張可煜

摘要 香蕉枯萎病對(duì)香蕉植株具有毀滅性危害，嚴(yán)重制約了世界各地香蕉種植業(yè)的發(fā)展?；诖耍⒘讼憬都?xì)菌性枯萎病菌可視化檢測(cè)體系，探究了檢測(cè)體系最佳引物組合、引物濃度、Cas12a濃度，以及可檢測(cè)到的最低樣本濃度。試驗(yàn)證明，該體系可以在60 min內(nèi)完成準(zhǔn)確的檢測(cè)，且所需儀器簡(jiǎn)便，對(duì)試驗(yàn)環(huán)境和操作人員沒有特殊的專業(yè)要求，該鑒定方法在植物病原菌的分子定性檢測(cè)中的潛力較大。

關(guān)鍵詞 香蕉枯萎病菌；分子鑒定；可視化

中圖分類號(hào)：S436.68 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：2095–3305（2023）09–0037-03

由尖胞鐮刀菌古巴?；停‵usarium

oxysporum f. sp. cubense，簡(jiǎn)稱Foc）引起的真菌性枯萎?。ㄓ址Q之為巴拿馬?。?huì)對(duì)香蕉造成巨大危害，被認(rèn)為是“香蕉癌癥”。作為一種維管束病害，香蕉枯萎病最直接的癥狀表現(xiàn)為葉片枯黃、維管束堵塞、腐爛發(fā)黑，維管束的堵塞會(huì)使得香蕉植株吸收不到營(yíng)養(yǎng)，最終導(dǎo)致整株枯死[1]。香蕉枯萎病菌的致病力極強(qiáng)，該病害嚴(yán)重制約了我國香蕉產(chǎn)業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展。作為全國香蕉的主產(chǎn)地，廣東省受香蕉枯萎病的危害極大[2-5]。

基于此，主要針對(duì)廣東省的香蕉枯萎病熱帶4號(hào)生理小種菌株構(gòu)建病菌檢測(cè)體系。

CRISPR/Cas核糖核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)，如Cas12a、Cas13a和Cas14能夠?qū)Σ≡瓨颖具M(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)。Cas12a 具有反式切割活性，可以通過crRNA引導(dǎo)識(shí)別目標(biāo)序列5＇端以Poly-T為前間區(qū)序列鄰近基序的特異片段（5＇-TTTN-3＇），對(duì)體系中的任意單鏈DNA探針進(jìn)行無差別切割，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的檢測(cè)。目前，有很多研究將Cas核糖核酸內(nèi)切酶與序列擴(kuò)增方法相結(jié)合，開發(fā)出SHERLOCK、HOLMES、DETE-CTOR、STOP、opv-CRISPR等高靈敏度和特異性的核酸檢測(cè)平臺(tái)，可用于致病病毒和微生物的檢測(cè)[6]。但是，目前開發(fā)的技術(shù)仍需要昂貴的淬滅熒光報(bào)告器和設(shè)備。

基于CRISPR的核酸檢測(cè)在病毒性疾病分子診斷中具有良好的前景，但其鮮有被用于植物病原菌的檢測(cè)。將LAMP技術(shù)和CRISPR/Cas12a偶聯(lián)，利用LAMP高特異性、靈敏度強(qiáng)、可在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增基因序列的特點(diǎn)，以及CRISPR/Cas12a精準(zhǔn)剪切、高靈敏度的特點(diǎn)構(gòu)建出一個(gè)新型的香蕉枯萎病鑒定系統(tǒng)，為香蕉枯萎病的前期防治提供簡(jiǎn)便、高效的工具。

1 試驗(yàn)方法

1.1 香蕉枯萎病菌株

廣東省采集的香蕉枯萎病菌株鑒定為熱帶4號(hào)生理小種，菌株命名為II5。非致病枯萎病菌株為Fo47。

1.2 試驗(yàn)引物設(shè)計(jì)

試驗(yàn)涉及的LAMP引物統(tǒng)一通過NEB? LAMP Primer Design Tool設(shè)計(jì)。合適的LAMP引物是有效擴(kuò)增的關(guān)鍵，GC比值在40%～60%為宜，引物對(duì)的Tm值相近（不超過5 ℃），擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度≤280 bp，二聚體ΔG≥-3.5，引物末端ΔG≤-4.0。設(shè)計(jì)好的引物通過枯萎病菌數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，確保其可擴(kuò)增片段的唯一性。

1.3 引物特異性分析

對(duì)設(shè)計(jì)好的LAMP和PCR引物序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，以評(píng)估引物的特異性。運(yùn)用BLASTN將設(shè)計(jì)的引物序列比對(duì)到參考菌株II5的基因組，由于是引物比對(duì)，設(shè)置的Evalue值為1，并加入?yún)?shù)-task blastn-short。再根據(jù)比對(duì)結(jié)果，查看引物是否適合進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.4 LAMP反應(yīng)體系

整個(gè)LAMP恒溫?cái)U(kuò)增體系體積為25 μL，其中，包括12.5 μL 1×LAMP混合液，2.5 μL Primer Mix （包括0.16 μ mol/LFIP和BIP，0.02 μ mol/L F3和B3，0.04 μ mol/L LF和LB，提前配置成1 μM的混合體系），1 μL 濃度為5 ng/μL的基因組DNA模板，9 μL無酶雙蒸水。整個(gè)反應(yīng)體系在恒溫金屬浴65 ℃條件下擴(kuò)增45 min。

1.5 CRISPR/Cas12a介導(dǎo)的剪切體系

CRISPR/Cas12a介導(dǎo)的剪切反應(yīng)體系體積共25 μL（2×），該混合體系包括美格生物Cas12a蛋白試劑盒（廣州美格生物科技有限公司，Code No： C001）10×Buffer 12.5 μL，以及終濃度為20 n mol/L的Cas12a蛋白，終濃度為40 n mol/L的crRNA，終濃度為40 n mol/L的單鏈DNA探針。該反應(yīng)在37 ℃的恒溫金屬浴中孵育15 min后，在藍(lán)光儀下進(jìn)行觀察和拍攝。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP引物和crRNA的篩選

經(jīng)檢索，F(xiàn)OIG_16668中共有3個(gè)Cas12a識(shí)別切割的PAM結(jié)構(gòu)域，以此設(shè)計(jì)3個(gè)不同區(qū)域的crRNA。以香蕉枯萎病4號(hào)生理小種菌株II5基因組DNA為模板，通過LAMP擴(kuò)增FOIG_16668序列，檢測(cè)3條crRNA，得到16668crRNA③具有較好的敏感度和特異性（圖1）。

利用LAMP擴(kuò)增，使用16668crRNA③介導(dǎo)Cas12a切割試驗(yàn)，比較FOIG_16668的結(jié)果（圖2）。其中，從左往右，①為II5陽性對(duì)照，②為Fo47陰性對(duì)照，③為空白對(duì)照。在FOIG_16668的6對(duì)引物中，a、b和c組出現(xiàn)了“假陽性”，e、f組經(jīng)過Cas12a的剪切后并未出現(xiàn)特異性熒光，可能是crRNA剪切受到了位置限制。因此，D組引物的結(jié)果最準(zhǔn)確、穩(wěn)定。最終確定FOIG_16668的D組引物+16668crRNA③組合。

2.2 最適Cas12a酶濃度摸索

為探究Cas12a的濃度是否是LAMP-CRISPR檢測(cè)的一個(gè)限制因素，對(duì)Cas12a進(jìn)行了濃度梯度試驗(yàn)。從熒光亮度檢測(cè)特異性來看，20～40 μ mol/L的Cas12a對(duì)檢測(cè)結(jié)果的特異性和靈敏度并無差別，而10 n mol/L的Cas12a的檢測(cè)亮度有所下降，但特異性與其他濃度無差別（圖3）。為了保證檢測(cè)結(jié)果的直觀和靈敏度，最終選擇20 n mol/L的Cas12a作為體系標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 最適LAMP引物濃度摸索

為探究LAMP擴(kuò)增體系中的引物濃度，將引物按梯度稀釋為1、0.1、0.01、0.001、0.000 1 μ mol/L。能擴(kuò)增的最低引物濃度為0.1 μ mol/L，因此試驗(yàn)的LAMP體系中的引物濃度標(biāo)準(zhǔn)為0.1 μ mol/L（圖4）。

2.4 LAMP-CRISPR/Cas12a體系的假陽性影響因素探究

2.4.1 引物的設(shè)計(jì)及選擇 LAMP引物的設(shè)計(jì)是影響其結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素。以FOIG_16668上的3組引物（A、C、D）為例，CRISPR和瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果表明，A組和C組引物會(huì)出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，而D組引物的特異性和準(zhǔn)確度最高（圖5）。在引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站上，A組引物的各條件參數(shù)最理想，但擴(kuò)增結(jié)果并不特異。因此，LAMP引物的特異性并不能單純依據(jù)參數(shù)判定，需要結(jié)合下游的檢測(cè)手段進(jìn)行檢驗(yàn)。

2.4.2 CRISPR/Cas12a反應(yīng)時(shí)間的影響 FOIG_16668的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Cas12a切割后（反應(yīng)條件為37 ℃，15 min），即使離開37 ℃恒溫域，隨時(shí)間推移仍會(huì)出現(xiàn)“假陽性”（圖6）。通過間隔性觀察發(fā)現(xiàn)，在CRISPR/Cas12a剪切反應(yīng)的20 h后，Cas12a會(huì)開始出現(xiàn)非crRNA介導(dǎo)的剪切，只要反應(yīng)體系中還存在ssDNA探針，就會(huì)被其切割并產(chǎn)生熒光。

3 討論

被稱作“香蕉癌癥”的香蕉枯萎病是香蕉產(chǎn)業(yè)的巨大威脅，且尖孢鐮刀菌古巴?；妥鳛橥羵髡婢哂泻軓?qiáng)的傳播力和危害性。從源頭控制該病菌的傳播是植物防疫的重點(diǎn)，植物病菌的預(yù)防檢疫對(duì)香蕉枯萎病的控制起到至關(guān)重要的作用。香蕉枯萎病熱帶4號(hào)生理小種的危害性最大，幾乎可侵染所有品種的香蕉，主要針對(duì)廣東省香蕉枯萎病4號(hào)生理小種構(gòu)建快速檢測(cè)體系。

前人關(guān)于香蕉枯萎病分子鑒定的研究有許多，如DNA指紋圖譜、常規(guī)PCR、多重PCR、real-time PCR、real-time LAMP等，但這些方法都需要專業(yè)的儀器操作和特定的試驗(yàn)環(huán)境[7-9]。目前，尚未有通過LAMP和CRISPR/Cas12a偶聯(lián)的方法檢測(cè)香蕉枯萎病菌的相關(guān)報(bào)道。

LAMP具備豐富的下游檢測(cè)方式，如SYBR Green I、HNB、Calcein等，但這些方法都存在一定的不足。例如：焦磷酸鎂濁度檢測(cè)的結(jié)果很難通過肉眼觀察得到，需通過實(shí)時(shí)濁度分析儀進(jìn)行；采用熒光染料（比色法）對(duì)LAMP擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行下游檢測(cè)的報(bào)道很多，且大多數(shù)研究是基于病原菌的檢測(cè)，如HNB羥基萘酚藍(lán)、SYBR Green I等。但是熒光染料受環(huán)境影響大、不靈敏、本底顏色深，會(huì)對(duì)結(jié)果的判定造成干擾。試驗(yàn)采用的CRISPR/Cas12a通過識(shí)別特異序列，利用自身反式切割活性對(duì)ssDNA探針進(jìn)行切割，結(jié)果更適合用于裸眼觀察，且通過crRNA靶向目標(biāo)特異片段具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確度，可以達(dá)到識(shí)別單堿基突變（SNP）的水平。

但是LAMP-CRISPR/Cas12a也存在不足，如其LAMP引物和crRNA的組合需要通過大量試驗(yàn)驗(yàn)證和篩選。LAMP的初始擴(kuò)增產(chǎn)物為雙莖環(huán)結(jié)構(gòu)，以此為基礎(chǔ)才能形成多個(gè)環(huán)狀鏈結(jié)構(gòu)的雙鏈擴(kuò)增子。其中，F(xiàn)2c-F1和B2-B1c區(qū)域?yàn)榄h(huán)狀雙鏈，F(xiàn)1c-B1區(qū)域?yàn)榫€性化雙鏈，雖然crRNA可以結(jié)合與線性化鏈相似的環(huán)狀雙鏈，但只有設(shè)計(jì)在F2c和B2位置之間的crRNA才可以實(shí)現(xiàn)更高的切割效率。因此，有相關(guān)研究表明，crRNA的結(jié)合位點(diǎn)決定了其Cas12a切割效率和準(zhǔn)確性，可以通過改變PAM的位置提高Cas12a的切割效率，從而降低出現(xiàn)假陽性的概率，增強(qiáng)準(zhǔn)確性。

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Establishment and Exploration of A Visual Detection System for Banana Bacterial Wilt Pathogen

Zhang Ke-yu （College of Horticulture， South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510642）

Abstract Banana wilt disease poses a devastating threat to banana plants， severely constraining the development of banana cultivation worldwide. Based on this， a visual detection system for banana bacterial wilt pathogen was established， exploring the optimal primer combination， primer concentration， Cas12a concentration， and the lowest detectable sample concentration of the detection system. The experiment has proven that the system can complete accurate detection within 60 minutes， and the required instruments are simple， without special professional requirements for the experimental environment and operators. This identification method has great potential in molecular qualitative detection of plant pathogens.

Key words Banana wilt pathogen; Molecular identification; Visualization