醇量＜30%，混勻，濾過，即得。

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸、氧化芍藥苷、綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、丹皮酚對照品適量至容量瓶中，加入75%甲醇制備成質(zhì)量濃度分別為69.0、72.8、34.8、11.0、366.0、24.2、31.4、379.0 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備

（1）心痛舒噴霧劑供試品溶液的制備：精密吸取心痛舒噴霧劑藥液1 mL 至20 mL 容量瓶中，加75%甲醇至刻度，搖勻，過0.22 μm有機(jī)微孔濾膜，取續(xù)濾液即得。（2）飲片供試品溶液的制備：取牡丹皮、川芎飲片粗粉各0.5 g 至錐形瓶，加75%甲醇50 mL，超聲（頻率40 kHz，功率360 W）提取30 min；補(bǔ)足失重，離心，取上清液，過0.22 μm 有機(jī)微孔濾膜，取續(xù)濾液即得。（3）中間體供試品溶液的制備：按“2.2”項下處方中各飲片量與制備工藝，制得牡丹皮滲漉液和流浸膏樣品，川芎水提液和醇沉濃縮液樣品，分別按“2.3.2（1）”項下方法制備即得。（4）陰性對照供試品溶液制備：按“2.2”項下處方中各飲片量與制備工藝，制得缺川芎、缺牡丹皮的陰性對照樣品，分別按“2.3.2（1）”項下方法制備即得。

2.4 心痛舒噴霧劑HPLC圖譜的建立

2.4.1 精密度試驗

取S1 號心痛舒噴霧劑樣品，按“2.3.2（1）”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行檢測，連續(xù)進(jìn)樣6 次，獲取色譜圖。以31 號峰（丹皮酚，下同）為參照峰，計算得各共有峰的相對保留時間RSD＜0.13%，相對峰面積RSD＜2.99%（n＝6），符合中藥指紋圖譜的要求。

2.4.2 重復(fù)性試驗

取S1 號心痛舒噴霧劑樣品，按“2.3.2（1）”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行檢測，獲取色譜圖。以31號峰為參照峰，計算得各共有峰的相對保留時間RSD＜0.18%，相對峰面積RSD＜4.46%（n＝6），符合中藥指紋圖譜的要求。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗

取S1 號心痛舒噴霧劑樣品，按“2.3.2（1）”項下方法制備供試品溶液，分別在室溫放置0、2、4、8、12、24 h 時按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行檢測，獲取色譜圖。以31 號峰為參照峰，計算得各共有峰的相對保留時間RSD＜0.21%，相對峰面積RSD＜3.51%（n＝6），符合中藥指紋圖譜的要求。

2.4.4 指紋圖譜的建立和相似度評價

取13 批（編號S1～S13）心痛舒噴霧劑樣品，按“2.3.2（1）”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行檢測。將獲取的色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）》，將S1 批次設(shè)為參照圖譜，對照圖譜生成方法選擇平均數(shù)法，時間窗寬度設(shè)為0.1，經(jīng)過多點(diǎn)校正后進(jìn)行峰匹配獲得對照圖譜R 及13批樣品的疊加圖譜，如圖1所示。結(jié)果顯示，共標(biāo)定共有峰33 個，其中31 號峰（丹皮酚）峰面積最大，分離度較好，故選擇31號峰為參照峰；各批次心痛舒噴霧劑樣品與對照圖譜的相似度均≥0.994，表明各批次樣品之間的差異性較小。

圖1 13批心痛舒噴霧劑的指紋圖譜和對照圖譜R

2.4.5 共有峰的指認(rèn)和歸屬

取“2.3.1”項下混合對照品溶液、“2.3.2（4）”項下陰性對照供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行檢測，獲得色譜圖。如圖2所示，將對照圖譜R 與混合對照品圖譜進(jìn)行比對，指認(rèn)出5號峰為沒食子酸、9號峰為氧化芍藥苷、10 號峰為綠原酸、14 號峰為咖啡酸、17 號峰為芍藥苷、21 號峰為阿魏酸、27 號峰為洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、31 號峰為丹皮酚。將對照圖譜R與缺川芎、缺牡丹皮的陰性對照圖譜進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，2、3、5、9、12、16～20、22、23、25、26、28～31 號峰歸屬于牡丹皮；1～4、6～8、10、11、13～15、21、24、25、27、28、32、33 號峰歸屬于川芎，其中2、3、25、28號峰同時歸屬于牡丹皮和川芎。

圖2 各樣品含量測定專屬性試驗的HPLC圖譜

2.5 8個指認(rèn)成分的含量測定

2.5.1 專屬性試驗

取空白溶劑、混合對照品溶液、S1 號心痛舒噴霧劑供試品溶液及陰性對照供試品溶液按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行檢測，并記錄色譜圖。如圖3所示，空白溶劑基線平整，除溶劑峰外無干擾峰；在各對照品成分的相應(yīng)位置上，心痛舒噴霧劑供試品中均有色譜峰與之對應(yīng)；陰性對照供試品中也無色譜峰干擾，表明該方法專屬性較好，可以用于含量測定。

圖3 專屬性試驗考察結(jié)果

2.5.2 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.3.1”項下混合對照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、4.0、5.0 mL，分別置于5 mL 容量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，搖勻；過0.22 μm 有機(jī)微孔濾膜，取續(xù)濾液按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），獲得各成分的回歸方程和線性范圍，同時測定檢測限和定量限，結(jié)果見表1。

2.5.3 精密度試驗

取“2.3.1”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，沒食子酸、氧化芍藥苷、綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、丹皮酚峰面積的RSD 分別為0.02%、0.09%、0.06%、0.05%、0.10%、0.20%、0.11%、0.40%（n＝6），表明儀器精密度較好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗

取S1 號心痛舒噴霧劑樣品，按“2.3.2（1）”項下方法制備供試品溶液，分別在室溫放置0、2、4、8、12、24 h 時按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行檢測，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，沒食子酸、氧化芍藥苷、綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、丹皮酚峰面積的RSD 分別為0.26%、0.46%、0.16%、0.17%、0.20%、0.28%、0.09%、0.12%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.5.5 重復(fù)性試驗

取S1 號心痛舒噴霧劑樣品，按“2.3.2（1）”項下方法平行制備供試品溶液6份，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行檢測，記錄色譜圖，然后代入回歸方程中計算含量。結(jié)果顯示，沒食子酸、氧化芍藥苷、綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、丹皮酚含量的RSD 分別為0.53%、0.27%、0.61%、0.68%、0.56%、0.38%、1.89%、0.57%（n＝6），表明方法重復(fù)性較好。

2.5.6 加樣回收率試驗

取各對照品適量，用75%甲醇配制成沒食子酸、氧化芍藥苷、綠原酸、咖啡酸、芍藥苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、丹皮酚質(zhì)量濃度分別為0.704、0.874、0.351、0.106、2.900、0.197、0.309、3.780 mg/mL 的混合對照品溶液；精密吸取混合對照品溶液和已知濃度的心痛舒噴霧劑供試品溶液（編號S1）各0.5 mL，置于20 mL 容量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，平行制備6 份；再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，計算加樣回收率。結(jié)果顯示，上述8種的平均加樣回收率分別為98.57%、100.34%、104.75%、98.81%、102.35%，97.04%、101.14%、98.20%，RSD 分別為0.81%、1.50%、1.58%、1.31%、1.70%、2.69%、0.82%、0.19%（n＝6）。結(jié)果見表2。

表2 8個成分的加樣回收試驗結(jié)果

2.5.7 樣品含量測定

取心痛舒噴霧劑樣品（編號S1～S13），按“2.3.2（1）”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行檢測，記錄各待測成分的峰面積，然后代入回歸方程中計算含量，結(jié)果見表3。心痛舒噴霧劑的國家標(biāo)準(zhǔn)為丹皮酚含量＞1.6 mg/mL，企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)為丹皮酚含量＞2.6 mg/mL、阿魏酸含量＞0.15 mg/mL，由此可見13 批心痛舒噴霧劑均合格，但在成分的含量上存在一定差異。為探明影響心痛舒噴霧劑質(zhì)量的關(guān)鍵工藝，本研究選擇丹皮酚和阿魏酸為指標(biāo)成分，進(jìn)一步探究其在飲片、中間體、噴霧劑中的傳遞規(guī)律，全面剖析制備工藝。

表3 8個成分的含量測定結(jié)果（n＝3，mg/mL）

2.5.8 指標(biāo)成分的傳遞規(guī)律分析

取S14～S19 批次實(shí)驗室自制的心痛舒噴霧劑樣品和對應(yīng)的牡丹皮、川芎飲片及牡丹皮滲漉液、流浸膏，川芎水提液、醇沉濃縮液等中間體樣品，按“2.3.2”項下相應(yīng)方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行檢測，記錄各供試品中指標(biāo)成分丹皮酚和阿魏酸的峰面積，代入回歸方程中計算丹皮酚和阿魏酸兩種指標(biāo)成分在各樣品中的總量，結(jié)果如表4和表5所示。結(jié)果顯示，丹皮酚從飲片→噴霧劑總量的平均轉(zhuǎn)移率為63.76%，在滲漉提取和減壓蒸餾提取中損失較大，損失比例超30%；阿魏酸從飲片→噴霧劑總量的平均轉(zhuǎn)移率為38.06%，在水蒸氣蒸餾提取中損失較大，損失比例超50%。

表4 飲片、中間體、噴霧劑中丹皮酚的傳遞結(jié)果

表5 飲片、中間體、噴霧劑中阿魏酸的傳遞結(jié)果

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

本文考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸4 種不同的流動相體系，結(jié)果顯示，以乙腈-0.1%甲酸為流動相，所得色譜峰數(shù)量最多，且分離和響應(yīng)效果最好。前期筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[6―8]，對心痛舒噴霧劑供試品和對照品進(jìn)行了全波長掃描，最終含量測定時選擇254 nm作為沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥苷、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、丹皮酚的檢測波長，選擇320 nm作為綠原酸、咖啡酸、阿魏酸的檢測波長；且發(fā)現(xiàn)在254 nm波長下色譜峰數(shù)目多、響應(yīng)高、分離度較好，故選擇254 nm作為指紋圖譜的檢測波長。筆者還考察了3 種不同的柱溫（25、30、35 ℃）和3 種不同的流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）對色譜分離效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在柱溫30 ℃、流速0.8 mL/min時，色譜圖峰形均較為對稱，分離度較好。

3.2 心痛舒噴霧劑樣品稀釋溶劑的優(yōu)化

本文前期考察了10%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、甲醇4種不同的樣品稀釋溶劑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用10%甲醇和50%甲醇作為稀釋溶劑時，色譜圖峰面積降低，可能的原因是心痛舒噴霧劑中絕大多數(shù)成分為脂溶性成分，當(dāng)稀釋溶劑中水的含量升高時導(dǎo)致脂溶性成分不溶解，色譜峰面積降低；當(dāng)采用甲醇作為樣品稀釋溶劑時，沒食子酸和綠原酸的色譜峰均發(fā)生了前延與分叉，推測產(chǎn)生了溶劑化效應(yīng)。因此，本研究最終選擇75%甲醇作為稀釋溶劑，所得色譜圖峰形較為對稱。

3.3 基于指標(biāo)成分的傳遞規(guī)律分析

心痛舒噴霧劑制備工藝復(fù)雜，其工藝參數(shù)上的不均一則可能導(dǎo)致質(zhì)量上的差異。本文選取牡丹皮和川芎的藥典質(zhì)控成分丹皮酚和阿魏酸作為指標(biāo)成分，探究其在飲片、中間體、噴霧劑中的傳遞規(guī)律。結(jié)果顯示，牡丹皮的滲漉提取和減壓濃縮及川芎的水蒸氣蒸餾提取是指標(biāo)成分顯著損失的關(guān)鍵工藝。

在牡丹皮的滲漉提取中，乙醇的濃度、用量和滲漉速度等參數(shù)均會影響丹皮酚的提取率，此外丹皮酚具有隨水蒸氣蒸餾的物理性質(zhì)，因此減壓濃縮時的溫度、轉(zhuǎn)速、真空度等參數(shù)也會顯著影響丹皮酚的提取率。在川芎的水提工藝中阿魏酸損失較高，筆者查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，川芎水提時阿魏酸轉(zhuǎn)移率普遍較低，如高揚(yáng)等[9]發(fā)現(xiàn)阿魏酸從飲片至標(biāo)準(zhǔn)湯劑的平均轉(zhuǎn)移率為37.7%，莫雨佳等[10]發(fā)現(xiàn)阿魏酸從飲片至全方水煎液的平均轉(zhuǎn)移率為45.97%。因此，筆者推測導(dǎo)致阿魏酸轉(zhuǎn)移率低的主要原因與其水溶性較差有關(guān)，建議在水提川芎時，可以通過增加加水量、提取次數(shù)，添加乙醇和趁熱過濾等操作來增加阿魏酸轉(zhuǎn)移率。

綜上所述，本文建立的指紋圖譜和多成分含量測定方法重復(fù)性好、專屬性強(qiáng)，可以用于心痛舒噴霧劑的質(zhì)量評價；其次，本文探明了丹皮酚和阿魏酸兩種指標(biāo)成分在飲片、中間體、噴霧劑中的傳遞規(guī)律，明確了影響心痛舒噴霧劑質(zhì)量的關(guān)鍵工藝，可以為企業(yè)的生產(chǎn)和工藝優(yōu)化提供參考。