郭艷華,王 玥,李信萍,周建芹,王劍文,鄭麗屏

(1.蘇州大學(xué) 藥學(xué)院,江蘇 蘇州 215123;2.蘇州大學(xué) 金螳螂建筑學(xué)院,江蘇 蘇州 215123)

染料廢水占我國每年總工業(yè)廢水排放量的三分之一,已成為目前危害最大且難以治理的主要水體污染源之一[1]。在厭氧環(huán)境下,多數(shù)染料可以轉(zhuǎn)化為有毒或致癌物質(zhì),不僅破壞生態(tài)平衡,而且嚴(yán)重威脅人類健康[2-3]。處理染料廢水的傳統(tǒng)方法主要包括絮凝、吸附、超濾、滲析、氧化和電化學(xué)等方法[4],但這些傳統(tǒng)技術(shù)不僅脫色效果差,而且所需成本高,還會產(chǎn)生有害副產(chǎn)物,造成二次污染[5]。

漆酶(laccase,EC 1.10.3.2)是一種含4個(gè)銅離子的多酚氧化酶[6],于1883年在紫膠漆樹Rhusvernicifera的分泌蛋白中首次發(fā)現(xiàn),后續(xù)在多種植物、昆蟲、細(xì)菌及真菌中均被發(fā)現(xiàn)[7]。因?yàn)檎婢崦缚梢源呋醴肿又械?個(gè)電子還原成水,氧化多酚、甲氧基酚、芳香族胺等多種有機(jī)底物,已被成功應(yīng)用于紙漿的漂白、染料脫色、污染物檢測及抗生素與農(nóng)藥的生物降解等領(lǐng)域。陳中維等[8]利用黃孢原毛平革菌Phanerochaetechrysosporium的漆酶粗酶液(100 U/L)對剛果紅(40 mg/L)進(jìn)行脫色,降解率為24.0%,在添加介體物質(zhì)藜蘆醇(veratryl alcohol)后,剛果紅的降解率顯著提高,5 h內(nèi)降解率可達(dá)87.7%[8]。侯紅漫等[9]用白腐菌Pleurotusostreatus324的粗漆酶在pH 4.0、40 ℃、酶活30 U/mL的條件下,12 h內(nèi)可使100 mg/L蒽醌染料SN4R的脫色率達(dá)到55%。活性藍(lán)19、酸性藍(lán)225經(jīng)毛栓菌Trameteshirsuta漆酶處理后,脫色率和脫毒率都可達(dá)80%左右[10]。真菌漆酶在工業(yè)染料廢水處理上具有巨大的應(yīng)用潛力。

竹黃菌Shiraiaspp.的基座或子實(shí)體——竹黃是我國的傳統(tǒng)中藥材,具有止咳化痰、活血化瘀的功效[11],其活性物質(zhì)包含竹紅菌素、痂囊菌素、多糖和11,11′-二去氧沃替西林等[12]。胡艷等[13]發(fā)現(xiàn),竹黃菌菌株Shiraiasp.SUPER-H168有產(chǎn)生漆酶的能力。目前,漆酶產(chǎn)生菌研究較多的是白腐真菌,培養(yǎng)7～21 d后,酶活約為200～6 500 U/L[14-17]。

本研究對前期分離得到的竹黃菌新菌株(Shiraiasp.S8)的產(chǎn)漆酶能力及漆酶活性進(jìn)行研究;同時(shí)考察竹黃粗漆酶對活性藍(lán)19、孔雀石綠和中性紅的降解效率,并進(jìn)一步分析添加小分子介體2,2′-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)及乙酰丁香酮(AS)對漆酶降解染料效率的影響;最后,克隆漆酶基因lcc1,并利用生物信息學(xué)方法對其氨基酸序列、高級結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育樹等方面進(jìn)行分析,為拓展竹黃菌的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種材料

竹黃菌Shiraiasp.S8,由本課題組于2012年自南京紫金山麓短穗竹Brachystachyumdensiflorum的莖稈中分離,現(xiàn)保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC),編號為CGMCC 3984。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):去皮馬鈴薯200 g,切成小塊,加水煮沸30 min,紗布過濾取汁,加葡萄糖20 g,瓊脂10 g,充分溶解后用蒸餾水定容至1 L,自然pH。

種子液培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯100 g,切成小塊,加水煮沸30 min,紗布過濾取汁,稱取可溶性淀粉20 g、NaNO34 g、KH2PO41.5 g、CaCO30.5 g、維生素B1(VB1) 0.01 g,充分溶解后用蒸餾水定容至1 L,自然pH。

漆酶高產(chǎn)培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,去皮切小塊,加水煮沸30 min,紗布過濾取汁,稱取可溶性淀粉20 g、酵母粉4 g、CuSO4·5H2O 0.15 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、KH2PO40.05 g,充分溶解后用蒸餾水定容至1 L,自然pH。

以上培養(yǎng)基于121 ℃高壓蒸汽滅菌25 min,冷卻至室溫備用。

1.2 試劑

2,6-二甲氧基苯酚(2,6-DMP)、乙酰丁香酮(AS),阿拉丁試劑(上海)有限公司;2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS),上海源葉生物科技有限公司;愈創(chuàng)木酚(guaiacol),薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司;活性藍(lán)19,上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司;中性紅,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;孔雀石綠,索萊寶生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液制備

從28 ℃活化保存于PDA斜面培養(yǎng)基的竹黃菌中取直徑10 mm的菌絲塊接種于PDA平板,28 ℃培養(yǎng)10 d至菌絲長滿整個(gè)平板。用10 mL無菌水洗下竹黃菌孢子。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后稀釋成2×107個(gè)/mL的孢子懸液,吸取稀釋后的孢子懸液200 μL接種于50 mL種子液培養(yǎng)基中(150 mL錐形瓶),于28 ℃、150 r/min培養(yǎng)2 d,以此為竹黃菌種子液,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 竹黃菌培養(yǎng)

固體平板培養(yǎng):為了觀察竹黃菌產(chǎn)漆酶的情況,將竹黃菌菌絲塊(10 mm)接種于添加了0.5 mol/L ABTS的PDA培養(yǎng)基中,于28 ℃恒溫培養(yǎng)10 d,觀察平板顯色情況并拍照。

液體發(fā)酵培養(yǎng):取1 mL竹黃菌種子液接種于漆酶高產(chǎn)培養(yǎng)基中(150 mL錐形瓶,裝液量50 mL),于28 ℃、150 r/min避光培養(yǎng)9 d。在竹黃菌培養(yǎng)的1～9 d期間每天取樣,用紗布過濾收集發(fā)酵液,于4 ℃、12 000 r/min離心30 min,收集上清液作為漆酶粗酶液用于漆酶酶活的測定及染料脫色研究。

1.3.3 漆酶酶活檢測

漆酶酶活采用ABTS法[18]來測定。為了研究溫度及pH對漆酶活性的影響,將粗酶液在不同溫度(0～100 ℃)下孵育5 min后測定其酶活,或在pH為2.0～7.0的檸檬酸緩沖液中配制成混合物后檢測酶活,并將最高酶活設(shè)定為100%。然后,將粗酶液在50～80 ℃下孵育不同時(shí)間(0～60 min)或?qū)⒋置敢罕４嬗趐H為2.0～7.0的檸檬酸緩沖液中一定時(shí)間(0～108 h),測定漆酶的殘余酶活以評價(jià)溫度或pH對漆酶穩(wěn)定性的影響,以未處理的酶液酶活為100%。

非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(native-PAGE):參照文獻(xiàn)[19]的方法對粗酶液進(jìn)行native-PAGE分析,使用5%濃縮膠及12%分離膠,電極緩沖液pH為8.3。用含有0.2 mmol/L ABTS、0.5 mmol/L愈創(chuàng)木酚或5 mmol/L 2,6-DMP的檸檬酸緩沖液(0.1 mol/L,pH 4.5)進(jìn)行活性染色30 min,觀察顯色情況并拍照。

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE):采用5%的濃縮膠與12%的分離膠對漆酶粗酶液進(jìn)行SDS-PAGE分析。電泳結(jié)束后,用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液進(jìn)行染色,然后脫色觀察電泳條帶。

1.3.4 漆酶脫色效果

在1.5 mL的脫色反應(yīng)體系中,含5.5 U酶量的粗酶液,33 mg/L活性藍(lán)19、孔雀石綠或中性紅,介體(終濃度為33.33 μmol/L的ABTS或266.66 μmol/L的AS)以及pH為4.0的檸檬酸緩沖液,在40 ℃下水浴脫色0～60 min。記錄不同時(shí)間不同染料的吸光值(測試波長:活性藍(lán)19為594 nm,孔雀石綠為617 nm,中性紅為533 nm),并拍照,按式(1)計(jì)算相應(yīng)的脫色率。

脫色率=(Ai-Af)/Ai×100%

(1)

式中:Ai為脫色前最大吸收波長處不同染料溶液的吸光值;Af為脫色后最大吸收波長處不同染料溶液的吸光值。

1.3.5 竹黃漆酶基因lcc1克隆

為得到漆酶基因lcc1的cDNA全長,從本課題組前期研究得到的竹黃菌轉(zhuǎn)錄組(PRJNA323638)中[20]篩選得到了1個(gè)漆酶基因lcc1的核酸序列,并利用在線軟件Expasy(https:∥web.expasy.org/translate/)分析其開放閱讀框。根據(jù)該核酸序列分別設(shè)計(jì)3′端特異性引物F1(C￣G￣G￣A￣A￣A￣T￣G￣G￣C￣G￣G￣A￣G￣GCAAATAC)和5′端特異性引物R1(G￣G￣T￣C￣T￣C￣A￣C￣T￣C￣G￣ACGGTCATC)并由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。按照植物總RNA提取試劑盒說明書(TIANGEN)提取竹黃菌總RNA,按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit說明書構(gòu)建含通用引物結(jié)合位點(diǎn)的竹黃菌cDNA文庫,分別利用PCR獲得lcc1的5′和3′端的cDNA片段。根據(jù)5′和3′端的cDNA片段設(shè)計(jì)巢式PCR引物F2/R2(F2:CTACTGGCTCCGTGTCCAAG;R2:T￣C￣C￣G￣T￣A￣G￣T￣C￣C￣G￣C￣A￣C￣C￣C￣C￣A￣G￣G￣C￣A),進(jìn)而獲得lcc1的中間片段。利用Bioedit軟件將lcc1的中間片段與兩端的cDNA片段進(jìn)行拼接,以得到完整的lcc1 cDNA序列。

1.3.6 Lcc1生物信息學(xué)分析

利用在線軟件Protparam(http:∥web.expasy.org/protparam)分析lcc1基本理化性質(zhì)。利用NovoPro(https:∥www.novopro.cn/tools/protein-hydrophilicity-plot.html)對Lcc1蛋白的疏水性進(jìn)行分析。利用NCBI數(shù)據(jù)庫的Conserved Domain search(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域分析。利用SignalP-5.0(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)對Lcc1信號肽進(jìn)行預(yù)測分析。利用TMHMM2.0(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)分析Lcc1的跨膜結(jié)構(gòu)。利用SOPMA(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)及Swiss-Model(http:∥swissmodel.expasy.org/interactive)構(gòu)建Lcc1二級結(jié)構(gòu)及三維結(jié)構(gòu)。利用MEGA-X軟件對Lcc1的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較,并利用鄰接法(http:∥www.phylogeny.fr)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)中,對照組和各處理組均設(shè)置了3次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)(每次重復(fù)至少設(shè)置3個(gè)平行樣本)。每組數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,并采用學(xué)生t檢驗(yàn)(Student′st-test)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。P<0.05代表差異顯著,即具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 竹黃漆酶的產(chǎn)生

ABTS、愈創(chuàng)木酚或2,6-DMP可以被漆酶分別氧化成綠色、紅棕色或黃色物質(zhì),是漆酶的特征反應(yīng)[21-23]。通過在固體培養(yǎng)基中加入0.5 mmol/L ABTS來檢測竹黃菌漆酶的產(chǎn)生,結(jié)果如圖1(a)所示。由圖1(a)可知:竹黃菌培養(yǎng)3 d后,培養(yǎng)基呈現(xiàn)綠色。由此初步推斷,竹黃菌S8能產(chǎn)生漆酶。

M—標(biāo)準(zhǔn)蛋白;1—商業(yè)漆酶;2—竹黃S8漆酶粗酶液

對竹黃菌液體發(fā)酵后的粗酶液進(jìn)行native-PAGE分析,經(jīng)0.2 mmol/L ABTS、0.5 mmol/L愈創(chuàng)木酚或0.5 mmol/L 2,6-DMP染色后,結(jié)果見圖1(b)。由圖1(b)可知:3條電泳條帶分別呈綠色、紅棕色及淡黃色,進(jìn)一步確定了S8菌株可以合成漆酶。

對S8漆酶粗酶液進(jìn)行SDS-PAGE,經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色后,結(jié)果見圖1(c)。由圖1(c)可知:S8漆酶的分子量約為6.6×104左右。

利用ABTS法檢測竹黃菌S8發(fā)酵液中漆酶的酶活,結(jié)果如圖1(d)所示。由圖1(d)可知:S8在液體培養(yǎng)條件下可合成漆酶并釋放至胞外,隨培養(yǎng)時(shí)間的延長,漆酶酶活也逐漸增加,在培養(yǎng)的第8天達(dá)到最大值(1 361 U/L)。與黑木耳(149 U/L,ABTS法)[24]、紅平菇(458.8 U/L,ABTS法)[25]、竹黃菌S.bambusicolaGZ-13×1(487 U/L,ABTS法)[26]等漆酶生產(chǎn)菌相比,S8菌株產(chǎn)酶優(yōu)勢明顯,具有成為漆酶生產(chǎn)菌的潛力。

2.2 竹黃漆酶的酶學(xué)性質(zhì)

通過將粗酶液孵育在不同的溫度、pH和時(shí)間條件下來研究竹黃漆酶的最適溫度、pH及其穩(wěn)定性,結(jié)果見圖2。

圖2 溫度及pH對竹黃漆菌S8酶活性及穩(wěn)定性的影響

由圖2(a)可知:竹黃菌S8漆酶的酶活隨溫度升高而上升,在60 ℃時(shí)酶活最高,再升高溫度,酶活開始下降,最終在80 ℃時(shí)保留78%的酶活。

由圖2(b)可知:漆酶在50 ℃保存60 min后,酶活下降約30%;隨著溫度升高漆酶熱穩(wěn)定性逐漸降低,在80 ℃下保溫2 min,酶活僅為1.7%,幾乎完全失活。

由圖2(c)可知:當(dāng)反應(yīng)緩沖液pH為2.0～7.0時(shí),漆酶的最適pH為4.0;當(dāng)pH<3.0或>6.0時(shí),酶活顯著下降;當(dāng)pH為3.0和6.0時(shí),漆酶酶活維持在50%左右。

由圖2(d)可知:當(dāng)pH為6.0和7.0時(shí),漆酶的穩(wěn)定性極好,放置36 h后殘余酶活仍處于較高水平,108 h后殘余酶活為50%左右;在pH為2.0的環(huán)境中放置12 h后,漆酶已趨于完全失活?？梢?竹黃漆酶的最適反應(yīng)溫度為60 ℃、最適反應(yīng)pH為4.0,在溫度50 ℃或pH為 6.0～7.0條件下,具有較好的穩(wěn)定性。一般來說,在溫度超過50 ℃[27]及酸性[28]條件下,漆酶不太穩(wěn)定,而Shiraiasp.S8所產(chǎn)的漆酶在pH>4及溫度≤50 ℃時(shí)相對穩(wěn)定。

2.3 漆酶對染料的脫色作用

為了考察竹黃菌S8漆酶對不同染料的脫色效果,首先以活性藍(lán)19、孔雀石綠和中性紅為作用底物,比較不同介體(ABTS、AS)對漆酶脫色的促進(jìn)作用,結(jié)果見圖3(a)。由圖3(a)可知:在不添加介體的條件下,漆酶對活性藍(lán)19及孔雀石綠的脫色率分別為13.92%和6.73%,而對中性紅沒有脫色效果;在AS的參與下,漆酶對活性藍(lán)19、孔雀石綠的脫色率分別提高了約3.5倍和12.8倍,對中性紅的脫色率可達(dá)81.75%;在ABTS參與下,漆酶可使活性藍(lán)19、孔雀石綠的脫色率分別提高約4.6倍和13.2倍,對中性紅的脫色率可達(dá)28.72%。由此可見,ABTS更適用于介導(dǎo)漆酶對活性藍(lán)19和孔雀石綠的脫色,AS則適用于中性紅。不同染料對介體有選擇性可能是由于染料氧化還原電位高于小分子介體形成的陽離子自由基,無法進(jìn)行正電荷的傳遞,或者染料的分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜,不易與漆酶結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,從而影響了漆酶的催化活性[29]。

圖3 竹黃漆酶對活性藍(lán)19、孔雀石綠和中性紅的脫色研究

進(jìn)一步測定添加合適介體后漆酶對3種染料脫色的效果,結(jié)果如圖3(b)所示。由圖3(b)可知:當(dāng)漆酶單獨(dú)作用時(shí),活性藍(lán)19和孔雀石綠的脫色率緩慢增加,但總體都低于20%,中性紅始終不脫色;添加介體后,漆酶對3種染料的脫色效率均在短時(shí)間內(nèi)快速增加,當(dāng)脫色60 min后,漆酶對活性藍(lán)19、孔雀石綠和中性紅的脫色率分別可達(dá)84.67%、88.52%和81.26%。

考察3種染料脫色過程中的顏色變化,結(jié)果見圖3(c)。由圖3(c)可知:添加合適的小分子介體可以大大提高漆酶對染料的脫色效率。栗君等[30]利用解淀粉芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensLC03的漆酶降解RB亮藍(lán)、靛紅、結(jié)晶紫,在ABTS存在的情況下,2 h后使其脫色率達(dá)到39.35%;酸性紅1則在Shiraiasp.SUPER-H168漆酶與介體1-羥基-苯并三氮唑(HOBT)的作用下脫色,140 min內(nèi)的脫色率為60%左右[31];在Shiraiasp.S8漆酶和介體的作用下,活性藍(lán)19、孔雀石綠及中性紅在60 min內(nèi)的脫色率在80%以上,可見竹黃漆酶/ABTS介體系統(tǒng)在工業(yè)染料廢水的處理上有較高的效率。

2.4 漆酶基因lcc1的克隆與序列分析

為得到竹黃菌漆酶基因,利用RACE技術(shù)以竹黃菌cDNA為模板分別克隆出長度為781 bp的3′端和952 bp的5′端cDNA片段。利用兩端序列設(shè)計(jì)巢式PCR引物F2與R2,擴(kuò)增出1 555 bp的中間片段,結(jié)果見表1。將3段基因序列測序并拼接后,即可得到lcc1的cDNA全長。通過SignalP-5.0和NCBI的Conserved Domain search對Lcc1進(jìn)行信號肽和蛋白結(jié)構(gòu)域的預(yù)測分析。通過在線軟件Protparam對lcc1的基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析,結(jié)果如圖4所示。由圖4可知:該基因開放閱讀框全長共1 785 bp,編碼一個(gè)由594個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì),等電點(diǎn)(pI)為6.05,分子量約為6.53×104,此結(jié)果與S8漆酶粗酶液SDS-PAGE分析顯示的漆酶分子量結(jié)果相近。Protparam結(jié)果顯示Lcc1蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為31.54(小于40故蛋白較為穩(wěn)定),脂溶指數(shù)為74.48,在主要氨基酸組成中,甘氨酸與蘇氨酸為優(yōu)勢氨基酸。

表1 lcc1 cDNA序列

雙下劃線表示銅離子結(jié)合位點(diǎn);▲代表保守的結(jié)構(gòu)域;陰影部分為典型信號肽序列

Lcc1蛋白信號肽共有18個(gè)氨基酸,該蛋白包含3個(gè)保守的銅離子結(jié)構(gòu)域T1(第75～199位)、T2(第210～370位)、T3(第414～549位)和4個(gè)可能參與Cu2+結(jié)合的組氨酸保守位點(diǎn)(HWH、HSH、HLHGH和HCH),與源自偏腫革裥菌Lenzitesgibbosa漆酶[32]和齒毛菌Cerrenasp.HYB07[33]等真菌的漆酶結(jié)構(gòu)特征相類似。

通過NovoPro和TMHMM2.0對Lcc1蛋白的疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果見圖5。由圖5可知:Lcc1為親水性蛋白,平均總親水性為-0.354;Lcc1為胞外蛋白,且不含跨膜區(qū)。

圖5 Lcc1蛋白的疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測

利用SOPMA、Swiss-Model構(gòu)建了Lcc1的二級結(jié)構(gòu)及三維結(jié)構(gòu),如圖6所示。由圖6可知:在漆酶基因lcc1編碼的蛋白Lcc1的二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲占比最高(56.90%),β-轉(zhuǎn)角占比最低(5.72%),與毛頭鬼傘Coprinuscomatus漆酶的二級結(jié)構(gòu)為主較為相似[34]。另外,Lcc1的二級結(jié)構(gòu)還包含了10.10%的α-螺旋與27.27%的伸展鏈。竹黃菌粗漆酶的酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果顯示,在超過50 ℃及酸性條件下漆酶均不太穩(wěn)定,這些酶學(xué)性質(zhì)可能與α-螺旋含量較低而無規(guī)則卷曲占比較高有關(guān)。劉琨[35]和胡婉峰[36]的結(jié)果均表明,α-螺旋結(jié)構(gòu)對維持酶活性至關(guān)重要。另外,漆酶的底物非特異性強(qiáng),具有降解多種底物的能力,這也與無規(guī)則卷曲所占比例較高相關(guān),因?yàn)闊o規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)提高了酶蛋白的柔韌性或可塑性,并且與底物有效結(jié)合過程的能量消耗更低[37]。如果進(jìn)行進(jìn)一步研究,則需要對竹黃漆酶進(jìn)行純化和結(jié)構(gòu)分析。總的來說,Lcc1呈球狀結(jié)構(gòu),并具有含Cu2+的催化活性中心及氧結(jié)合位點(diǎn),與杏鮑菇Pleurotuseryngtu的漆酶[38]結(jié)構(gòu)相似,符合典型的真菌漆酶結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

圖6 Lcc1蛋白的二級及三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

借助MEGA-X軟件,用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果見圖7。由圖7可知:竹黃菌S8的漆酶基因lcc1編碼的氨基酸序列與其他真菌漆酶序列有一定的同源性,其中與殼多孢屬真菌Stagonosporasp.的同源性最高(99%),與已報(bào)道的竹黃菌Shiraiasp.SUPER-H168的漆酶序列同源性較低(65%),而與來源于白腐真菌的漆酶同源性僅為43%?？梢?本研究獲得的竹黃漆酶基因是一種全新的基因。本研究為深入挖掘功能性漆酶基因資源提供了參考。

3 結(jié)論

竹黃菌Shiraiasp.S8能夠通過無性菌絲培養(yǎng)高效合成胞外漆酶,可作為新的漆酶生產(chǎn)候選菌。竹黃菌的粗漆酶在介體作用下可使活性藍(lán)19、孔雀石綠及中性紅在60 min內(nèi)的脫色率在80%以上,在染料廢水處理方面具有很大的應(yīng)用潛力。在后續(xù)工作中,可以通過優(yōu)化竹黃菌發(fā)酵條件、添加誘導(dǎo)子等方式進(jìn)一步增加胞外漆酶的產(chǎn)量;通過漆酶純化,進(jìn)一步解析漆酶結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系;通過構(gòu)建重組子實(shí)現(xiàn)竹黃漆酶基因的異源表達(dá)。同時(shí),進(jìn)一步研究其對工業(yè)染料的脫色工藝,為染料或印染廢水的高效治理提供新方案。