張正花 龔榮府 方文

1貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院臨床檢驗中心（貴陽 550004）；2貴州醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗學院（貴陽 550004）

乳腺癌是威脅全球女性健康及生存最常見的惡性腫瘤［1］，發(fā)病率和病死率呈逐步上升的趨勢［2-3］。盡管在乳腺癌上使用免疫治療和化療治療等治療策略取得了很大進展，但許多乳腺癌患者的生存結(jié)局仍然很差［4-5］。因此，探索更多新的分子標志物來幫助設計更好的臨床治療方法至關(guān)重要。成纖維細胞生長因子2（FGF2）是一種促血管生成因子［6］，與多種惡性腫瘤的增殖，遷移侵襲及炎癥反應等密切相關(guān)［7-9］。但目前FGF2 調(diào)控乳腺癌細胞的生物學行為的機制還尚未明確。為此，本研究將通過CRISPR/cas9 技術(shù)敲除FGF2 基因在MCF-7細胞中的表達，觀察其對MCF-7 細胞的增殖、遷移侵襲及凋亡的影響，為尋找乳腺癌新的有效治療靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料人乳腺癌細胞MCF-7 購自賽柏康（上海）生物技術(shù)股份有限公司；FGF2 重組抗體購自abcam 公司；GAPDH、CDK2、cyclinA、Bax 及Bcl-2單克隆抗體購自Proteintech 公司；DH-5α 大腸桿菌感受態(tài)、膠回收試劑盒購自vazyme 公司；T4 DNA連接酶、嘌呤霉素（puromycin dihydrochloride）、Lipo8000?轉(zhuǎn)染試劑購自碧云天公司；病毒包裝質(zhì)粒pMD2.G、psPAX2、lenticrispv2 載體購自廣州艾基生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自中國天根公司；細胞周期檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；CCK-8 試劑購自大連美侖生物公司；sgRNA 引物合成及質(zhì)粒測序由北京擎科生物科技股份有限公司完成；細胞培養(yǎng)耗材購自NEST 公司、Gibco 公司和北京索萊寶科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 FGF2 基因敲除載體及穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的構(gòu)建FGF2-sgRNA 的設計：CRISPR 的引物通過http：// chopchop.cbu.uib.no/平臺設計。引物設計序列見表1。合成的sgRNA-Oligo 引物經(jīng)退火后與酶切質(zhì)粒載體lenticrispv2 連接。將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞DH-5α 中，送菌液至擎科測序公司進行測序驗證，將測序結(jié)果進行比對成功的質(zhì)粒菌液進行擴增，按照無內(nèi)毒素試劑提取試劑盒進行提取質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒CRISPR-cas9-NC 和CRISPR-cas9-FGF2 與包裝質(zhì)粒pMD2.G、psPAX2，在Lipo8000TM轉(zhuǎn)染試劑的作用下將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進293T細胞中收集病毒液進行濃縮，并用病毒液感染MCF-7 細胞，72 h 后加入嘌呤霉素（2 μg/mL）進行細胞篩選，利用Western blot 檢測篩選細胞蛋白驗證FGF2 基因敲除情況，將FGF2基因敲除組MCF-7細胞命名為FGF2-sgRNA1、FGF2-sgRNA2、FGF2-sgRNA3，對照組命名為CRISPR-cas9-NC。

表1 針對FGF2 基因設計的3 個sgRNA 靶序列Tab.1 Three sgRNA target sequences designed for FGF2 gene

1.2.2 Western blot 檢測FGF2 蛋白敲除效率水平及周期、凋亡相關(guān)蛋白取不同處理的細胞，用預冷的PBS 洗2 遍，根據(jù)RIPA 蛋白裂解液提取蛋白，將蛋白上樣電泳。待蛋白分開后，轉(zhuǎn)膜、封閉、敷一抗FGF2、CDK2、cyclinA、Bax、Bcl-2 抗體和GAPDH 抗體，4 ℃冷庫過夜，次日洗膜3 次，敷對應二抗，室溫1 h，洗膜3 次，隨后曝光顯影。

1.2.3 CCK-8 實驗將兩組細胞接種于96 孔板中，每孔100 μL/2 000 個細胞，每一組鋪3 個復孔，同時鋪板5 個時間段，分別在0、24、48、72、96 h 加入CCK-8 試劑反應3 h 測定OD值。

1.2.4 細胞劃痕實驗將不同處理的細胞鋪于六孔板，待細胞長滿后用直尺和無菌槍頭畫十字架，分別在0、24、48、72 h 定位拍照記錄細胞遷移愈合情況。

1.2.5 Transwell 實驗將細胞用無血清DMEM培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)1 d，以每孔3 × 105個細胞、鋪三個復孔計算，放37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h，用4%多聚甲醛固定20 min，用0.5%結(jié)晶紫染色20 min，拍照計數(shù)。檢測細胞侵襲能力需要先將基質(zhì)膠以1∶15 稀釋后吸100 μL 鋪于小室上室過夜凝固，細胞以每孔6 × 105鋪于小室內(nèi)，其他條件與上述條件一致。

1.2.6 細胞集落形成實驗將兩組細胞鋪于六孔板，以每組每孔5 × 102個細胞為宜，培養(yǎng)到15 d（中途每隔3天換一次液），用4%多聚甲醛固定20 min，用0.5%結(jié)晶紫染色20 min，洗掉待干燥后拍照留存，以每個集落＞ 50個細胞計數(shù)集落統(tǒng)計成圖。

1.2.7 MCF-7 細胞周期檢測按照試劑盒說明書收集細胞后固定染色，應用流式細胞儀檢測對照組與FGF2 基因敲除組細胞 G0/G1 期、S 期和G2/M期比例。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析應用SPSS 26.0 軟件和GraphPad prism 9.0.0 軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)兩組間統(tǒng)計學差異比較采用t檢驗，P＜ 0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 FGF2 基因敲除穩(wěn)轉(zhuǎn)質(zhì)粒的構(gòu)建質(zhì)粒載體lenticrispv2 酶切成功，見圖1A。sgRNA-Oligo 退火序列與質(zhì)粒載體酶切產(chǎn)物連接、轉(zhuǎn)化后，送菌液至擎科測序公司進行測序，比對測序數(shù)據(jù)，均顯示能與sgRNA引物匹配，見圖1B，表明sgRNA-1、sgRNA-2、sgRNA-3 引物均成功與質(zhì)粒載體連接。

圖1 FGF2 基因敲除的穩(wěn)轉(zhuǎn)質(zhì)粒Fig.1 FGF2 gene knockout plasmid

2.2 敲除FGF2 基因穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的構(gòu)建通過Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組（0.910 ± 0.076）相比，F(xiàn)GF2-sgRNA1 組（0.027 ± 0.008）的FGF2 敲除效果最明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.000 1，圖2），故選擇FGF2-sgRNA1 序列進行后續(xù)實驗，用CRISPR-cas9-FGF2 命名。

圖2 不同F(xiàn)GF2-sgRNA 質(zhì)粒敲除FGF2 基因的蛋白表達水平Fig.2 Protein expression levels of FGF2 gene knocked out bydifferent FGF2-SgrNA plasmids

2.3 FGF2基因敲除后抑制MCF-7細胞的增殖細胞集落形成實驗和CCK-8 實驗表明，與對照組相比，F(xiàn)GF2 基因敲除組的MCF-7 細胞增殖克隆數(shù)［（55.670 ± 5.130）vs. （26.000 ± 3.000）］及增值數(shù)量［（2.735 ± 0.376）vs. （2.218 ± 0.089）］顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.001，圖3A、3B）。結(jié)果說明，敲除FGF2基因顯著抑制了MCF-7 細胞的增殖。

圖3 敲除FGF2 基因顯著抑制MCF-7 細胞的增殖Fig.3 The proliferation of MCF-7 cells was significantly inhibited after FGF2 gene was knocked out

2.4 FGF2 基因敲除后抑制MCF-7 細胞的遷移和侵襲通過細胞劃痕實驗和Transwell 實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，F(xiàn)GF2 基因敲除組細胞的遷移愈合［（53.017 ± 2.996）vs. （39.757 ± 2.898）］和遷移［（109.667 ± 11.240）vs. （46.667 ± 3.512）］、侵襲［（103.330 ± 7.571）vs. （25.000 ± 5.000）］能力明顯減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01），見圖4A、4B。

圖4 敲除FGF2 基因后MCF-7 細胞的遷移和侵襲能力明顯降低Fig.4 The migration and invasion ability of MCF-7 cells were significantly reduced after FGF2 gene was knocked out

2.5 FGF2 基因敲除后可阻滯細胞周期根據(jù)細胞周期檢測結(jié)果顯示，與對照組（32.453 ± 1.137）相比，F(xiàn)GF2基因敲除組（40.613 ± 2.621）的S期細胞比例明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01，圖5A）。通過Western blot 檢測細胞S期相關(guān)周期蛋白顯示，CDK2 蛋白（0.719 ± 0.031）和cyclinA 蛋白（0.591 ±0.054）表達均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，圖5B）。結(jié)果說明敲除FGF2 基因后可將MCF-7 細胞阻滯在S 期。

圖5 敲除FGF2 基因后對MCF-7 細胞周期的影響Fig.5 Effect of FGF2 gene knockout on MCF-7 cell cycle

2.6 FGF2基因敲除后可促進MCF-7細胞的凋亡通過Western blot 檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2 顯示，F(xiàn)GF2 基因敲除組中Bax 表達（1.210 ± 0.068）高于對照組（0.591 ± 0.051），Bcl-2表達（0.479 ± 0.055）低于對照組（1.112 ± 0.116），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），Bcl-2/Bax的比值［（1.775 ± 0.141）vs. （0.417 ±0.023），P＜ 0.001］減低（P＜ 0.000 1），見圖6。結(jié)果提示敲除FGF2 基因促進了MCF-7 細胞的凋亡。

圖6 敲除FGF2 基因后對MCF-7 細胞凋亡的影響Fig.6 Effect of FGF2 gene knockout on apoptosis of MCF-7 cells

3 討論

乳腺癌的惡性發(fā)展涉及了復雜過程，主要包括表觀遺傳學變化、基因表達和信號通路［10-11］。尋找乳腺癌中異常表達的重要功能基因是研究癌癥發(fā)展機制的重要途徑。乳腺癌是一種血管依賴性腫瘤，血管生成是乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，并預測預后不良［12］。FGF2 是一種血管生成因子，與強血管化和高特異性相關(guān)，在乳腺癌癌前階段表達上調(diào)［13］。研究顯示，F(xiàn)GF2 受多種基因調(diào)控激活多條信號通路來影響實體腫瘤的增殖，遷移侵襲和轉(zhuǎn)移［14-16］。已有研究［17］表明FGF2 是癌癥對抗化療的潛在靶點。然而，F(xiàn)GF2 基因在乳腺癌細胞中的作用尚不清楚。

CRISPR/Cas9 技術(shù)可高效穩(wěn)定的敲除基因，被廣泛用于癌癥的研究［18］。本研究采用CRISPR-cas9技術(shù)成功敲除了MCF-7 細胞中的FGF2 基因，發(fā)現(xiàn)MCF-7 細胞的遷移、侵襲和增殖生長明顯減弱。細胞周期停滯是細胞生長抑制的重要原因，本研究也發(fā)現(xiàn)敲除FGF2 基因誘導MCF-7 細胞阻滯在S期。細胞周期主要是由cyclin 和CDK 協(xié)同調(diào)控，其中，cyclinA 能與CDK2 形成活性激酶復合物，促使細胞從S 期進入G2 期，使細胞增殖過度，最終引起癌變［19］。當細胞內(nèi)CDK2 和cyclinA 表達下調(diào)時，細胞S 期將受到阻滯，細胞增殖將被抑制［20］。在本研究中敲除FGF2 基因后觀察到CDK2 和cyclinA 的蛋白表達水平顯著下調(diào)，這與細胞周期中檢測到的阻滯在S 期結(jié)果相吻合。

有研究表明［21］，上調(diào)FGF2 可促進Bcl-2 的表達而抑制Bax 的表達來減輕人瘢痕疙瘩成纖維細胞的凋亡。細胞凋亡由Bcl-2 家族和半胱天冬酶家族調(diào)節(jié)［22］。Bcl-2 能阻止腫瘤細胞凋亡，與Bax有負調(diào)控關(guān)系［23］。Bax 和Bcl-2 是引起細胞凋亡的必需因子，可作為判斷細胞凋亡的重要依據(jù)［24-25］。本研究發(fā)現(xiàn)，敲除FGF2 基因后，與對照組相比，敲除組細胞中的Bcl-2 降低，Bax 升高。結(jié)果表明，敲除FGF2 基因后影響了Bcl-2 和Bax 的表達來促進乳腺癌細胞的凋亡。

綜上所述，本研究通過CRISPR/cas9 技術(shù)成功在MCF-7 細胞中敲除FGF2 基因。敲除FGF2 基因?qū)CF-7 細胞的增殖、遷移和侵襲均有顯著的抑制作用，并促進細胞凋亡，與乳腺癌的惡性進程密切相關(guān)。因此，F(xiàn)GF2 基因具有成為治療乳腺癌的重要生物標志物及治療靶標的潛力。但目前本研究只注重了體外實驗，還未進行體內(nèi)驗證及具體調(diào)控的分子機制，這些都是我們后續(xù)研究的重點。

【Author contributions】ZHANG Zhenghua performed the experiments and wrote the article. FANG Wen and GONG Rongfu designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.