曾海燕 ，簡(jiǎn)麗娜 ，吳輝星 ，周本杰 ，鄉(xiāng)世健 #[1.中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院（光明）檢驗(yàn)科，廣東 深圳518106；.廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 東莞 53808；3.中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 深圳 518107；4.深圳市中藥活性物質(zhì)篩選與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518107]

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）以過量飲酒以外的原因引起的肝臟甘油三酯（triglyceride，TG）水平升高為特征，影響著全球25%的成年人；NAFLD 具有很高的肝臟相關(guān)代謝合并癥的發(fā)病率，給醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)帶來了越來越大的壓力[1]。NAFLD 的治療選擇非常有限，目前首選的治療方法仍然是運(yùn)動(dòng)和改善飲食，尚無批準(zhǔn)上市的NAFLD 治療藥物，因此，開發(fā)安全低毒且藥效確切的治療藥物迫在眉睫。NAFLD 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能涉及多種代謝和免疫因素，最近的研究表明，腸道菌群在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色[2]，腸道菌群可通過影響腸道代謝產(chǎn)物[3]、改變腸黏膜屏障通透性、增加菌群易位等方式影響肝臟疾病進(jìn)程。NAFLD的嚴(yán)重程度與腸道生態(tài)和共生細(xì)菌代謝功能失調(diào)有關(guān)[4]，因此，腸道微生物群的調(diào)節(jié)可作為改善NAFLD的有效策略。

異甘草素是一種從中藥甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.根和根莖中分離得到的天然類黃酮，可通過調(diào)節(jié)肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝、降低炎癥反應(yīng)等病理情況發(fā)揮改善NAFLD的作用[5]，且有效劑量下的異甘草素在體內(nèi)外對(duì)正常細(xì)胞的毒性作用非常小[6]，具有開發(fā)成NAFLD治療藥物的潛在價(jià)值。有研究表明，異甘草素可通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)來降低結(jié)腸炎相關(guān)直腸癌的發(fā)病率[7]，但其對(duì)NAFLD 小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用及其治療NAFLD的關(guān)系尚未完全闡明?；诖?，本研究擬以高脂飲食（high-fat diet，HFD）誘導(dǎo)NAFLD小鼠模型，通過探討異甘草素對(duì)NAFLD模型小鼠腸道菌群和腸屏障功能的調(diào)控作用，闡明其改善NAFLD的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有ChemiDoc MP型成像系統(tǒng)、PowerPac Basic 型電泳系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司），EG1150H+C型組織包埋機(jī)（德國Leica公司），QuantStudioTM3 型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司），QuantiFluorTM-ST 型藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（美國Promega 公司），K5800/C/H/T 型超微量分光光度計(jì)（北京凱奧科技發(fā)展公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

異甘草素（批號(hào)I111283，純度99%）購自上海阿拉丁生化科技有限公司；BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒（批號(hào)P0010）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒、兔源閉合蛋白4（Claudin-4）單克隆抗體、兔源閉合蛋白（Occludin）單克隆抗體（批號(hào)分別為KF8001、ab210796、ab216327）均購自英國Abcam 公司；鼠源β-actin單克隆抗體（批號(hào)T0022）購自江蘇親科生物研究中心；兔源緊密連接蛋白1（ZO-1）多克隆抗體（批號(hào)21773-1-AP）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（批號(hào)分別為BA1054、BA1050）均購自武漢博士德生物工程有限公司；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）測(cè)定試劑盒和TG測(cè)定試劑盒（批號(hào)分別為C009-2-1、C010-2-1、A111-1-1、A110-1-1）均購自南京建成生物工程研究所有限公司；白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒均購自深圳欣博盛生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼料

本研究所用6 周齡雄性C57BL/6J 小鼠由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重18～20 g，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（粵）2018-0002。將小鼠飼養(yǎng)在SPF 實(shí)驗(yàn)室中，環(huán)境溫度為（25±2）℃，濕度為50%～75%，在光照12 h（早上7：00 至晚上19：00）和黑暗12 h（晚上19：00至早上7：00）循環(huán)中飼養(yǎng)。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2 周后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)為LL-KT-2021062）。

高脂肪飼料（蛋白質(zhì)20%、脂肪60%、碳水化合物20%）購自戴茨生物科技（無錫）有限公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、造模與給藥

將30只小鼠隨機(jī)分為3組，每組10只：正常組（簡(jiǎn)寫為“NFD 組”）飼喂普通飼料和飲用水，模型組（簡(jiǎn)寫為“HFD 組”）和異甘草素組（簡(jiǎn)寫為“ISL 組”）飼喂高脂飼料19 周建立NAFLD 模型。根據(jù)前期研究與本次研究目的，在造模同時(shí)，ISL 組按100 mg/kg 灌胃異甘草素[8]，其余各組灌胃等量超純水，每日1次，然后每周測(cè)定小鼠體重。在實(shí)驗(yàn)過程中，NFD 組和HFD 組小鼠因同籠打斗均死亡2只。在實(shí)驗(yàn)最后一天，收集小鼠糞便，液氮速凍，然后于-80 ℃保存?zhèn)溆?；隨后禁食18 h，摘眼球取血后頸椎脫臼處死。取小鼠白色脂肪（腹股溝脂肪和附睪脂肪）和棕色脂肪組織、肝臟和結(jié)腸組織，分別稱重，計(jì)算器官指數(shù)，器官指數(shù)＝器官質(zhì)量/體重；組織樣本液氮速凍，然后于-80 ℃保存，或以4%多聚甲醛進(jìn)行固定，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均符合實(shí)驗(yàn)倫理。

2.2 小鼠肝臟組織、結(jié)腸組織的病理變化及肝臟脂質(zhì)堆積情況觀察

將小鼠肝臟或結(jié)腸組織置于4%多聚甲醛中固定24 h，經(jīng)過脫水、石蠟包埋、組織梯度脫水等操作后，使用切片機(jī)進(jìn)行切片，再進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，以甘油封片后在顯微鏡下觀察并置于切片掃描儀中掃描，觀察肝臟或結(jié)腸組織的病理形態(tài)，然后根據(jù)肝臟病理改變計(jì)算非酒精性脂肪性肝病活動(dòng)評(píng)分（NAFLD activity score，NAS）。取冷凍的小鼠肝臟組織進(jìn)行切片，待切片干燥后在10%多聚甲醛中固定15 min；以蒸餾水輕輕漂洗，在60%異丙醇溶液中浸洗5 min，然后置于油紅O染色液中染色15 min；以蒸餾水漂洗染色液，再置于蘇木素染色液中浸染30 s；以蒸餾水洗凈染色液，經(jīng)甘油封片后掃描，觀察肝臟脂質(zhì)積累情況（脂質(zhì)被染成紅色），并使用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算脂質(zhì)染色面積占比。

2.3 小鼠肝臟組織或血清中脂質(zhì)與肝功能指標(biāo)的檢測(cè)

取各組小鼠部分肝臟組織進(jìn)行勻漿，作為肝臟組織樣品。將小鼠全血以3 000 r/min 離心，取上清液，作為血清樣品。取上述兩種樣品，根據(jù)試劑盒說明書方法，檢測(cè)肝臟組織或血清中TC、TG、ALT和AST的水平。

2.4 小鼠血清中炎癥因子水平的檢測(cè)

取“2.3”項(xiàng)下血清樣品，根據(jù)試劑盒說明書方法，檢測(cè)小鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α的水平。

2.5 小鼠肝臟組織中炎癥因子mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)

采用TRIzol 試劑從小鼠肝臟組織中分離總RNA，再將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行熒光定量PCR。采用2-ΔΔCt法，以Actb為內(nèi)參，計(jì)算IL-6、IL-1β、TNF-α 的 mRNA 表達(dá)水平。引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度見表1。

表1 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度

2.6 小鼠糞便的16S rRNA測(cè)序

將收集的各組小鼠糞便樣本進(jìn)行16S rRNA 測(cè)序。采用DNA提取試劑盒提取基因組DNA，擴(kuò)增16S rRNA基因V3-V4 區(qū)，純化擴(kuò)增子，制備測(cè)序文庫，進(jìn)行Illumina 測(cè)序分析，原始數(shù)據(jù)經(jīng)過拼接質(zhì)控后生成OTUs（operational taxonomic units）聚類。將樣品進(jìn)行區(qū)分后基于美吉生物云平臺(tái)（https：//www.majorbio.com）進(jìn)行OTUs 聚類分析和物種分析。根據(jù)分類信息，可以在不同的分類層次上統(tǒng)計(jì)分析群落結(jié)構(gòu)，然后對(duì)各組OTUs聚類進(jìn)行β多樣性分析（主成分分析和主坐標(biāo)分析）、物種組成分析（形成群落組成Bar 圖）、LEfSe 多級(jí)物種差異判別分析等，同時(shí)制作屬水平群落熱圖等。

2.7 小鼠各項(xiàng)指標(biāo)與腸道菌群豐度的Spearman 相關(guān)性分析

將每只小鼠的各項(xiàng)檢測(cè)參數(shù)（包括體重，肝臟質(zhì)量，肝指數(shù)，血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 水平，肝臟中TC 水平，血清中TC、ALT 水平）與候選菌屬的相對(duì)豐度導(dǎo)入SangerBox 軟件中的相關(guān)分析工具進(jìn)行Spearman 相關(guān)性分析，導(dǎo)出相關(guān)性熱圖，紅色代表正相關(guān)，綠色代表負(fù)相關(guān)，顏色越深代表相關(guān)性越大。

2.8 小鼠結(jié)腸組織中腸屏障功能相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

稱取各組小鼠（3 只）結(jié)腸組織適量進(jìn)行勻漿，于4 ℃下以12 000 r/min離心15 min；取上清液，用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定其濃度并加熱變性。取蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳，再轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫封閉并于特定的一抗（Claudin-4、Occludin、ZO-1的稀釋度均為1∶1 000，β-actin的稀釋度為1∶10 000）中孵育過夜，然后用特異性二抗進(jìn)行印跡。采用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)免疫反應(yīng)性，以β-actin 為內(nèi)參，采用Image J軟件進(jìn)行分析，以目的蛋白與內(nèi)參的灰度值比值表示其表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和圖表繪制。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析和Tukey檢驗(yàn)。菌群相對(duì)豐度采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗(yàn)和Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 異甘草素對(duì)NAFLD模型小鼠肥胖癥狀的影響

如圖1所示，隨著實(shí)驗(yàn)的推進(jìn)，HFD 組小鼠體重逐漸高于NFD組小鼠，而經(jīng)異甘草素干預(yù)后小鼠體重曲線與NFD組接近。與NFD組比較，HFD組小鼠體重、肝指數(shù)、白色脂肪指數(shù)均顯著升高（P＜0.05），棕色脂肪指數(shù)顯著降低（P＜0.05）；與HFD 組比較，ISL 組小鼠上述指標(biāo)（白色脂肪指數(shù)除外）均顯著逆轉(zhuǎn)（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

圖1 各組小鼠體重變化情況

表2 各組小鼠肝指數(shù)、白色脂肪指數(shù)和棕色脂肪指數(shù)的檢測(cè)結(jié)果（±s）

a：與NFD組比較，P＜0.05；b：與HFD組比較，P＜0.05。

n 組別NFD組HFD組ISL組8 8 10體重/g 28.40±0.69 35.48±1.11a 31.00±0.41b肝指數(shù)0.039±0.001 9 0.048±0.000 6 a 0.042±0.002 9 b白色脂肪指數(shù)0.013±0.005 5 0.034±0.008 3a 0.028±0.006 7棕色脂肪指數(shù)0.003 1±0.000 53 0.001 9±0.000 37a 0.002 6±0.000 35b

3.2 異甘草素對(duì)NAFLD 小鼠肝臟組織病理變化及脂質(zhì)堆積的影響

NFD 組小鼠肝臟組織細(xì)胞排列整齊；與NFD 組比較，HFD 組小鼠肝細(xì)胞肥大、空泡化、炎癥細(xì)胞浸潤，NAS 和脂質(zhì)染色面積占比均顯著增加（P＜0.05）；與HFD組比較，ISL組小鼠肝臟組織炎癥與損傷顯著改善，NAS 和脂質(zhì)染色面積占比均顯著減少（P＜0.05）。結(jié)果見圖2、表3。

表3 各組小鼠肝臟NAS 和脂質(zhì)染色面積的檢測(cè)結(jié)果（±s）

表3 各組小鼠肝臟NAS 和脂質(zhì)染色面積的檢測(cè)結(jié)果（±s）

a：與NFD組比較，P＜0.05；b：與HFD組比較，P＜0.05。

n 組別NFD組HFD組ISL組8脂質(zhì)染色面積占比/%0 46.59±5.71a 27.51±6.78b 8 10 NAS 0 4.5±1.12a 3.0±0.87b

3.3 異甘草素對(duì)NAFLD 小鼠脂質(zhì)含量與肝功能指標(biāo)水平的影響

與NFD組比較，HFD組小鼠肝臟和血清中TC水平以及血清中AST、ALT 水平均顯著升高（P＜0.05）；與HFD組比較，ISL組小鼠上述指標(biāo)水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表4。

表4 各組小鼠肝臟和（或）血清中TC、TG、AST、ALT水平的檢測(cè)結(jié)果（±s）

表4 各組小鼠肝臟和（或）血清中TC、TG、AST、ALT水平的檢測(cè)結(jié)果（±s）

a：與NFD組比較，P＜0.05；b：與HFD組比較，P＜0.05。

n 組別NFD組HFD組ISL組8 8 10肝臟中TC/（mmol/L）7.70±0.43 14.57±1.88a 11.17±2.95b肝臟中TG/（mmol/L）2.66±0.29 4.73±0.66a 4.13±0.31b血清中TC/（mmol/L）2.60±1.10 6.69±3.20 a 2.33±0.75b血清中AST/（U/L）117.25±11.18 159.29±28.81a 113.25±23.94b血清中ALT/（U/L）26.40±5.03 43.20±9.35a 32.52±0.31b

3.4 異甘草素對(duì)NAFLD 小鼠血清中炎癥因子水平的影響

與NFD 組比較，HFD 組小鼠血清中IL-6、IL-1β 和TNF-α水平均顯著升高（P＜0.05）；與HFD組比較，ISL組小鼠上述指標(biāo)水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表5。

表5 各組小鼠血清中炎癥因子水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，pg/mL）

表5 各組小鼠血清中炎癥因子水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，pg/mL）

a：與NFD組比較，P＜0.05；b：與HFD組比較，P＜0.05。

n 組別NFD組HFD組ISL組8 TNF-α 224.67±95.37 337.22±93.27a 208.10±37.80b 8 10 IL-6 78.70±16.11 105.28±11.75 a 60.39±17.84 b IL-1β 65.67±14.33 120.39±27.22 a 67.59±23.03 b

3.5 異甘草素對(duì)NAFLD 小鼠肝臟組織中炎癥因子mRNA表達(dá)水平的影響

與NFD 組比較，HFD 組小鼠肝臟組織中TNF-α mRNA 表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），IL-6、IL-1β mRNA 表達(dá)水平升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與HFD 組比較，ISL 組小鼠TNF-α mRNA 表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），IL-6、IL-1β mRNA 表達(dá)水平降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表6。

表6 各組小鼠肝臟組織中炎癥因子mRNA 表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果（±s）

表6 各組小鼠肝臟組織中炎癥因子mRNA 表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果（±s）

a：與NFD組比較，P＜0.05；b：與HFD組比較，P＜0.05。

n 組別NFD組HFD組ISL組8 TNF-α mRNA 1.00±0.48 5.35±0.56a 3.92±0.38b 8 10 IL-6 mRNA 1.00±0.55 1.30±0.60 0.90±0.10 IL-1β mRNA 1.00±0.14 1.16±0.30 0.69±0.10

3.6 異甘草素對(duì)NAFLD小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

16S rRNA 基因測(cè)序從26 個(gè)樣本中產(chǎn)生了890 154個(gè)序列，根據(jù)97%的相似性將序列分為984 個(gè)OTUs。采用主成分分析和主坐標(biāo)分析對(duì)各樣本進(jìn)行差異分析，如圖3所示，各組樣本聚集度均較好，但HFD 組與NFD組差異較大，HFD 組和ISL 組之間也有明顯距離，說明各組樣本間差異明顯。在3組小鼠腸道中，F(xiàn)irmicutes門和Bacteroidetes門占主導(dǎo)地位。與NFD組比較，HFD組小鼠的Firmicutes/Bacteroidetes 值顯著升高；與HFD 組比較，ISL 組小鼠的Firmicutes/Bacteroidetes 值顯著降低（P＜0.05），結(jié)果見圖4。圖5 展示了小鼠腸道菌群種屬中總豐度排名前50的菌屬，其中異甘草素可部分逆轉(zhuǎn)因NAFLD改變的屬水平腸道菌群豐度。

圖3 小鼠腸道菌群的β多樣性分析

圖4 各組小鼠腸道菌群門水平群落組成

圖5 各組小鼠腸道菌群屬水平群落的熱圖

采用LEfSe 分析檢測(cè)豐度差異顯著的特征，尋找顯著差異的種屬，結(jié)合小鼠腸道菌群種屬總豐度排名前50的菌屬結(jié)果，篩選出異甘草素可顯著影響的10個(gè)代表性菌屬，其中可顯著上調(diào)NAFLD小鼠腸道中益生菌norank_f_Muribaculaceae、Odoribacter、Ruminiclostridium、Akkermansia的相對(duì)豐度，顯著下調(diào)有害菌Desulfovibrio、norank_f_Lachnospiraceae、unclassified_p_Firmicutes、Ileibacterium、unclassified_f_Lachnospiraceae、Turicibacter的相對(duì)豐度（P＜0.05）。結(jié)果見圖6。

圖6 10個(gè)代表性菌屬相對(duì)豐度的組間比較

3.7 小鼠各項(xiàng)指標(biāo)與腸道菌群豐度的相關(guān)性分析結(jié)果

基于上述10個(gè)代表性菌屬發(fā)現(xiàn)，有4個(gè)菌屬與小鼠NAFLD 指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)，6 個(gè)菌屬呈正相關(guān)，其中相關(guān)性較大的菌屬包括norank_f_Muribaculaceae，Odoribacter，Akkermansia，Ileibacterium，unclassified_p_Firmicutes等，結(jié)果見圖7。

圖7 腸道菌屬與小鼠代謝參數(shù)的相關(guān)性分析

3.8 異甘草素對(duì)NAFLD小鼠腸黏膜屏障功能的影響

結(jié)腸組織病理染色結(jié)果顯示，NFD組小鼠腸道絨毛較為完整，未出現(xiàn)病理改變；與NFD 組比較，HFD 組小鼠腸道絨毛完整性受損，出現(xiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤，Claudin-4、Occludin、ZO-1 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）；與HFD組比較，ISL組小鼠腸道有明顯改善，上述指標(biāo)水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖8、圖9、表7。

圖8 各組小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)觀察結(jié)果

圖9 各組小鼠腸屏障功能相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖

表7 各組小鼠腸黏膜屏障功能相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝3）

表7 各組小鼠腸黏膜屏障功能相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝3）

a：與NFD組比較，P＜0.05；b：與HFD組比較；P＜0.05。

組別NFD組HFD組ISL組Claudin-4/β-actin 1.00±0.26 0.42±0.05a 1.22±0.13b Occludin/β-actin 1.00±0.05 0.66±0.03a 0.90±0.15b ZO-1/β-actin 1.00±0.17 0.38±0.06a 0.76±0.10b

4 討論

NAFLD的發(fā)病機(jī)制目前并未完全闡明，脂質(zhì)代謝、炎癥和纖維化是研究治療NAFLD藥物時(shí)重點(diǎn)關(guān)注的方向[9]。異甘草素抗炎作用明確，本研究表明其可以顯著減緩NAFLD小鼠體重的增加速度，改善肝臟脂質(zhì)積累、炎癥和損傷，具有良好的護(hù)肝抗炎作用，可有效緩解NAFLD 癥狀。棕色脂肪組織是一種獨(dú)特的產(chǎn)熱組織，在新陳代謝和能量消耗中起重要作用，最近已成為對(duì)抗肥胖、糖尿病和NAFLD 等代謝性疾病的靶標(biāo)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，異甘草素可顯著升高NAFLD 小鼠棕色脂肪指數(shù)，從而增加小鼠機(jī)體能量消耗效率。

腸道菌群失調(diào)在NAFLD發(fā)展中起關(guān)鍵作用。腸道和肝臟之間的相互作用，稱為“腸-肝軸”。腸道菌群產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物通過門靜脈隨血流進(jìn)入肝臟，包括酚類、乙醛、氨以及其他促炎成分，如肽聚糖和脂多糖等，這些代謝產(chǎn)物可啟動(dòng)先天性免疫系統(tǒng)，從而導(dǎo)致肝臟炎癥的發(fā)生[11]。本研究通過16S rRNA 菌群測(cè)序發(fā)現(xiàn)，異甘草素可改善NAFLD 模型小鼠的腸道菌群紊亂情況，結(jié)合LEfSe 分析結(jié)果，篩選出10 個(gè)異甘草素顯著調(diào)控的菌屬；結(jié)合Spearman 相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，異甘草素可顯著上調(diào)益生菌norank_f_Muribaculaceae和Akkermansia（這兩種菌與NAFLD 相關(guān)指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)），可顯著下調(diào)有害菌Ileibacterium、Turicibacter（這兩種菌與NAFLD 相關(guān)指標(biāo)呈正相關(guān)）。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Akkermansia可代謝產(chǎn)生丙酸鹽，從而激活G蛋白偶聯(lián)受體43，緩解NAFLD造成的脂肪積累，降低胰島素抵抗；且Akkermansia表面的配體可結(jié)合腸道黏膜表面的Toll 樣受體2，從而改善腸道炎癥和腸黏膜屏障損傷[12]。Ileibacterium被報(bào)道其豐度與結(jié)腸炎和動(dòng)脈粥樣硬化呈正相關(guān)[13―14]。腸黏膜屏障對(duì)于吸收人體必需營養(yǎng)物質(zhì)以及防止腸道有害微生物入侵至關(guān)重要，其功能改變可導(dǎo)致腸道黏膜通透性增加。Claudin-4、Occludin、ZO-1 等腸道屏障功能相關(guān)蛋白的表達(dá)下降，可增加細(xì)菌產(chǎn)生的病原體相關(guān)分子模式從腸道中經(jīng)肝門靜脈進(jìn)入肝臟的可能性，進(jìn)而引起肝臟炎癥，促進(jìn)NAFLD的進(jìn)程[15]。本研究結(jié)果顯示，異甘草素可顯著升高腸道屏障功能相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。這提示，異甘草素可通過調(diào)節(jié)腸道菌群，改善腸黏膜屏障，進(jìn)而緩解NAFLD。

綜上所述，異甘草素可顯著延緩NAFLD的進(jìn)展，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)腸道菌群、改善腸屏障功能有關(guān)。