曹明原，李 瑩，綦國紅，楊志萍，黃德春，陳貴堂

（中國藥科大學工學院，國家中藥材加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，江蘇 南京 211198）

癌癥是導致工業(yè)化國家發(fā)病率和死亡率升高的主要原因，也是造成人類死亡的主要元兇，其中，乳腺癌在所有癌癥中致死率居第二，主要發(fā)生在女性身上，其發(fā)病率與死亡率預計在未來幾年將顯著增加[1-2]。目前乳腺癌的治療方法包括手術(shù)切除、內(nèi)分泌治療、化療與放射治療等[3]，這些治療方法都可能對患者造成不良的影響，許多化療藥物會導致癌癥患者白細胞數(shù)量減少并出現(xiàn)疼痛、惡心及食欲不振等癥狀[4]。所以，從食品或藥食同源產(chǎn)品中開發(fā)低毒高效的天然活性物質(zhì)替代藥物治療癌癥，是當今醫(yī)學領(lǐng)域研究的熱點與關(guān)鍵。近年來，癌癥免疫治療已成為治療各種癌癥的最佳方法之一，免疫治療主要是通過刺激或增強人體免疫系統(tǒng)來對抗癌癥[5]。大量研究表明，多糖作為一種天然活性成分，有著調(diào)節(jié)免疫[6]、抗氧化[7]、抗腫瘤[8]及抗病毒[9]等作用，是低毒的生物反應調(diào)節(jié)劑，常用于輔助治療，也是用于腫瘤免疫治療的理想選擇。

昆布是褐藻門海帶目海帶科植物海帶（Laminaria japonicaAresch）或翅藻科植物昆布（Ecklonia kuromeOkam）的干燥葉狀體，在我國山東半島、福建及浙江等沿海地區(qū)有著廣泛分布[10]。昆布在《千金方》《吳普本草》及《中華藥典》中均有收錄記載，在傳統(tǒng)藥方中常用于清腸排毒、除濕去腫及改善熱結(jié)便秘等[11]。此外，昆布作為一種藥食兩用物質(zhì)，還具有極高的營養(yǎng)價值，研究表明昆布含有豐富的氨基酸、藻膠酸、多糖、甘露醇及蛋白質(zhì)等成分[12]，其中昆布多糖作為昆布的主要活性成分之一，與昆布的多種生物活性如抗菌、免疫調(diào)節(jié)、降血糖及抗腫瘤等作用有關(guān)[13-16]。雖然關(guān)于昆布多糖的抗腫瘤活性已有大量研究，但到目前為止，關(guān)于昆布多糖對MCF-7乳腺癌細胞作用的相關(guān)報道較少，其對乳腺癌作用的體內(nèi)研究也較為缺乏。本課題組前期通過對3 種不同提取方式（熱水浸提、超聲輔助及復合酶提?。┑玫降亩嗵沁M行分離純化和抗腫瘤活性篩選，發(fā)現(xiàn)熱水浸提的昆布多糖WLP5對MCF-7腫瘤細胞有較高的抑制率[10]。通過體外抗腫瘤實驗發(fā)現(xiàn)，WLP5可通過上調(diào)MCF-7細胞中p53和Bax蛋白的表達、促進Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9的分泌來抑制腫瘤細胞的遷移，并促進腫瘤細胞凋亡[10,17]。然而，單一的體外實驗不足以全面反映昆布多糖的抗腫瘤活性，需要進行進一步的體內(nèi)實驗。因此，在前期工作的基礎上，本研究通過建立MCF-7乳腺癌裸鼠模型，進一步研究昆布多糖WLP5的體內(nèi)抗腫瘤活性及免疫調(diào)節(jié)作用，以期為抗腫瘤藥物的開發(fā)及臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

MCF-7人乳腺癌細胞由中國藥科大學食品質(zhì)量與安全實驗室傳代保存；SPF級裸鼠40 只，雌性，18～22 g，購于常州卡文斯實驗動物有限公司（生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2016-0010）；所有動物實驗操作均符合中國藥科大學實驗動物護理和使用指南（中國藥科大學實驗動物護理倫理委員會許可證號：SYXK-2018-0019）。

中性樹膠、無水乙醇（分析純）、二甲苯 國藥集團化學試劑有限公司；蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染液、分化液、返藍液 武漢賽維爾生物科技有限公司；鹽酸阿霉素（藥用級） 北京博奧拓達科技有限公司；白細胞介素-2（interleukin 2，IL-2）、白細胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor beta，TGF-β）及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒 武漢華美生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

JJ-12J脫水機、JB-P5包埋機、JB-L5凍臺 武漢俊杰電子有限公司；RM2016病理切片機 德國徠卡儀器有限公司；KD-P組織攤片機 浙江省金華市科迪儀器設備有限公司；GFL-230烤箱 天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司；載玻片 武漢賽維爾生物科技有限公司；Eclipse E100顯微鏡、DS-U3成像系統(tǒng) 日本尼康有限公司；RT-6100酶標儀 深圳雷杜生命科學股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 昆布多糖分離純化

昆布多糖WLP5由本課題組前期分離純化得到[10]。昆布粉用熱水浸提（85 ℃、液料比80∶1（V/m）、提取5 h）后離心得到上清液，Sevag法除去蛋白質(zhì)后用無水乙醇醇沉，之后多次以乙醇、丙酮洗滌后真空干燥得到昆布粗多糖CWLP。WLP5為CWLP經(jīng)DEAE-52纖維素層析柱和Sephadex G-100葡聚糖凝膠層析柱洗脫、透析純化后的昆布多糖組分。WLP5純度為（89.53±1.34）%，分子質(zhì)量為14 466 Da，硫酸基相對含量為（3.465±0.004）%，糖醛酸相對含量為（32.642±0.001）%，糖鏈主要組成單糖為吡喃糖，由α-半縮醛羥基和β-半縮醛羥基兩種糖苷鍵連接，以β-糖苷鍵為主。前期體外抗腫瘤實驗表明WLP5對MCF-7細胞有較好的抑制作用[17]，抑制率優(yōu)于其他組分，因此，該組分被用于后續(xù)動物實驗。

1.3.2 荷瘤裸鼠模型的建立

選用體質(zhì)量在18～22 g的SPF級裸鼠，在無病原體的環(huán)境中飼養(yǎng)，將2×106個MCF-7細胞皮下注射到裸鼠的腋窩下構(gòu)建荷瘤裸鼠模型，至腫瘤體積為約40 mm3時（約4 周）開始給藥。

1.3.3 動物分組及給藥

建立乳腺癌裸鼠模型后，稱量裸鼠給藥前體質(zhì)量，用Excel軟件按分層隨機分組法將40 只裸鼠隨機分為模型組（生理鹽水0.2 mL/dmb）、昆布多糖低劑量組（50 μg/kgmb）、昆布多糖高劑量組（200 μg/kgmb）和陽性對照組（鹽酸阿霉素，0.4 μg/kgmb），共4 組，每組10 只，分籠飼養(yǎng)。連續(xù)飼養(yǎng)50 d，隔天灌胃給藥。第51天脫頸椎處死裸鼠，剝離腫瘤與肝臟并拍照記錄。

1.3.4 腫瘤體積及抑瘤率的測定

在給藥期間，每2 d稱量裸鼠的體質(zhì)量，用游標卡尺測量并記錄腫瘤的長徑和短徑，并按公式（1）計算腫瘤體積，按公式（2）計算抑瘤率，以觀察昆布多糖對荷瘤裸鼠的影響[18]。

1.3.5 裸鼠血液學指標分析

在給藥結(jié)束后，裸鼠禁食過夜，眼球取血測定血液學指標[19]。

1.3.6 病理學組織觀察

在第51天采血后處死裸鼠并進行解剖，將裸鼠的肝臟和腫瘤浸泡于體積分數(shù)10%福爾馬林溶液中固定7 d，之后流水沖洗過夜，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，切片，切片厚度為4.0～4.5 μm。將切片依次置于二甲苯I（20 min）、二甲苯II（20 min）、無水乙醇I（5 min）、無水乙醇II（5 min）、體積分數(shù)75%乙醇溶液（5 min），以自來水沖洗。切片于蘇木精染液染色3～5 min后以自來水沖洗，以分化液分化后以自來水沖洗，以返藍液返藍后再次洗。將切片依次置于體積分數(shù)85%、95%乙醇溶液中脫水各5 min，于伊紅染液中染色5 min。將切片依次置于無水乙醇I（5 min）、無水乙醇II（5 min）、無水乙醇III（5 min）、二甲苯I（5 min）、二甲苯II（5 min）透明，中性樹膠封片。采用顯微鏡鏡檢并對圖像進行分析。

1.3.7 血清細胞因子質(zhì)量濃度檢測

裸鼠眼球取血，收集1.0～1.5 mL血液置于EP管中靜置4 h后，3 000 r/min條件下離心10 min，取上清液凍存待檢[20]。檢測前令上清液平衡至室溫，按ELISA試劑盒方法進行操作，檢測裸鼠血液中IL-2、IL-6、TGF-β及TNF-α質(zhì)量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以平均值±標準差表示，對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 昆布多糖對裸鼠體質(zhì)量、腫瘤尺寸及抑瘤率的影響

如表1所示，在實驗期間，各實驗組裸鼠的體質(zhì)量與模型組間無顯著性差異。此外，各實驗組裸鼠的飲食、排泄、毛色等指標均正常，解剖臟器的外觀形態(tài)也無異常變化，說明昆布多糖有較高的安全性。

表1 裸鼠體質(zhì)量的變化（n＝10）Table 1 Changes in body mass of nude mice (n = 10) g

由表2可以看出，給藥34 d和50 d后，相比于模型組，陽性對照組、WLP5高劑量組裸鼠的腫瘤長徑均極顯著減小（P＜0.01）；如表3所示，相比于模型組，給藥34 d和50 d后WLP5高劑量組和陽性對照組裸鼠的腫瘤短徑均極顯著減?。≒＜0.01），而WLP5低劑量組裸鼠的腫瘤短徑則在給藥50 d后極顯著減?。≒＜0.01）。

表2 裸鼠腫瘤長徑的變化（n＝10）Table 2 Changes in long diameter of tumors in nude mice (n = 10)cm

表3 裸鼠腫瘤短徑的變化（n＝10）Table 3 Changes in short diameter of tumors in nude mice (n = 10)cm

如表4所示，相比于模型組，WLP5高劑量組裸鼠在34 d時腫瘤體積極顯著減??；給藥50 d后，相比于模型組，其余3 組裸鼠腫瘤體積均極顯著減?。≒＜0.01），說明在給藥50 d左右，昆布多糖對腫瘤開始表現(xiàn)出明顯的抑制作用，而高劑量的昆布多糖則可更早地發(fā)揮作用。這為臨床試驗提供了理論依據(jù)。

表4 裸鼠腫瘤體積變化（n＝10）Table 4 Changes in tumor volume in nude mice (n = 10)mm3

各實驗組裸鼠的腫瘤解剖圖如圖1所示。根據(jù)腫瘤體積計算抑瘤率。給藥結(jié)束后，WLP5低劑量組與高劑量組的抑瘤率分別為36.5%和48.9%，說明WLP5具有明顯的抑瘤效果，且存在一定的劑量-效應關(guān)系。雖然昆布多糖的抑瘤率略低于陽性對照組（58.2%），但由于昆布多糖完全來自于食物，有著較好的安全性，其在腫瘤治療的應用方面前景廣闊[21]。

圖1 裸鼠腫瘤解剖圖Fig. 1 Anatomical pictures of tumors in nude mice

2.2 昆布多糖對裸鼠血液學指標的影響

血液在人體中參與體液調(diào)節(jié)和氧氣運輸，可以起到調(diào)節(jié)體溫并維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等作用。通常來說，人體中各部位稍有異常病變，都會由血液攜帶其各種信息傳達出來，所以檢查血液中各種細胞成分數(shù)量及比例等的變化可協(xié)助判斷機體各種組織器官的病變情況。如表5所示，陽性對照組裸鼠的淋巴細胞比率、單核細胞比率和單核細胞計數(shù)3 種血液指標以及WLP5高劑量組單核細胞比率、平均血小板體積與模型組存在顯著或極顯著差異，其他指標均無明顯差異。淋巴細胞是白細胞的主要成分，陽性對照組裸鼠的白細胞總數(shù)較模型組有所減少，且淋巴細胞比率較高（46.04%），說明此時陽性對照組裸鼠機體的免疫力較為低下，可能存在病毒感染癥狀；同時，陽性對照組裸鼠的單核細胞計數(shù)（0.04）顯著低于模型組（0.20），且單核細胞比率也較低，對于單核細胞，其數(shù)量可能在機體受到感染、機體防御能力被破壞時降低，這是因為單核細胞與粒細胞有相同的祖細胞，成熟的單核細胞由骨髓釋放進入血液，當機體發(fā)生感染或受到損傷時，單核細胞會迅速聚集并進入感染或損傷的組織中分化成巨噬細胞，釋放干擾素、IL等參與機體防御機制[22]。與模型組相比，WLP5高劑量組裸鼠的單核細胞比率顯著降低，而白細胞數(shù)量、平均血小板體積有所升高和增加，表明WLP5可能激活并促進了免疫反應；血小板由骨髓中的巨核細胞產(chǎn)生，在尚未成熟時體積相對較大，由骨髓中巨核細胞新產(chǎn)生的血小板由骨髓釋放至外周血的數(shù)量偏多會導致平均血小板體積升高[23]，即WLP5高劑量組裸鼠骨髓產(chǎn)血小板功能相對活躍。

表5 昆布多糖對裸鼠血液學指標的影響Table 5 Effect of L. japonica polysaccharide on hematological parameters of nude mice

2.3 裸鼠肝臟組織和腫瘤組織的病理學觀察

由圖2可見，各實驗組裸鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)完整，細胞排列均勻，胞漿豐富，肝小葉、肝索和肝竇結(jié)構(gòu)可辨，肝細胞結(jié)構(gòu)清晰，細胞核清晰可見，相互間界限明顯，無明顯異常[24]。表明低劑量和高劑量昆布多糖都對正常細胞幾乎無毒，副作用很小，其臨床應用是安全的。

圖2 裸鼠肝臟病理學組織變化Fig. 2 Histopathological changes of liver tissue in nude mice

正常情況下腫瘤細胞和T細胞的細胞核在細胞中所占比例較大，實體瘤內(nèi)細胞的細胞核被染成藍紫色，而細胞漿、結(jié)締組織等會被染成深淺不同的紅色，從而能夠分辨出病變的組織或細胞[25]。由圖3可以看出，相較于肝臟組織，腫瘤細胞中的藍紫色更明顯。模型組腫瘤細胞排列紊亂、形態(tài)異常，胞內(nèi)有胞脂肪變性和空泡，瘤組織邊緣有炎性浸潤，還有少量壞死細胞；WLP5低劑量組腫瘤細胞的形態(tài)與模型組相近，存在部分細胞變性壞死；而WLP5高劑量組與陽性對照組的腫瘤細胞形態(tài)相似，出現(xiàn)大面積壞死區(qū)域，細胞核消失，說明高劑量的昆布多糖對腫瘤細胞有著抑制并誘導凋亡的作用。

2.4 昆布多糖對裸鼠細胞因子釋放量的影響

如表6所示，與模型組相比，WLP5低劑量組和高劑量組裸鼠的IL-2、IL-6釋放量均顯著或極顯著提高（P＜0.05，P＜0.01）。IL-2和IL-6釋放量的升高說明昆布多糖極有可能是通過激活免疫系統(tǒng)，促進IL-2和IL-6的分泌，調(diào)節(jié)淋巴細胞的生長分化、激活巨噬細胞來實現(xiàn)抑制腫瘤的作用。IL-6和TNF-α作為多效細胞因子，與炎癥的發(fā)展及多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[26]。瞿秋紅等[27]的研究表明，上調(diào)IL-6基因表達、下調(diào)TPD52及TNF-α基因表達可抑制子宮肌瘤細胞增殖并誘導其凋亡。本研究中，相較于模型組，WLP5低劑量與高劑量組裸鼠TNF-α的釋放量隨WLP5劑量的增加呈現(xiàn)下降趨勢，表明昆布多糖可能通過下調(diào)TNF-α的表達，從而下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶等與腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲有關(guān)的細胞因子表達[28]，進而發(fā)揮抗腫瘤作用。TGF-β可以在腫瘤發(fā)展初期抑制腫瘤細胞的增殖并促進細胞凋亡，但是到了腫瘤發(fā)展階段，TGF-β的作用會發(fā)生轉(zhuǎn)變，其抑癌作用減弱而促癌作用增強[29-30]，WLP5低劑量組與高劑量組裸鼠的TGF-β表達量與模型組相比均有所減少，說明昆布多糖可能通過抑制TGF-β的表達，從而抑制其促癌作用，進而達到抑制腫瘤細胞的效果。

表6 昆布多糖對裸鼠細胞因子釋放量的影響Table 6 Effect of L. japonica polysaccharide on the release of cytokines

褐藻在我國沿海地區(qū)分布廣泛，是一類重要的海洋生物資源，近年來，褐藻多糖以其優(yōu)異的抗腫瘤活性受到研究人員越來越多的關(guān)注。常見的褐藻包括等昆布、萱藻、羊棲菜、裙帶菜等，Han Yun等[31]對裙帶菜多糖中分離得到的裙帶菜多糖SPUP組分進行抗腫瘤活性研究，結(jié)果表明SPUP（100～300 mg/kgmb）可明顯抑制7,12-二甲基苯并蒽（7,12-dimethyltetraphene，DMBA）誘導的乳腺癌大鼠乳房異常增大，降低腫瘤發(fā)生率。免疫療法是目前抗腫瘤的重要手段之一，SPUP被證明可通過提升脾臟和胸腺指數(shù)，拮抗乳腺癌大鼠的免疫抑制[31]。Fan Sairong等[32]構(gòu)建HepG2肝癌小鼠模型，發(fā)現(xiàn)羊棲菜多糖SFPS（100、200、400 mg/kgmb）可顯著抑制腫瘤生長，提高小鼠IL-1、NO水平，并通過上調(diào)Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X，Bax）表達來促進HepG2細胞凋亡，同時促進脾臟的生長。在本研究中，觀察到昆布多糖WLP5（50、200 μg/kgmb）可通過刺激細胞因子IL-2和IL-6的分泌來激活乳腺癌裸鼠的免疫反應并抑制腫瘤生長，也證明免疫系統(tǒng)的激活在抗癌中具有重要作用。Vishchuk等[33]發(fā)現(xiàn)裙帶菜多糖組分UpF2對乳腺癌T-47D細胞有顯著的抑制作用，認為該抑制活性與其結(jié)構(gòu)中含有較多的β-D-半乳糖和巖藻糖有關(guān)。本課題組前期對昆布多糖WLP5單糖組成的測定結(jié)果表明，WLP5由D-甘露糖、核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-半乳糖、木糖、巖藻糖組成，其物質(zhì)的量比為1∶0.39∶0.88∶1.89∶2.37∶1.81∶12.56[17]，可看出其中巖藻糖和D-半乳糖占比較大，該組分在體外抗腫瘤實驗中對MCF-7細胞也表現(xiàn)出較好的抑制活性，與Vishchuk等[33]的結(jié)論一致，因此推測巖藻糖和D-半乳糖占比更高的WLP5組分可能在MCF-7荷瘤裸鼠的抗腫瘤活性中也發(fā)揮著巨大的作用。褐藻糖膠（巖藻聚糖）是一種特殊的天然硫酸化多糖，存在于各種棕色海藻細胞壁基質(zhì)中，Palanisamy等[34]的研究表明，羊棲菜中的褐藻糖膠（150 μg/mL）對MCF-7乳腺癌細胞的抑制率可達90.4%；從褐藻Saccharina cichorioides中提取的褐藻糖膠增加了HCT-116人結(jié)腸癌細胞對白藜蘆醇的敏感性，二者聯(lián)合使用顯著提升了白藜蘆醇的抗腫瘤作用[35]。褐藻多糖優(yōu)異的抗腫瘤活性提示多糖可作為潛在的癌癥預防藥物或輔助化療藥物。

3 結(jié) 論

本研究通過對昆布多糖干預荷瘤裸鼠腫瘤體積變化、肝臟及腫瘤病理學組織切片觀察、血液學指標和細胞因子釋放的測定，考察了昆布多糖在體內(nèi)的抗腫瘤活性。裸鼠的生長情況、體質(zhì)量變化以及腫瘤的尺寸都是反映藥物作用最基本的數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，各實驗組裸鼠的體質(zhì)量在整個實驗期間沒有產(chǎn)生明顯差異，裸鼠的飲食及排泄等指標均正常。在給藥34 d后，WLP5高劑量組裸鼠的腫瘤體積顯著小于模型組。低劑量與高劑量WLP5最終的抑瘤率分別為36.5%和48.9%，表明昆布多糖對腫瘤有較強的抑制作用。對裸鼠血液指標的檢測結(jié)果表明，高劑量WLP5降低了單核細胞比率并增加了血小板平均體積，該組其余各項指標與模型組相比并無顯著性差異。對細胞因子釋放量的測定結(jié)果表明，低劑量和高劑量WLP5均顯著或極顯著促進了IL-2和IL-6的釋放，而TNF-α與TGF-β的釋放量減少。裸鼠肝臟、腫瘤組織的HE染色結(jié)果表明，WLP5對肝臟細胞不具有毒性作用，各實驗組裸鼠肝臟細胞形態(tài)均正常；而WLP5高劑量組裸鼠的腫瘤細胞則出現(xiàn)了大面積壞死等現(xiàn)象。綜上所述，昆布多糖作為天然活性物質(zhì)，具有較強的抗腫瘤作用，且無明顯毒性，其在乳腺癌的臨床治療方面具有潛在的應用價值。