蘇 虹,黃永原,張鵬翼,韋業(yè)騰,徐照琳,楊雪捷,李嘉英,王晨璽

(廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西 南寧 530200)

前交叉韌帶(Anterior cruciate ligament,ACL)損傷是常見的膝關(guān)節(jié)損傷之一,臨床表現(xiàn)為疼痛、腫脹、膝關(guān)節(jié)活動(dòng)受限及不穩(wěn),常伴隨膝關(guān)節(jié)慢性疼痛,極大地降低患者的生活質(zhì)量[1-2]。外周敏化和中樞敏化是介導(dǎo)慢性疼痛的主要機(jī)制。ACL局部受損后釋放促炎因子,造成周圍神經(jīng)的炎性浸潤(rùn),增強(qiáng)傷害性感受器神經(jīng)對(duì)傳入信號(hào)的敏感性,表現(xiàn)為外周致敏[3]。持續(xù)性外周傷害性刺激可引起脊髓釋放興奮性神經(jīng)遞質(zhì),促使脊髓神經(jīng)根及突觸傷害性感受神經(jīng)元過度興奮,產(chǎn)生中樞敏化[4]。中樞敏化不僅繼發(fā)于外周敏化,也可增強(qiáng)外周敏化。突觸是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)定的基礎(chǔ),神經(jīng)功能穩(wěn)定依靠突觸功能及結(jié)構(gòu)可塑性維持。研究發(fā)現(xiàn),慢性疼痛模型大鼠的脊髓背角內(nèi)突觸活性區(qū)面積增大、突觸囊泡數(shù)量增多、突觸后致密物增厚等突觸結(jié)構(gòu)可塑性的改變,抑制性神經(jīng)遞質(zhì)減少或興奮性神經(jīng)遞質(zhì)增加,突觸可塑性變化可引起中樞痛敏[5-6]。以上提示,調(diào)節(jié)脊髓可塑性可能是改善ACL損傷慢性疼痛的關(guān)鍵機(jī)制。既往研究已證實(shí)電針可通過促進(jìn)軸突再生、調(diào)節(jié)脊髓突觸可塑性以及中樞神經(jīng)遞質(zhì)釋放,從而起到鎮(zhèn)痛作用[7-8]。電針被廣泛應(yīng)用于膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹及功能障礙的治療,但比較不同電針頻率療效的實(shí)驗(yàn)研究鮮有報(bào)道?；诖?本研究通過建立ACL損傷家兔模型,觀察不同頻率電針對(duì)ACL損傷家兔背根神經(jīng)節(jié)(DRG)中突觸可塑性相關(guān)蛋白突觸素(SYN)、突觸后致密蛋白95(PSD95),神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)及疼痛介質(zhì)前列腺素E2(PGE2)、P物質(zhì)(SP)的表達(dá),揭示電針干預(yù)ACL損傷的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:同批次、3月齡健康新西蘭兔24只,雄性,體重為(2.5±0.5)kg,由長(zhǎng)沙市天勤生物公司提供[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(湘)2019-0015]。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑:高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液(R0010,Solarbio);BCA法蛋白濃度測(cè)定試劑盒(PC0020,Solarbio);ECL化學(xué)發(fā)光底物(BL523A,Biosharp);PAGE膠促凝劑(T8090,Solarbio);磷酸化蛋白酶抑制劑(G2007-1ML,Servicebio);PVDF膜(G6015-0.45,Servicebio);HRP標(biāo)記山羊抗兔(GB23303,Servicebio);GAPDH一抗(BL006B,Biosharp);PSD95試劑盒(AF5283,Affinity);SYN試劑盒(AF0402,Affinity);GABA試劑盒(SP25998,武漢賽培生物科技有限公司);Glu試劑盒(SP26620,武漢賽培生物科技有限公司);SP酶聯(lián)免疫分析試劑盒(JYM0187Rb,基因美);PGE2酶聯(lián)免疫分析試劑盒(RB70049,Bioswamp)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器:酶標(biāo)分析儀(HBS-1096A,德鐵);低溫離心機(jī)(5418R,eppendorf);低溫離心機(jī)(5418R,eppendorf);多功能酶標(biāo)儀(INFINITE 200PRO,TECAN);水平搖床(TS-3D,其林貝爾);電泳儀(PowerPac Basic,Bio-Rad);凝膠成像系統(tǒng)(Tanon 5200,上海天能);高速低溫組織研磨儀(KZ-III-F,Servicebio)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 家兔ACL損傷模型制備:建立兔膝關(guān)節(jié)ACL損傷模型[9]。耳緣靜脈注射3%戊巴比妥(30 mg/kg)深度麻醉,將其固定于手術(shù)臺(tái)上,剃去膝關(guān)節(jié)區(qū)毛發(fā),消毒后鋪上無菌單。沿著左髕骨內(nèi)側(cè)做縱行手術(shù)切口,長(zhǎng)2～3 cm。切開皮膚后仔細(xì)分離筋膜、肌肉,充分暴露關(guān)節(jié)腔。在ACL實(shí)質(zhì)部將其完全橫斷并做2 mm 缺損,沖洗關(guān)節(jié)腔后逐層縫合,關(guān)閉切口,加壓包扎。手術(shù)后單籠飼養(yǎng),肌肉注射青霉素鈉(4萬U/kg)每日1次,連續(xù)1周。韌帶損傷模型由同一位外科醫(yī)生完成,以保證各組動(dòng)物造模的規(guī)范化和一致性。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與干預(yù):將24只家兔適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)取6只作為空白組,剩余18只造模成功后隨機(jī)分為模型組、低頻電針組和高頻電針組,每組6只。造模后1周開始治療?？瞻捉M、模型組:與其他組家兔同時(shí)抓取、固定,不進(jìn)行電針干預(yù)。低頻電針組:選取患側(cè)血海、梁丘穴,穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》家兔常用針灸穴位定位標(biāo)準(zhǔn)并以解剖學(xué)為依據(jù)。穴位皮膚以碘伏常規(guī)消毒后,選用華佗牌28號(hào)1寸一次性無菌針灸針直刺進(jìn)針,針刺深度為0.5～0.8 cm,在針柄處連接G-6805型電針治療儀,連續(xù)波,頻率為2 Hz,留針20 min。每日治療1次,連續(xù)治療21 d。高頻電針組:取穴及針刺深度同低頻電針組。針柄處連接G-6805型電針治療儀,連續(xù)波,頻率為100 Hz,留針20 min。每日治療1次,連續(xù)治療21 d。

1.2.3 取材:干預(yù)結(jié)束后,耳緣靜脈注射過量3%戊巴比妥處死全部家兔?？焖俦┞?并取出L2～S1背根神經(jīng)節(jié),用0.9%氯化鈉溶液洗滌后置入5 ml凍存管,放入-80 ℃冰箱中保存,用ELISA和Western blot法檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 一般情況:觀察每組家兔精神狀態(tài)、體毛及膝關(guān)節(jié)腫脹、活動(dòng)度、步態(tài)等情況變化。

1.3.2 機(jī)械刺激縮足閾值:分別于造模后第7、28天采用Von-Frey痛閾測(cè)量?jī)x測(cè)量家兔痛閾值。將家兔放進(jìn)底部為鋼絲網(wǎng)的籠子中,待其適應(yīng)10 min,完全平靜后進(jìn)行測(cè)量。使用Von-Frey痛閾測(cè)量?jī)x的纖維刺激針頭刺激家兔左側(cè)后肢足底中部,刺激強(qiáng)度逐漸增加,測(cè)量過程中密切觀察痛閾測(cè)量?jī)x的數(shù)值變化,直至家兔出現(xiàn)縮足反應(yīng)則記錄相對(duì)應(yīng)的讀數(shù)即為Von-Frey閾值。最大為180 g,若大于180 g則記為180 g。每次測(cè)量間隔約5 min,連續(xù)測(cè)量3次,取平均值。

1.3.3 ELISA法檢測(cè)L2～S1背根神經(jīng)節(jié)中PGE2、SP、Glu、GABA表達(dá):將L2～S1背根神經(jīng)節(jié)從-80 ℃冰箱中取出,置于室溫平衡30 min。根據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作,采用酶標(biāo)儀讀取450 nm處吸光度(OD)值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算PGE2、SP、Glu、GABA含量。

1.3.4 Western blot法檢測(cè)L2～S1背根神經(jīng)節(jié)中突觸可塑性相關(guān)蛋白SYN、PSD95表達(dá):稱取50 mg L2～S1背根神經(jīng)節(jié)組織剪碎,加入RIPA裂解液后混勻,4 ℃冰箱過夜裂解,離心后收取上清液測(cè)定蛋白濃度。制備SDS-PAGE凝膠,加入相應(yīng)體積的總蛋白樣品與4×蛋白質(zhì)上樣緩沖液,95 ℃變性10 min,電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜,室溫封閉2 h;用PBS稀釋一抗(稀釋比例為1∶1300),將封閉后的膜直接放入一抗工作液中,4 ℃反應(yīng)過夜。PBST洗膜3次,每次10 min。PBST稀釋二抗(稀釋比例1∶3000),將洗滌后的一抗反應(yīng)膜放入二抗工作液中,作用90 min,PBST洗膜3次,曝光及洗片,將膠片掃描后,用Image J軟件測(cè)定條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,符合方差齊性,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn);等級(jí)資料多組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn);以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組家兔干預(yù)前后一般情況及行為學(xué)比較 造模前,各組家兔健康狀況良好,進(jìn)食、飲水正常,毛色有光澤,步態(tài)正常,反應(yīng)靈敏,活動(dòng)度可。造模后1周,模型組、低頻電針組、高頻電針組家兔左側(cè)后肢輕度外翻,收縮減少,爬行時(shí)間增長(zhǎng)時(shí)可見右后足受力,伴有跛行、拖步,膝關(guān)節(jié)腫脹,活動(dòng)度較前明顯受限;空白組家兔無明顯活動(dòng)受限及步態(tài)異常。干預(yù)治療后,低頻電針組、高頻電針組家兔膝關(guān)節(jié)腫脹、活動(dòng)度、步態(tài)等明顯改善;模型組家兔膝關(guān)節(jié)附著肌肉萎縮伴僵硬,多蜷縮于籠子角落,爬行時(shí)右后足受力,跛行、拖步加重,活動(dòng)減少,精神欠佳;空白組家兔未見明顯異常。

2.2 各組家兔干預(yù)前后機(jī)械痛閾值比較 見表1。干預(yù)前,與空白組比較,模型組、低頻電針組、高頻電針組家兔機(jī)械痛閾值降低(均P<0.01);模型組、低頻電針組、高頻電針組家兔機(jī)械痛閾值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。干預(yù)后,模型組家兔機(jī)械痛閾值較前降低(P<0.01);與模型組比較,低頻電針組、高頻電針組家兔機(jī)械痛閾值顯著升高(均P<0.01);低頻電針組較高頻電針組機(jī)械痛閾值升高(P<0.01)。

表1 各組家兔干預(yù)前后機(jī)械痛閾值比較(g)

2.3 各組家兔背根神經(jīng)節(jié)中PGE2、SP表達(dá)比較 見表2。干預(yù)后,與空白組比較,模型組、高頻電針組、低頻電針組家兔背根神經(jīng)節(jié)中PGE2、SP的表達(dá)水平升高(均P<0.01);高頻電針組、低頻電針組家兔PGE2、SP表達(dá)低于模型組(均P<0.01),且低頻電針組低于高頻電針組(P<0.05)。

表2 各組家兔背根神經(jīng)節(jié)中PGE2、SP表達(dá)比較(pg/g)

2.4 各組家兔背根神經(jīng)節(jié)中Glu、GABA表達(dá)比較 見表3。干預(yù)后,與空白組比較,模型組、高頻電針組、低頻電針組家兔背根神經(jīng)節(jié)組織Glu的表達(dá)水平升高(均P<0.01),高頻電針組、低頻電針組Glu表達(dá)低于模型組(均P<0.01),且低頻電針組低于高頻電針組(P<0.01);與空白組比較,模型組、高頻電針組、低頻電針組家兔背根神經(jīng)節(jié)GABA的表達(dá)水平降低(均P<0.01),高頻電針組、低頻電針組GABA表達(dá)高于模型組(均P<0.01),且低頻電針組高于高頻電針組(P<0.05)。

表3 各組家兔背根神經(jīng)節(jié)中Glu、GABA表達(dá)比較(μmol/g)

2.5 各組家兔背根神經(jīng)節(jié)中PSD95、SYN表達(dá)比較 見表4(圖1)。干預(yù)后,與空白組比較,模型組、高頻電針組、低頻電針組家兔背根神經(jīng)節(jié)中PSD95、SYN的表達(dá)水平升高(均P<0.01),高頻電針組、低頻電針組家兔背根神經(jīng)節(jié)中PSD95、SYN表達(dá)低于模型組(均P<0.01),且低頻電針組低于高頻電針組(P<0.05)。

圖1 各組家兔背根神經(jīng)節(jié)中PSD95、SYN表達(dá)電泳圖

表4 各組家兔背根神經(jīng)節(jié)中PSD95、SYN表達(dá)比較

3 討 論

ACL損傷后免疫活化介導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),引起損傷局部痛覺感受器敏化,傷害性感受信號(hào)經(jīng)感覺神經(jīng)纖維傳導(dǎo)至脊髓背角,脊髓中樞將信號(hào)調(diào)質(zhì)和放大傳遞至丘腦和大腦皮層[10-12]。外周持續(xù)刺激導(dǎo)致脊髓背角神經(jīng)元突觸重塑,突觸閾下沖動(dòng)匯聚到傷害感受性神經(jīng)元,誘發(fā)或放大動(dòng)作電位,引起中樞敏化。ACL損傷在中醫(yī)屬“膝痹”范疇,主要病機(jī)為筋脈受損,氣血不暢。血海、梁丘位于膝關(guān)節(jié)周圍,具有通利關(guān)節(jié)之功,分屬脾、胃兩經(jīng),可補(bǔ)養(yǎng)氣血以濡養(yǎng)筋骨。多項(xiàng)臨床研究指出,電針可通過減輕炎癥浸潤(rùn),緩解疼痛和膝關(guān)節(jié)腫脹[13-14]。再者,電針可促進(jìn)受損神經(jīng)修復(fù)再生,調(diào)節(jié)神經(jīng)肌肉功能,改善膝關(guān)節(jié)活動(dòng)功能[15-16]。

隨著ACL損傷病程遷延,傷害性突觸信息持續(xù)傳遞,脊髓背角神經(jīng)元做出適應(yīng)性功能或結(jié)構(gòu)調(diào)整,導(dǎo)致疼痛長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng),誘發(fā)閾下疼痛,導(dǎo)致中樞敏化。SP、PGE2參與脊髓水平的痛覺信息轉(zhuǎn)導(dǎo)[17]。GABA和Glu作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的抑制性、興奮性神經(jīng)遞質(zhì),在痛覺環(huán)路中起到關(guān)鍵作用[18]。機(jī)體組織受損后,脊髓背角將痛覺信號(hào)傳遞至中樞,突觸前膜囊泡中的Glu釋放增多,GABA釋放減少,興奮突觸后神經(jīng)元,增強(qiáng)痛覺信息傳遞[19-20]。中樞敏化與脊髓可塑性密切相關(guān),突觸可塑性是脊髓可塑性的主要表現(xiàn)[21]。其中,中樞敏化、持續(xù)性外周刺激亦可引起脊髓突觸功能、結(jié)構(gòu)形態(tài)、數(shù)量及傳遞效能的變化[22-23]。調(diào)節(jié)突觸可塑性可促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育再生,參與神經(jīng)環(huán)路重建[24]。SYN、PSD95分別是突觸前膜和突觸后膜的可塑性蛋白,主要通過影響突觸的功能結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)分泌、維持突觸膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,進(jìn)而調(diào)節(jié)突觸可塑性[25]。既往研究發(fā)現(xiàn)電針可通過下調(diào)SYN、PSD95表達(dá),改善脊髓背角神經(jīng)元突觸超微結(jié)構(gòu),緩解神經(jīng)根型頸椎病大鼠脊髓節(jié)段中樞敏化,起到鎮(zhèn)痛作用[26]。此外,電針可改善疼痛模型大鼠脊髓背角的GABA能神經(jīng)元功能[27];針刺可升高膝骨性關(guān)節(jié)炎患者右側(cè)丘腦GABA水平,進(jìn)而起到鎮(zhèn)痛作用[28]。再者,有學(xué)者證實(shí)電針可抑制頸部切口痛大鼠脊髓頸段背側(cè)區(qū)mGluR5蛋白及mRNA表達(dá),升高GABA1R蛋白表達(dá),進(jìn)而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)[25]。

本研究發(fā)現(xiàn),ACL損傷后家兔機(jī)械痛閾值降低,背根神經(jīng)節(jié)中的SP、PGE2表達(dá)升高,興奮性神經(jīng)遞質(zhì)Glu表達(dá)升高,抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA表達(dá)降低,提示ACL損傷可引起背根神經(jīng)節(jié)中的致痛因子表達(dá)升高,痛覺信號(hào)傳遞至中樞,引起Glu釋放增多,GABA釋放減少,導(dǎo)致中樞敏化。為了進(jìn)一步觀察ACL受損后脊髓可塑性變化,對(duì)DRG中的突觸可塑性蛋白SYN、PSD95進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)模型組家兔的SYN、PSD95表達(dá)明顯下降。經(jīng)電針干預(yù)后,背根神經(jīng)節(jié)中的SP、PGE2降低,疼痛及行為學(xué)較前改善,此外,Glu表達(dá)較模型組減少,GABA表達(dá)較模型組升高,低頻電針組家兔均優(yōu)于高頻電針組。電針干預(yù)后,背根神經(jīng)節(jié)中的SYN、PSD95表達(dá)增多,提示電針可提高突觸蛋白數(shù)量,調(diào)節(jié)脊髓功能或結(jié)構(gòu)可塑性,說明電針可通過調(diào)節(jié)脊髓可塑性減輕中樞敏化。

在不同腦區(qū)或核團(tuán)間相互作用影響下,大腦中神經(jīng)元活動(dòng)的實(shí)時(shí)整合,參與維持了疼痛。島葉、扣帶回、前額皮質(zhì)、丘腦、脊髓等大腦結(jié)構(gòu)均參與了痛覺信息產(chǎn)生,我們可通過多模式核磁及腦電信息數(shù)據(jù)采集,觀察電針治療在ACL損傷患者腦網(wǎng)絡(luò)神經(jīng)應(yīng)答模式調(diào)節(jié)情況。疼痛與涉及情感和動(dòng)機(jī)的神經(jīng)結(jié)構(gòu)功能異常密切相關(guān),可以圍繞“大腦獎(jiǎng)賞環(huán)路及相關(guān)分子機(jī)制”,展開針刺改善疼痛共病負(fù)性情緒的實(shí)驗(yàn)研究。