馮明慶 ，楊 楠 ，方 媛 ，廖太陽(yáng) ，王培民 ，劉子修 #（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨傷科，南京210029；2.江蘇省中醫(yī)院骨傷科，南京 210029）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是涉及到軟骨、軟骨下骨、韌帶、關(guān)節(jié)囊、滑膜以及周邊肌肉等結(jié)構(gòu)改變的一種退行性疾?。?］。近年來(lái)由于人們生活習(xí)慣的改變，KOA已成為一種常見(jiàn)的疾病，對(duì)患者個(gè)人和衛(wèi)生保健系統(tǒng)都造成很大的影響［2］。目前，針對(duì)KOA的主要治療手段有口服非甾體抗炎藥、對(duì)乙酰氨基酚［3］，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射皮質(zhì)類固醇、玻璃酸鈉等［4］。然而非甾體抗炎藥雖然具有一定療效，但易引起心血管疾病，對(duì)乙酰氨基酚則會(huì)引起過(guò)敏及胃腸道不良反應(yīng)；關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射則易引起感染，且可能對(duì)軟骨造成不良影響［5］。

江蘇省中醫(yī)院自主研發(fā)改進(jìn)的“三色散”方可有效改善膝關(guān)節(jié)腫脹、疼痛，以及膝關(guān)節(jié)功能障礙等臨床癥狀［6］，對(duì)軟組織急慢性損傷及足跟疼痛也有顯著治療效果［7］。本課題組在前期研究中使用三色散藥材粉碎后的藥粉顆粒制備凝膠貼膏，以綜合感官、初黏力、持黏力、剝離強(qiáng)度為評(píng)價(jià)指標(biāo)篩選基質(zhì)處方，得到傳統(tǒng)工藝凝膠貼膏的最佳配比［8］，然而也發(fā)現(xiàn)藥粉顆粒作為原料藥制備所得的凝膠貼膏內(nèi)含雜質(zhì)較多，手感較為粗糙；但若只進(jìn)行粉碎過(guò)篩，所得產(chǎn)物中含有大量不含藥理活性的成分，在目前固定投藥量的制備方法下有效成分的含量低于溶劑提取方法，且存在不便于貯存及較難制定質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的缺點(diǎn)。故本研究通過(guò)比較三色散凝膠貼膏原料藥在不同提取方式下制備所得的凝膠貼膏的抗炎鎮(zhèn)痛藥效與方中主要成分的含量，來(lái)優(yōu)化其提取方式。

1 材料

1.1 主要儀器

Alliance 2695e 型高效液相色譜儀購(gòu)自沃特世科技（上海）有限公司；7500型實(shí)時(shí)定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems 公司；35150 型冷熱板購(gòu)自意大利Ugo Basile 公司；Enspire 型酶標(biāo)儀購(gòu)自珀金埃爾默企業(yè)管理（上海）有限公司；BioPhotometer型核酸蛋白測(cè)試儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；Mini-protein Tetra型電泳及轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；LAS4000 型超靈敏化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)GE公司；MS105DU型電子天平購(gòu)自梅特勒托利多科技（中國(guó)）有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

三色散（由蔓荊子、紫荊皮、當(dāng)歸、木瓜、丹參、赤芍、白芷、片姜黃、獨(dú)活、羌活、天花粉、川牛膝、威靈仙、防己、防風(fēng)、馬錢(qián)子、秦艽、連翹、川芎、甘草按16∶16∶4∶4∶4∶4∶4∶4∶4∶4∶4∶4∶4∶4∶4∶4∶2∶2∶2∶1 的質(zhì)量比混合而成，批號(hào)Z04000566）購(gòu)自江蘇省中醫(yī)院中藥房；蔓荊子黃素對(duì)照品（批號(hào)111554-201705，純度98.30%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；馬錢(qián)子堿、士的寧對(duì)照品（批號(hào)分別為RP200721、RP190320，純度分別為99.58%、98.84%）均購(gòu)自成都麥德生科技有限公司；RNA extraction kit（批號(hào)RN001）購(gòu)自上海奕杉生物科技有限公司；BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒、RIPA強(qiáng)裂解液、5×蛋白上樣緩沖液（批號(hào)分別為P0012、P0013B、P0015）均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；小鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β 單克隆抗體（批號(hào)分別為sc-52746、sc-57315、sc-12742）均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司；小鼠β-actin 單克隆抗體（批號(hào)66009-1-Ig）購(gòu)自武漢三鷹生物科技有限公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（H+L）多克隆二抗（批號(hào)bs-0296G-HRP）購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；胰酶（批號(hào)BL512A）購(gòu)自南京順捷生物科技有限公司；降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、P 物質(zhì)（substance P，SP）及環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（批號(hào)分別為ml003082、ml00303、ml003119、ml058808）均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠25只，3月齡，體重250～280 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2021-0011。大鼠飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（倫理批號(hào)A211207）。

2 方法與結(jié)果

2.1 篩選三色散凝膠貼膏原料藥的提取方式

2.1.1 藥物分組及制備

（1）傳統(tǒng)工藝組：按相關(guān)專利［9］所述方法制備凝膠貼膏。將乙二胺四乙酸、甘羥鋁、聚丙烯酸鈉加入甘油中，在反應(yīng)釜內(nèi)攪拌7 min，作為A 相；將聚丙烯酸酯、聚丙烯酸水溶液、薄荷腦、樟腦、防腐劑和150 g 三色散粉（過(guò)800 目篩）加入純水中，攪拌10 min，作為B 相；將酒石酸加入純水中，超聲使其充分溶解，作為C相；將共計(jì)1 000 g 的A、B、C 按約12∶23∶5 比例相混合，真空攪拌15 min，涂布在背襯層，蓋上防黏膜，即得15%載藥量的凝膠貼膏。

（2）水提組：將過(guò)800 目篩的三色散粉加水浸泡0.5 h后加入10倍純水加熱回流提取1 h，過(guò)濾后取濾渣按相同條件重復(fù)提取1次，過(guò)濾后合并2次濾液，減壓濃縮后按傳統(tǒng)工藝組方法制備15%載藥量的水提物凝膠貼膏。

（3）醇提組：將過(guò)800 目篩的三色散粉加水浸泡0.5 h 后加入10 倍75%乙醇加熱回流提取1 h，過(guò)濾后取濾渣按相同條件重復(fù)提取1次，過(guò)濾后合并2次濾液，減壓濃縮后按傳統(tǒng)工藝組方法制備15%載藥量的醇提物凝膠貼膏。

2.1.2 動(dòng)物KOA模型的建立、分組及給藥

取20 只大鼠，采用前交叉韌帶橫斷術(shù)建立KOA 模型[10]，使用3%戊巴比妥鈉溶液按2 mL/kg劑量將大鼠麻醉，脫毛備皮并消毒。切開(kāi)關(guān)節(jié)囊，打開(kāi)關(guān)節(jié)腔后將髕骨內(nèi)外側(cè)脫位，屈曲膝關(guān)節(jié)顯露前交叉韌帶，直視下用手術(shù)刀切斷，并行抽屜實(shí)驗(yàn)確定前交叉韌帶是否斷裂。止血、髕骨復(fù)位并縫合，連續(xù)3 d 肌注青霉素鈉以防感染。

造模成功后，將大鼠分為模型組、醇提組、傳統(tǒng)工藝組、水提組，每組5 只。另取5 只大鼠，不做任何處理作為空白組。除了空白組與模型組外，醇提組、傳統(tǒng)工藝組與水提組于大鼠造模成功后14 d，參照臨床組方按0.08 g/cm2劑量分別給藥[11]，每日1次，連續(xù)給藥28 d。

2.1.3 冷熱板致痛實(shí)驗(yàn)

給藥28 d 后，將5 組大鼠分別放于（55±0.5）℃與（0±3）℃冷熱板儀上，以舔后足作為痛反應(yīng)指標(biāo)，記錄其疼痛閾值。采用SPSS 26.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用Graphpad Prism v8.0.2.263軟件繪圖。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單向或雙向方差分析，組間比較采用Tukey檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

熱板法和冷板法的大鼠疼痛閾值變化見(jiàn)圖1。與空白組比較，模型組大鼠的冷痛閾值與熱痛閾值均顯著下降（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠的冷痛閾值和熱痛閾值（除傳統(tǒng)工藝組外）均顯著升高（P＜0.05），表明三色散凝膠貼膏提取工藝改進(jìn)后對(duì)KOA 大鼠冷、熱痛具有良好的緩解作用，可提高疼痛耐受能力；與傳統(tǒng)工藝組比較，醇提組與水提組的大鼠熱痛閾值均顯著升高（P＜0.05），表明醇提組與水提組提取物制備的凝膠貼膏對(duì)KOA大鼠熱痛的緩解作用較傳統(tǒng)工藝組凝膠貼膏有改善，而冷痛閾值無(wú)顯著差異。

圖1 各組大鼠冷、熱痛閾值的測(cè)定結(jié)果（n＝5）

2.1.4 大鼠取材

在冷熱板致痛實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，使用3%戊巴比妥鈉溶液按2 mL/kg 劑量麻醉大鼠并進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，于4 ℃下按3 000 r/min 離心15 min 后，取上層血清，于-80 ℃凍存?zhèn)溆?。消毒大鼠膝關(guān)節(jié)后兩側(cè)橫向下刀，打開(kāi)關(guān)節(jié)腔，取滑膜組織于凍存管，置于液氮中，于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.5 大鼠血清中疼痛介質(zhì)CGRP、COX-2、SP、PGE2含量的檢測(cè)

取“2.1.4”項(xiàng)下血清樣品，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作檢測(cè)CGRP、COX-2、SP、PGE2 的含量，于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD值。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法同“2.1.3”項(xiàng)下。

結(jié)果（圖2）顯示，與空白組比較，模型組大鼠血清中CGRP、COX-2、SP、PGE2含量均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中CGRP、COX-2、SP、PGE2 含量均顯著下降（P＜0.05）；與傳統(tǒng)工藝組比較，醇提組大鼠血清中PGE2、COX-2 含量均顯著下降（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠血清中疼痛介質(zhì)CGRP、COX-2、SP、PGE2含量的檢測(cè)結(jié)果（n＝5）

2.1.6 大鼠滑膜細(xì)胞增殖、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、血管入侵程度的檢測(cè)

取“2.1.4”項(xiàng)下滑膜組織，經(jīng)石蠟包埋、切片、常規(guī)HE染色后，在顯微鏡下進(jìn)行觀察和拍攝，對(duì)滑膜細(xì)胞增殖、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、血管入侵程度等情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。HE染色結(jié)果（圖3）顯示，空白組大鼠滑膜細(xì)胞排列整齊，幾乎無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；與空白組比較，模型組大鼠滑膜細(xì)胞排列紊亂，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加，滑膜纖維化加重，膠原沉積增加，可見(jiàn)較多毛細(xì)血管增生；與模型組比較，各給藥組大鼠滑膜組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，纖維化程度減輕，膠原沉積減少，可見(jiàn)少量毛細(xì)血管增生；與傳統(tǒng)工藝組比較，醇提組與水提組的大鼠滑膜細(xì)胞炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜纖維化及膠原沉積進(jìn)一步減輕；醇提組相較于水提組，大鼠滑膜細(xì)胞外表無(wú)斷裂痕跡，且血管增生與炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等較少。

圖3 各組大鼠滑膜組織的HE染色圖

2.1.7 大鼠滑膜組織中IL-1β、TNF-α、IL-6 蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

取適量滑膜組織勻漿后加入適量的RIPA 強(qiáng)裂解液，按照BCA 法測(cè)定蛋白濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液將蛋白煮沸變性，上樣電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜上；加入含5%脫脂奶粉的封閉液，搖床振蕩1 h，封閉結(jié)束后，洗膜3 次；將膜放入含IL-1β、TNF-α、IL-6、β-actin 一抗（稀釋比均為1∶500）的平皿中，4 ℃搖床振蕩孵育過(guò)夜后取出，室溫振蕩30 min，吸棄一抗，洗膜3次；用5%脫脂奶粉封閉液稀釋二抗（稀釋比為1∶5 000），室溫?fù)u床振蕩反應(yīng)2 h；二抗反應(yīng)結(jié)束后，回收二抗，洗膜3次。滴加適量ECL 工作液進(jìn)行顯色曝光。以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）的灰度值比值表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法同“2.1.3”項(xiàng)下。

結(jié)果（圖4）顯示，與空白組比較，模型組大鼠滑膜組織中IL-1β、TNF-α、IL-6 蛋白表達(dá)水平均顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠滑膜組織中IL-1β、TNF-α、IL-6 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）；與傳統(tǒng)工藝組比較，醇提組大鼠滑膜組織中IL-1β 與IL-6 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）；水提組大鼠滑膜組織中IL-1β、TNF-α、IL-6 蛋白表達(dá)水平與傳統(tǒng)工藝組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 各組大鼠滑膜組織中IL-1β、TNF-α、IL-6 蛋白表達(dá)情況

2.1.8 大鼠滑膜組織中IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA 表達(dá)水平的檢測(cè)

按照Trizol法提取滑膜組織總RNA，將符合標(biāo)準(zhǔn)濃度和純度的RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA 為模板，β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用2-ΔΔCt法以ABI 7500 v2.0.5 軟件計(jì)算各目標(biāo)基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，目標(biāo)基因及內(nèi)參基因序列見(jiàn)表1。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法同“2.1.3”項(xiàng)下。

表1 引物序列

結(jié)果（圖5）顯示，與空白組比較，模型組大鼠滑膜組織中IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA 表達(dá)水平均顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠滑膜組織中IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA 表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）；與傳統(tǒng)工藝組比較，醇提組大鼠滑膜組織中IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），水提組大鼠滑膜組織中IL-6 mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。

圖5 各組大鼠滑膜組織中IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)結(jié)果（±s，n＝5）

2.2 蔓荊子黃素、士的寧和馬錢(qián)子堿含量測(cè)定方法的建立

2.2.1 色譜條件

色譜柱為Kromasil-5-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），以0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫（0～15 min，90%A；15～25 min，90%A→55%A；25～40 min，55%A；40～50 min，55%A→10%A；50～60 min，10%A；60～61 min，10%A→90%A；61～75 min，90%A）；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為258 nm；進(jìn)樣體積為10 μL；柱溫為30 ℃。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱取士的寧對(duì)照品13.6 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容搖勻，得1.36 mg/mL 士的寧儲(chǔ)備液；精密稱取馬錢(qián)子堿對(duì)照品12.8 mg，置于20 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容搖勻，得0.64 mg/mL 馬錢(qián)子堿儲(chǔ)備液；精密稱取蔓荊子黃素對(duì)照品12.0 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容搖勻，得0.48 mg/mL蔓荊子黃素儲(chǔ)備液。分別精密量取蔓荊子黃素、士的寧、馬錢(qián)子堿儲(chǔ)備液各2.5 mL，置于50 mL 容量瓶中，加甲醇定容搖勻得混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇定容搖勻即得混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

取三色散凝膠貼膏，除去蓋襯，剪成0.5 cm×0.5 cm小塊，稱取12 g，置于圓底燒瓶中，加入氫氧化鈉溶液3 mL，靜置30 min，加入三氯甲烷50 mL，加熱回流4 h；過(guò)濾后將濾液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，使用三氯甲烷定容；精密吸取5 mL上述溶液，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加甲醇定容搖勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取濾液，即得。

2.2.4 空白溶劑的制備

量取5 mL三氯甲烷于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容，即得空白溶劑。

2.2.5 方法學(xué)考察

參照2020年版《中國(guó)藥典》（四部）通則分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則進(jìn)行方法學(xué)考察。取供試品溶液、混合對(duì)照品溶液和空白溶劑，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果顯示，空白溶劑對(duì)士的寧、馬錢(qián)子堿、蔓荊子黃素的檢測(cè)無(wú)干擾，供試品溶液（去蔓荊子）中其他成分對(duì)蔓荊子的檢測(cè)無(wú)干擾，供試品溶液（去馬錢(qián)子）中其他成分對(duì)士的寧、馬錢(qián)子堿的檢測(cè)無(wú)干擾（圖略）。分別精密吸取1、2、3、4、6 mL 混合對(duì)照品溶液于20 mL 容量瓶中并定容，搖勻后以0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，以各對(duì)照品的濃度（X）和峰面積（Y）進(jìn)行線性回歸，計(jì)算得到蔓荊子黃素的線性方程為Y＝61 712X-1 516.5（相關(guān)系數(shù)為0.996 6），士的寧的線性方程為Y＝227 306X-7 905.4（相關(guān)系數(shù)為0.998 4），馬錢(qián)子堿的線性方程為Y＝192 323X-2 230.4（相關(guān)系數(shù)為0.999 5），結(jié)果表明蔓荊子黃素在0.12～0.72 μg/mL范圍內(nèi)、士的寧在0.34～2.04 μg/mL 范圍內(nèi)、馬錢(qián)子堿在0.16～0.96 μg/mL 范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系。蔓荊子黃素、士的寧、馬錢(qián)子堿的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性（24 h）的RSD 均小于15%（n＝6）。蔓荊子黃素、士的寧、馬錢(qián)子堿平均加樣回收率分別為91.46%、96.28%、104.16%，RSD分別為6.1%、4.4%、3.8%（n＝6）。

2.3 三色散凝膠貼膏原料藥提取工藝的優(yōu)化

2.3.1 正交試驗(yàn)優(yōu)化篩選

依據(jù)前期單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定使用三色散細(xì)粉（300目）和55%乙醇進(jìn)行正交試驗(yàn)。選取加醇倍數(shù)（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）、空白（D）作為考察因素，以主要成分蔓荊子黃素（X）、馬錢(qián)子堿（Y）、士的寧（Z）的含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表2。以綜合評(píng)分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，綜合評(píng)分＝蔓荊子黃素+馬錢(qián)子堿+士的寧總分的歸一化處理值。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與正交試驗(yàn)直觀分析見(jiàn)表3，醇提工藝的影響因素為C＞B＞A，且A1＞A2＞A3，B3＞B1＞B2，C2＞C3＞C1。方差分析表見(jiàn)表4，結(jié)果顯示，A、B、C三個(gè)因素對(duì)結(jié)果并無(wú)顯著性影響，根據(jù)直觀分析表與方差分析表的綜合結(jié)果，最終選擇A1、B3、C2作為提取的最佳條件，即適量三色散細(xì)粉加8倍量55%乙醇，加熱回流提取90 min，提取2次。

表2 工藝優(yōu)化的正交試驗(yàn)水平因素表

表3 工藝優(yōu)化的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及正交試驗(yàn)直觀分析表

表4 工藝優(yōu)化的正交試驗(yàn)方差分析表

2.3.2 優(yōu)化工藝驗(yàn)證

按“2.3.1”項(xiàng)下最佳提取條件提取三色散并制備為三色散凝膠貼膏，重復(fù)3次，測(cè)定得到三色散凝膠貼膏中的蔓荊子黃素、士的寧和馬錢(qián)子堿含量平均值分別為0.007%、0.092%、0.214%，RSD均小于5%，表明優(yōu)化的三色散提取工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

本課題前期研究建立了三色散凝膠貼膏指紋圖譜，為三色散凝膠貼膏的制劑開(kāi)發(fā)提供了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［12］。楊楠等［8］使用三色散藥材顆粒制備凝膠貼膏，對(duì)三色散凝膠貼膏的輔料進(jìn)行最佳配比的篩選，得到最佳方案后，通過(guò)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)凝膠貼膏抗炎鎮(zhèn)痛的活性大于三色散傳統(tǒng)制法，證明了將三色散貼敷改進(jìn)為凝膠貼膏劑具有良好的可行性，凝膠貼膏可作為三色散的改進(jìn)劑型進(jìn)行后續(xù)研究。由于組方中所含藥材較多，對(duì)每個(gè)藥材的主要成分都進(jìn)行測(cè)定工作量過(guò)大且繁瑣，因此，本研究選擇君藥蔓荊子的主要成分蔓荊子黃素作為組方的標(biāo)志性成分，相關(guān)研究表明其有調(diào)節(jié)炎癥和氧化應(yīng)激的作用[13]，并能抑制活性氧介導(dǎo)的核因子κB信號(hào)通路減輕實(shí)驗(yàn)性骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的軟骨退變[14]；馬錢(qián)子是方中唯一的毒性藥物，主要成分士的寧與馬錢(qián)子堿在治療KOA上已有廣泛應(yīng)用[15―16]。上述成分含量同時(shí)也是凝膠貼膏后續(xù)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)需關(guān)注的部分。綜上，最終選擇此3 種成分作為本研究及制劑后續(xù)研究的考察指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)加熱回流提取的方式除去三色散藥材顆粒中的雜質(zhì)，對(duì)比水提組、醇提組與傳統(tǒng)工藝組大鼠的鎮(zhèn)痛行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與疼痛介質(zhì)CGRP、COX-2、SP、PGE2 含量結(jié)果，確定乙醇提取所制三色散凝膠貼膏的鎮(zhèn)痛效果最佳；對(duì)比水提組、醇提組與傳統(tǒng)工藝組大鼠的滑膜細(xì)胞增殖、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、血管入侵程度與滑膜組織中IL-1β、TNF-α、IL-6 蛋白與mRNA 表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果，確定乙醇提取所制三色散凝膠貼膏抗炎效果最佳，故選擇醇提為最佳提取方式。依據(jù)前期單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定使用三色散細(xì)粉（300 目）和55%乙醇進(jìn)行正交試驗(yàn)，對(duì)加醇倍數(shù)、提取時(shí)間和提取次數(shù)進(jìn)行考察。正交試驗(yàn)結(jié)果顯示，3 個(gè)自變量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果均無(wú)顯著性影響，推測(cè)主要是由于提取方式對(duì)成分含量的影響較大，而提取條件更多的是為后續(xù)質(zhì)控提供一個(gè)穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)。最后通過(guò)正交試驗(yàn)篩選得到三色散提取的最佳工藝為適量三色散細(xì)粉加8倍量55%乙醇，加熱回流提取90 min，提取2次。

綜上所述，本研究?jī)?yōu)化的三色散原料藥提取工藝穩(wěn)定、可行，解決了傳統(tǒng)工藝藥效差、原料藥儲(chǔ)存麻煩的缺陷，篩選得到較佳方案并以此制備凝膠貼膏，為后續(xù)制劑的穩(wěn)定性及安全性評(píng)價(jià)研究奠定了基礎(chǔ)。