岳繼恒,儲夢萍,儲建林,3,何冰芳,3

(1.南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院,江蘇 南京 211800; 2.宜興市人民醫(yī)院,江蘇 宜興 214200;3.南京工業(yè)大學 藥學院,江蘇 南京 211800)

硫酸化修飾是生物體內(nèi)糖類和小分子等化合物的一種常見修飾方法,硫酸化寡糖在動物、植物、海洋生物以及人體的生長發(fā)育等方面發(fā)揮重要的作用[1-2]。以低分子肝素、肝素類似物、硫酸軟骨素和硫酸皮膚素等為代表的硫酸化寡糖不僅能夠與細胞表面和細胞外基質(zhì)(ECM)內(nèi)的相關因子(包括細胞表面受體、ECM蛋白、酶、生長因子(GFS)、細胞因子和形態(tài)因子等[3])相互作用,還可以與細胞核中的組蛋白和組蛋白修飾酶或轉(zhuǎn)錄因子等結(jié)合,在生物體中發(fā)揮不同的生物功能[4]。

為了研究硫酸化修飾寡糖類藥物在生物體內(nèi)的作用,往往需要高純度、高度硫酸化修飾的硫酸寡糖類產(chǎn)物為研究基礎。目前,硫酸寡糖的制備方法主要有3種:超低分子硫酸肝素可利用水解動物源大分子肝素[5]、全化學合成肝素寡糖[6]和生物工程合成肝素前體再進行硫酸化修飾[7]。硫酸化修飾生物工程合成肝素前體獲得的肝素寡糖產(chǎn)物具有混合物少、結(jié)構(gòu)較為明晰、硫酸化位點可控等優(yōu)點,且質(zhì)量較容易控制,已成為研究熱點[8-10]。然而,在肝素前體的酶法硫酸化修飾的過程中,需要用到大量硫酸基供體,3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸(PAPS)是該反應常用的硫酸基供體[11-13]。

PAPS為高能磷酸化合物,非常不穩(wěn)定[14],同時,市售PAPS的價格昂貴。因此,生物酶法合成PAPS一定程度可解決這種困境。目前,酶法制備PAPS主要有2種方式。第1種是使用芳基硫磺基轉(zhuǎn)移酶Ⅳ(AST Ⅳ),以對硝基苯酚硫酸鹽(PNPS)為硫酸基供體,將化合物3′,5′-二磷酸腺苷(PAP)轉(zhuǎn)化為PAPS[15-16]。由于硫酸基轉(zhuǎn)移反應會生成產(chǎn)物PAP,PAP又作為AST Ⅳ的反應底物,這種方式可以實現(xiàn)PAPS的循環(huán)再生[17-18]。第2種方法是以三磷酸腺苷(ATP)和無機硫酸鹽等為原料,在ATP硫酸化酶(ATPS)的催化作用下生成5′-腺苷磷酰硫酸(APS),進一步由APS激酶(APSK)催化APS與ATP發(fā)生磷酸化反應,生成PAPS[15,19]。

本研究以ATP和無機硫酸鹽為原料,建立多酶催化反應體系制備PAPS,對多酶催化反應涉及的ATPS和 APSK進行優(yōu)化表達。同時,在反應體系中加入銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)來源的無機焦磷酸化酶PPase,將多酶催化合成PAPS過程中的副產(chǎn)物焦磷酸(PPi)水解為磷酸(Pi),以利于PAPS的生成與累積,顯著提高反應體系中PAPS的產(chǎn)量水平。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株

大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)和E.coliDH5α、質(zhì)粒pET-28a(+)和pET-28a-sumo等保存于何冰芳教授實驗室。密碼子優(yōu)化后來源于乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)的ATPS基因和來源于產(chǎn)黃青霉菌(Penicilliumchrysogenum)的APSK基因由金唯智生物科技有限公司(蘇州)合成并克隆至pMD18-T載體。

1.1.2 主要試劑

胰蛋白胨和酵母粉,OXOID公司(英國);限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq酶等,TaKaRa Bio寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;小批量質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒,AXYGEN公司;ATP等其他化學試劑均為市售國產(chǎn)分析純試劑。

LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L;pH 7.0,121 ℃滅菌 20 min,加入過濾除菌的硫酸卡那霉素(Kana)使其終質(zhì)量濃度為50 mg/L。

固體培養(yǎng)基是在LB培養(yǎng)基中加入瓊脂20 g/L,相同滅菌條件。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組酶ATPS、APSK和PPase的表達載體構(gòu)建方法

乳酸克魯維酵母來源的ATPS基因(GenBank登錄號:CR382125.1),根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性,利用https:∥www.novopro.cn/tools/codon-optimization.html網(wǎng)站進行密碼子優(yōu)化,由金唯智生物科技有限公司(蘇州)進行全基因合成。以引物(F′-CCCGGATCCGCATGCCGAGCCCGCAT (BamH Ⅰ)、R′-GATCAAGCTTCTTCCAGTTCCTCGAG (HindⅢ))為模板進行PCR,產(chǎn)物和載體質(zhì)粒使用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和HindⅢ進行雙酶切,再用T4 DNA連接酶連接,將目的基因構(gòu)建到含有sumo標簽蛋白的pET-28a-sumo載體上。將重組質(zhì)粒導入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞得到重組菌株E.coliBL21(DE3)/pET-28a-sumo-ATPS。

根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性優(yōu)化產(chǎn)黃青霉菌來源的酶APSK的基因(GenBank登錄號:8313362),并由金唯智公司進行全基因合成獲得目的基因。以引物(F′-CGCGGATCCA￣T￣G￣T￣C￣T￣A￣C￣C￣A￣A￣C￣A￣T￣C￣A￣C￣C￣T￣T￣C￣C￣A (BamH I)和R′-CCCAAGCTTT￣T￣A￣C￣T￣C￣C￣T￣T￣C￣T￣T￣G￣G￣C￣A￣G￣G￣C￣A (HindⅢ))進行PCR,限制性內(nèi)切酶BamH I和HindⅢ進行酶切和T4 DNA連接酶連接,將目的基因構(gòu)建到pET-28a(+)載體上。將重組質(zhì)粒導入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞,得到重組菌株E.coliBL21(DE3)/pET-28a-APSK。

提取何冰芳教授實驗室保存的菌株銅綠假單胞菌的基因組DNA。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中銅綠假單胞菌來源的無機焦磷酸化酶PPase的氨基酸序列和基因序列,克隆獲得酶PPase的基因。以引物(F′-GCGGATCCCATATGGGTCTGGA (BamH Ⅰ)和R′-CCAAGCTTGGATCCTTATTTTTTGG (HindⅢ))進行PCR,以上述同樣方式構(gòu)建到pET-28a(+) 載體上。將重組質(zhì)粒導入E.coliBL21(DE3) 感受態(tài)細胞中,得到重組菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a-PPase。

1.2.2 重組酶ATPS、APSK和PPase的誘導表達條件優(yōu)化方法

將E.coliBL21(DE3)/pET-28a-sumo-ATPS、E.coliBL21(DE3)/pET-28a-APSK和E.coliBL21(DE3)/pET-28a-PPase在含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板上復蘇2次。分別將3個重組菌接種于含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,于37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)12 h。以體積分數(shù)2%的接種量轉(zhuǎn)接至含有培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,重組菌在相同條件下培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時加入誘導劑進行誘導表達。分別設置不同的誘導溫度、誘導劑種類和濃度以及誘導后培養(yǎng)時間來考察不同的培養(yǎng)條件對重組酶的表達影響。以誘導劑IPTG終濃度為0.1 mmol/L,分別考察不同誘導溫度(16、20、25和30 ℃)對重組酶的表達影響,培養(yǎng)條件為180 r/min和24 h。發(fā)酵液于8 000 r/min離心20 min獲得菌體,以Tris-HCl(pH 8.0)重新懸浮菌體,超聲破碎(超聲破碎細胞的功率50%,每次超聲3 s,間隙5 s;超聲總時間為20 min)獲得含重組酶的溶液;再于12 000 r/min的條件下離心20 min獲得含重組酶的上清液和沉淀部分。含重組酶的上清液和沉淀部分進行SDS-PAGE凝膠電泳分析,使用Image J軟件對蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳分析,采集圖像進行灰度掃描,計算目標酶的蛋白相對含量。在優(yōu)化后的誘導溫度下,分別加入不同種類誘導劑(IPTG、乳糖)和不同濃度的誘導劑IPTG(0.05～0.4 mmol/L),培養(yǎng)24 h,再分析獲得較優(yōu)的誘導劑種類和濃度。在最佳誘導溫度和誘導劑的條件下,重組菌分別在誘導后培養(yǎng)不同時間(2、3、6、8、10、12、24和36 h)取樣,計算目標酶的蛋白相對含量。

1.2.3 重組酶ATPS、APSK和PPase的純化與酶學性質(zhì)研究

收集菌體超聲破碎后的上清液,重組酶ATPS、APSK和PPase(C端帶有6×His標簽)分別使用Ni-NTA柱純化。重組酶純化時,先在中壓柱(φ1 cm×25 cm)中裝入5 mL填料,再以10倍柱體積量的buffer A(20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、0.5 mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑)平衡,加樣量為5 mL。在buffer A中加入體積分數(shù)20%的buffer B(20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0),0.5 mmol/L的NaCl、250 mmol/L的咪唑),先洗脫雜蛋白,再以體積分數(shù)100%的buffer B洗脫目的蛋白,收集洗脫液。純化后的酶蛋白經(jīng)透析、超濾后,置于含體積分數(shù)20%甘油的Tris-HCl(20 mmol/L,pH 8.0)緩沖溶液中保存。

分別考察pH、反應溫度和Mg2+濃度對重組酶ATPS和PPase的酶活影響。分別將2種酶置于不同pH的緩沖體系(pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0)中,測定相應的酶活。在pH 8.0的條件下,分別將2種酶置于不同的溫度(25、30、35、37、40、45、50和60 ℃),測定相應的酶活。在最適pH和溫度的條件下,在反應體系中加入不同終濃度的MgCl2(0.5、1、2、4、6、8和10 mmol/L),測定相應的酶活。

1.2.4 重組酶PPase的酶活測定方法

重組酶PPase的酶活測定使用鉬酸銨顯色法[14,20],重組酶PPase可以與PPi反應,生成磷酸(Pi),具體反應見式(1)。

(1)

Pi可以與鉬酸銨反應生成能穩(wěn)定顯色的磷鉬藍,符合朗伯-比爾定律。在酸性條件下,正磷酸鹽與鉬酸銨反應生成黃色的磷鉬雜多酸,具體反應見式(2)。

(2)

在室溫條件下,磷鉬雜多酸可以立即被檸檬酸或者氯化亞錫還原,轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的藍色絡合物——磷鉬藍(H3PO4·10MoO3·Mo2O5或H3PO4·8MoO3·2Mo2O5),以此顯色反應測定重組酶PPase的酶活。

重組酶PPase酶活測定的反應體系(總體積500 μL):Tris-HCl(100 mmol/L,pH 8)、MgCl2(2 mmol/L)和PPi (2 mmol/L);加入重組酶PPase溶液 10 μL。置于35 ℃反應10 min后,加入AAM溶液(2.5 mmol/L的(NH4)6Mo7O24·4H2O,0.1 mol/L的H2SO4,50%丙酮)4 mL,混合均勻后再加入0.5 mL檸檬酸溶液(1.0 mol/L),再次混勻并靜置30 s后測定405 nm處的吸光度。配制H3PO4濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0和2.5 mmol/L的磷酸鹽溶液,依次加入AAM溶液和檸檬酸溶液。測定吸光度,制作標準曲線(擬合曲線:y=0.440 8x+0.017 9,R2=0.999 2),計算Pi的濃度。酶活定義1 U為在上述條件下每分鐘催化PPi生成1 μmol的Pi所需要的酶量。

1.2.5 重組酶ATPS的酶活測定方法

通過PPi的生成量來測定重組酶ATPS的酶活,以酶PPase催化產(chǎn)生Pi的量來計算PPi的生成量[14]。配制反應體系總體積為1 mL的溶液:Tris-HCl (100 mmol/L,pH 8.0)、MgCl2(6 mmol/L)、Na2MoO4·2H2O (5 mmol/L)和ATP (2 mmol/L),加入重組酶ATPS溶液10 μL;置于37 ℃水浴中反應15 min后,沸水浴10 min終止反應。冷卻至室溫并稀釋2倍,再向終止的反應液中加入1 U 的PPase酶溶液,置于37 ℃水浴反應10 min。取500 μL反應液,測定405 nm處的吸光度并根據(jù)標準曲線計算Pi的濃度。酶活定義(1 U)為在上述反應條件下每分鐘催化ATP生成1 μmoL的PPi所需要的酶量。

1.2.6 多酶催化合成PAPS的反應條件優(yōu)化方法

多酶催化合成PAPS的反應體系(1 mL):Tris-HCl (0.1 mol/L)、LiCl (0.05 mol/L)、Na2SO4(0.1 mol/L)、MgCl2(4 mmol/L)、ATP (20 mmol/L),加入重組酶ATPS (10 U)、PPase (10 U)和APSK (10 μL,蛋白質(zhì)量濃度19.60 mg/mL)。35 ℃條件下反應一定時間后,沸水浴10 min終止反應,再以12 000 r/min離心10 min,并稀釋和過濾后測定PAPS產(chǎn)物。單因素實驗優(yōu)化:考察不同的底物濃度(5～35 mmol/L)、溫度(25～50 ℃)、pH(4～10)、反應時間(10～105 min)等條件對多酶催化反應合成PAPS產(chǎn)率的影響,并研究批次補料方式對多酶催化反應過程中產(chǎn)物PAPS累積的影響。

1.2.7 產(chǎn)物PAPS的檢測與分析方法

采用高效液相色譜法對產(chǎn)物PAPS進行分析[3]。使用C18色譜柱(Agilent,ZORBAX SB-Aq 4.6 mm×250 mm,5 μm,填料粒徑12 nm),流動相為體積分數(shù)5%甲醇/甲酸銨溶液(50 mmol/L,甲酸調(diào)節(jié)pH至4.5),流速為1.0 mL/min,進樣量為10 μL,檢測波長為UV 254 nm。進一步利用液質(zhì)聯(lián)用色譜儀(LC-MS)對產(chǎn)物進行分析,負離子模式,掃描范圍為100～3 000m/z。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶ATPS、APSK和PPase的重組質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果

分別構(gòu)建了酶APSK、ATPS和PPase的表達載體,將重組質(zhì)粒分別導入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞,菌落PCR和基因測序驗證了結(jié)果(圖1);成功獲得了重組菌株E.coliBL21(DE3)/pET-28a-sumo-ATPS、E.coliBL21(DE3)/pET-28a-APSK和E.coliBL21(DE3)/pET-28a-PPase。

圖1 APSK、ATPS和PPase 3種酶基因片段的凝膠電泳驗證

圖1為3種酶基因片段的電泳檢測結(jié)果。圖1(a)中的條帶1為APSK,條帶2為ATPS,圖1(b)為PPase的擴增條帶。3組條帶分別在1 509、647和537 bp處有對應條帶,與預期結(jié)果相符。同時基因測序的結(jié)果與目的基因相同,證明重組表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 重組酶ATPS、APSK和PPase的誘導表達條件優(yōu)化

重組菌株在搖瓶中培養(yǎng)后,可實現(xiàn)3個酶(ATPS、APSK和PPase)在大腸桿菌中的表達。圖2顯示了重組菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a-sumo-ATPS誘導表達酶ATPS的優(yōu)化結(jié)果。由圖2可知:大腸桿菌表達sumo標簽融合的酶ATPS的最佳誘導溫度為25 ℃,最適的誘導劑IPTG的終濃度為0.3 mmol/L。在搖瓶培養(yǎng)溫度為25 ℃和培養(yǎng)基中添加0.3 mmol/L 的IPTG條件下連續(xù)培養(yǎng)36 h,考察不同的誘導后培養(yǎng)時間對重組酶ATPS的表達影響。誘導后培養(yǎng)12 h內(nèi),重組酶ATPS的累積明顯;隨后,重組蛋白的含量增加緩慢。在誘導后培養(yǎng)24 h時,重組酶ATPS的蛋白含量水平達到最大值。

圖2 溫度、誘導劑和誘導時間對酶ATPS的表達影響

圖3顯示了重組菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a-APSK表達酶APSK的優(yōu)化結(jié)果。由圖3可知:在培養(yǎng)溫度為16、20和25 ℃的條件下,重組酶APSK的可溶性部分相對較高,表達的可溶性蛋白含量的差異較小;當培養(yǎng)溫度為30 ℃時,可溶性蛋白含量顯著降低。因此,選擇25 ℃為大腸桿菌表達重組酶APSK的最佳誘導溫度。

圖3 溫度、誘導劑和誘導時間對酶APSK的表達影響

添加誘導劑IPTG的終濃度為0.1 mmol/L時,表達的重組酶APSK的蛋白量最高。當誘導劑IPTG的終濃度大于0.1 mmol/L時,酶蛋白的表達量略有降低,且可溶性蛋白的比例也明顯降低。因此,選擇IPTG終濃度為0.1 mmol/L為最佳的誘導劑濃度。

在培養(yǎng)溫度為25 ℃和誘導劑IPTG的終濃度為0.1 mmol/L的條件下,培養(yǎng)24 h,重組酶APSK的表達量最高。

圖4為重組菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a-PPase表達酶PPase的優(yōu)化結(jié)果。由圖4可知:當誘導溫度為20 ℃時,酶PPase的表達水平較高,實現(xiàn)了重組酶PPase在大腸桿菌中的高效可溶性表達;當在培養(yǎng)基中添加不同種類的誘導劑(乳糖、IPTG)時,以誘導劑IPTG對重組酶PPase的表達效果最佳;加入阿拉伯糖反而會降低PPase的表達量。因此,培養(yǎng)基中添加0.1 mmol/L的IPTG為最佳的誘導劑濃度。在培養(yǎng)溫度為25 ℃和誘導劑IPTG的終濃度為0.1 mmol/L的條件下,誘導后培養(yǎng)12 h,重組酶PPase的表達水平最高。

圖4 溫度、誘導劑和誘導時間對酶PPase的表達影響

2.3 酶ATPS、APSK和PPase的純化結(jié)果

圖5為ATPS、APSK和PPase的表達及純化結(jié)果。由圖5可知:使用帶sumo標簽的質(zhì)粒pET-28a-sumo構(gòu)建了酶ATPS的表達載體,融合表達策略顯著提高了重組酶ATPS的異源表達水平,并且表達的可溶性蛋白占總蛋白的相對含量較高。在大腸桿菌中,表達的重組酶APSK大部分為可溶性蛋白,僅有少量的包涵體。在大腸桿菌中,也實現(xiàn)了重組酶PPase的高效可溶性表達。重組酶APSK、ATPS和PPase的可溶性表達水平較高,3種酶的異源表達效果較好。

圖5 重組酶APSK、ATPS和PPase的表達和純化的SDS-PAGE電泳分析

同時發(fā)現(xiàn),純化后的酶APSK、ATPS和PPase條帶較為單一,純度較高。進一步以BCA試劑盒測定了純化后的酶ATPS、APSK和PPase的蛋白質(zhì)量濃度,分別是9.47、19.60和16.33 mg/mL。使用鉬酸銨法測定了純化后的酶PPase和ATPS的酶活,計算得到酶PPase和ATPS的比酶活分別是518.72和 12.75 U/mg。同樣地,測定了搖瓶中發(fā)酵產(chǎn)酶PPase和ATPS的酶活,酶PPase和ATPS的酶活分別是124 492.70 和 1 811.78 U/L。搖瓶發(fā)酵液中目標重組酶的蛋白水平為酶PPase 1.225 g/L、酶ATPS 0.752 g/L和酶APSK 1.470 g/L。

2.4 重組酶PPase和ATPS的酶學性質(zhì)研究

2.4.1 溫度、pH和Mg2+濃度對重組酶PPase酶活的影響

考察不同的溫度、pH和Mg2+濃度對銅綠假單胞菌來源的酶PPase酶活的影響,結(jié)果見圖6。由圖6可知:當緩沖液pH為8.0時,酶PPase的酶活最高;當pH為3.0～7.0和pH>8.0時,酶活有所降低。當溫度為25～40 ℃時,酶PPase具有相對較高的酶活。當溫度為35 ℃時,酶PPase的酶活最高。因此,重組酶PPase的最適溫度為35 ℃,最適pH為8.0。當溶液中的Mg2+濃度為1～4 mmol/L時,酶PPase具有相對較高的酶活(相對酶活>70%)。添加2 mmol/L Mg2+時,酶PPase的酶活最高。

圖6 溫度、pH和Mg2+濃度對重組酶PPase的酶活影響

2.4.2 溫度、pH和Mg2+濃度對重組酶ATPS的影響

考察不同的溫度、pH和Mg2+濃度對重組酶ATPS酶活的影響,結(jié)果見圖7。由圖7可知:當pH為8.0時,sumo標簽融合表達的酶ATPS的酶活最大;當pH<8.0 和pH>8.0時,重組酶ATPS的酶活降低明顯。當溫度為30～45 ℃時,融合表達的酶ATPS具有較高的酶活;當溫度為35 ℃時,融合表達的酶ATPS的酶活力最大。當Mg2+濃度為2～8 mmol/L時,融合表達的酶ATPS具有相對較高的酶活性(相對酶活>80%)。因此,融合表達的酶ATPS的最適溫度為35 ℃,最適pH為8.0。Mg2+濃度為4 mmol/L時,融合表達的酶ATPS大約具有90%的相對酶活; Mg2+濃度為6 mmol/L,融合表達的酶ATPS酶活最高。

圖7 溫度、pH和Mg2+濃度對重組酶ATPS的酶活影響

2.5 多酶催化反應合成PAPS的條件優(yōu)化

2.5.1 多酶催化反應合成PAPS產(chǎn)物的HPLC和質(zhì)譜結(jié)果

以大腸桿菌表達的重組酶APSK、PPase和sumo標簽融合表達的酶ATPS建立多酶催化反應體系,對反應后的樣品進行HPLC檢測,分析是否有PAPS產(chǎn)物的生成,結(jié)果如圖8(a)所示。圖8(a)HPLC分析表明,在1.34 min左右出現(xiàn)一個新的尖峰,通過與文獻[14]比較底物ATP的保留時間,推測可能是PAPS的產(chǎn)物峰。進一步以LC-MS檢測和驗證,結(jié)果如圖8(b)所示。圖8(b)質(zhì)譜分析顯示:在m/z=505.115 8[M-H]-處出現(xiàn)離子峰,與計算得到的PAPS的分子量506.0相一致[3],可以說明該產(chǎn)物為PAPS。

圖8 產(chǎn)物PAPS的HPLC和質(zhì)譜分析圖

2.5.2 多酶催化反應合成PAPS的條件優(yōu)化結(jié)果

以ATP(初始濃度20 mmol/L)、Na2SO4為底物,重組酶APSK和融合酶ATPS能催化合成PAPS。在反應體系中額外加入酶PPase,可以使得酶法合成PAPS過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物PPi水解為Pi,從而有利于驅(qū)動反應向合成PAPS進行[19]。酶法合成的PAPS的反應條件優(yōu)化結(jié)果如圖9所示。由圖9(a)可知:與不加酶PPase組相比,在重組酶APSK和ATPS催化合成PAPS的反應體系中加入酶PPase,PAPS的累積量從4.79 mmol/L增加到6.85 mmol/L,明顯提升了PAPS產(chǎn)物的濃度水平。因此,在酶APSK和ATPS催化合成PAPS的反應體系中加入銅綠假單胞菌來源的無機焦磷酸水解酶PPase可以對產(chǎn)物PAPS的累積起到明顯的促進作用。

圖9 酶法合成的PAPS的反應條件優(yōu)化結(jié)果

不同pH對多酶催化反應的轉(zhuǎn)化率影響顯著。當pH為8.0時,多酶催化反應的轉(zhuǎn)化率最高。反應溫度從25 ℃升高到35 ℃,多酶催化反應的轉(zhuǎn)化率逐漸升高;在35 ℃時,達到最大。隨著溫度的升高(>35 ℃),轉(zhuǎn)化效率迅速降低,并不利于PAPS的合成。酶學性質(zhì)研究也表明,在溫度為35 ℃時,融合酶ATPS和酶PPase具有相對最高的酶活性。另外,融合酶ATPS和酶PPase最適的pH均為8.0。在多酶催化反應體系中,不同的酶具有相同或相近最適pH和最適溫度能增強多酶催化反應的協(xié)調(diào)性,可能更加有利于多酶催化反應合成PAPS產(chǎn)物。因此,優(yōu)化后的多酶催化反應條件為反應溫度35 ℃和pH 8.0。

當?shù)孜顰TP的濃度為20 mmol/L時,轉(zhuǎn)化率最高。當ATP濃度升高為25～35 mmol/L,轉(zhuǎn)化率明顯降低,這可能是過高濃度的底物ATP抑制了酶的活性,導致多酶催化反應的轉(zhuǎn)化率下降[19]。

2.5.3 多酶催化合成PAPS的反應進程曲線

在ATP初始濃度為20 mmol/L、pH 8.0和反應溫度為35 ℃的條件下,酶法合成PAPS的反應進程曲線如圖10所示。

圖10 酶法合成PAPS的反應進程曲線

由圖10可知:酶APSK、融合酶ATPS和酶PPase構(gòu)成的多酶催化反應體系中生成的產(chǎn)物PAPS濃度水平增加明顯;當反應時間為60 min時,反應體系中的PAPS產(chǎn)物達到峰值,產(chǎn)物PAPS的濃度為8.33 mmol/L。繼續(xù)延長反應時間,反應體系中PAPS并不增加,反而略有降低,可能是PAPS不穩(wěn)定所導致的。

2.6 分批補料原料ATP對多酶催化反應合成PAPS的影響

在多酶催化反應體系中,較高濃度的底物ATP(>20 mmol/L)會顯著抑制PAPS的合成。在反應過程中,以分批補料方式添加ATP原料,不僅可以維持體系中一定的ATP濃度,還能一定程度地解除過高濃度的底物對酶活性的抑制作用[19],以進一步提高多酶催化反應合成PAPS的產(chǎn)量水平。在總體積為100 mL的反應體系中,ATP初始濃度為20 mmol/L,考察分批補料底物ATP對多酶催化反應合成PAPS產(chǎn)物的累積影響,結(jié)果如圖11所示。反應過程中,分別在反應時間為1、3和 6 h時添加適量的底物ATP至20 mmol/L。由圖11可知:經(jīng)3次補料后,反應體系中產(chǎn)物PAPS的積累量依然在持續(xù)增加。在反應時間為7 h(第3次補料1 h后)時,反應體系中獲得的產(chǎn)物PAPS積累量達到最大(28.60 mmol/L),相當于產(chǎn)物PAPS的質(zhì)量濃度水平(14.47 g/L)。

圖11 分批補料ATP的對酶法合成PAPS的累積影響

3 結(jié)論

采用密碼子優(yōu)化后的ATP硫酸化酶和APS激酶的基因,并利用sumo標簽融合表達ATP硫酸化酶ATPS,顯著提高了重組酶ATPS和APSK在大腸桿菌中的異源表達水平。克隆并表達了銅綠假單胞菌來源的無機焦磷酸水解酶PPase。優(yōu)化誘導表達條件實現(xiàn)了重組酶ATPS、APSK和PPase在大腸桿菌中高效可溶性表達,搖瓶發(fā)酵液中產(chǎn)生的PPase為1.225 g/L、ATPS為0.752 g/L和APSK為1.470 g/L。對重組酶進行分離純化并研究了酶ATPS和PPase的酶學特征,發(fā)現(xiàn)融合表達的酶ATPS與酶PPase具有相同的最適pH和最適溫度。

以融合表達的酶ATPS、重組酶APSK和酶PPase建立多酶催化反應體系,HPLC和LC-MS驗證了PAPS產(chǎn)物的生成。多酶催化反應體系中加入銅綠假單胞菌來源的無機焦磷酸水解酶PPase消耗中間副產(chǎn)物,有效地驅(qū)動反應進行,對產(chǎn)物PAPS的累積起到了明顯的促進作用。融合表達的酶ATPS與酶PPase具有相同或相近最適pH和最適溫度,能增強多酶催化反應合成PAPS的協(xié)調(diào)性,更加有利于多酶催化反應高效合成PAPS產(chǎn)物。多酶催化反應中,批次補料反應不僅可以維持體系中一定的ATP濃度,還能一定程度地解除過高濃度的底物對酶活性的抑制作用,顯著提升了多酶催化反應體系中累積PAPS的產(chǎn)量水平,最終使PAPS的累積量達到28.60 mmol/L(14.47 g/L)。

多酶催化反應合成PAPS可通過較低的成本獲得PAPS,為后續(xù)研究提供了極大的便利。多酶催化反應合成PAPS仍有很多需要改進和探索的方面,比如PAPS的分離純化以及更高效地利用酶,使得PAPS的制備更加簡便高效,適用范圍更加廣泛,生產(chǎn)成本更加低廉。