田文妮，宋增柳，楊 淥，肖 杰,2,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東 廣州 510642；2.廣東省功能食品活性物重點實驗室，廣東 廣州 510642）

納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（nanostructured lipid carriers，NLCs）是由脂質(zhì)基質(zhì)（室溫下固體脂和液體油組成的混合脂質(zhì)相）在表面活性劑作用下形成的乳液膠體分散體系[1]。相比于固體脂質(zhì)納米顆粒（油相由室溫下為固態(tài)的固體脂組成）或納米乳液（油相由液體油組成），NLC脂質(zhì)相中固體脂與液體油同時存在，具有不完美的晶體結(jié)構(gòu)，這種無序缺陷型晶格結(jié)構(gòu)為無定形狀態(tài)或非晶簇形態(tài)的功能組分提供更多負載空間，不僅可提高負載量和包封效率，而且能夠減少儲存過程中功能組分的析出滲漏，體現(xiàn)出更高的膠體穩(wěn)定性[2-3]。此外，NLC具有可控的流變行為、消化緩釋特性、生物膜親和性、組織黏液滲透性和上皮細胞吸收率。這些獨特的優(yōu)勢對提高活性物質(zhì)的生物利用度和健康功效具有重要作用[4-5]。

姜黃素具有抗炎、抗腫瘤等生物功效，可通過調(diào)控巨噬細胞中抗炎因子的分泌而發(fā)揮抗炎活性[6]。然而，姜黃素溶解度和生物可及性低，在炎癥部位（巨噬細胞）吸收效率低，極易排出體外[7-10]。這些因素限制了姜黃素抗炎活性的發(fā)揮。通過構(gòu)建NLC負載遞送體系，提高姜黃素在胃腸道中的分散性，增強其在炎癥部位的時滯性和黏液滲透性，是一種可行的策略[11-12]。研究表明，脂質(zhì)相組成（如固體脂種類和固體脂比例）是影響NLC制備和物理特性的重要因素[13]。不同熔點的固體脂質(zhì)（如蜂蠟、棕櫚蠟、單硬脂酸甘油酯、硬脂酸）可通過影響NLC中結(jié)晶的形成和分布行為進而調(diào)控其包封效率和穩(wěn)定性[14-15]。蜂蠟是一種由正烷烴、酯類、脂肪酸和脂肪醇（碳鏈長為18）組成的固體脂質(zhì)（熔點65 ℃），可在室溫下自組裝形成晶體；將蜂蠟與液體油（如中鏈脂肪酸、大豆油）加熱混合后冷卻，可獲得結(jié)構(gòu)化的脂質(zhì)相[15]。作為天然的可食性固體脂，蜂蠟在構(gòu)建脂質(zhì)基乳液（如NLC、固體脂質(zhì)載體）、凝膠（如乳液凝膠、油凝膠）等遞送載體的應用中具有廣闊的前景[16]。此外，固體脂占脂質(zhì)相的比例也是影響NLC結(jié)構(gòu)性能和理化特性的關(guān)鍵因素，Solemanian等[16]從晶體結(jié)構(gòu)角度揭示了蜂蠟（固體脂質(zhì)）與石榴籽油的質(zhì)量比對NLC粒徑、Zeta電位和穩(wěn)定性的影響。Alotaibi等[17]發(fā)現(xiàn)通過調(diào)控油酸（液體脂質(zhì)）和月桂酸（固體脂質(zhì)）的質(zhì)量比可顯著調(diào)控NLC的結(jié)構(gòu)特性、包封率、負載率、釋放行為和生物利用度。綜上，以固體脂占脂質(zhì)相的比例為調(diào)控切入點開展其對NLC結(jié)構(gòu)特性、消化釋放行為及巨噬細胞攝取的調(diào)控研究對提高親脂活性成分姜黃素抗炎活性具有重要指導意義。

本研究采用高速乳化-探頭超聲法制備不同蜂蠟含量的負載姜黃素的NLCs?；趯Σ煌湎灪縉LCs的結(jié)構(gòu)性質(zhì)、封裝效率和剪切流變行為的研究，揭示脂質(zhì)相中蜂蠟含量對NLCs微觀形貌、粒徑電位、負載率、包封率、儲存穩(wěn)定性和表觀黏度的調(diào)控規(guī)律。基于體外黏液黏附和模擬消化實驗，闡釋脂質(zhì)相中蜂蠟含量通過調(diào)控NLCs結(jié)構(gòu)和流變特性對負載姜黃素的NLCs在小腸的黏液黏附滲透行為、脂質(zhì)消化和姜黃素釋放行為的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

RAW264.7細胞 中國科學院細胞庫；SPF級7 周齡SD大鼠 湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物使用許可證號：SYXK（粵）2022-0136。

吐溫80（Tween 80）、蜂蠟（由碳鏈長為30的正烷烴、碳鏈長為35的長鏈脂肪酸酯、碳鏈長為18的脂肪酸和脂肪醇組成）、中鏈脂肪酸甘油三酯（medium-chain triglycerides，MCT）、姜黃素（純度＞98.0%） 上海源葉生物科技有限公司；4%福爾馬林、無水乙醇（均為試劑純） 天津市科密歐化學試劑有限公司；青霉素、鏈霉素、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、高糖DMEM（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）細胞培養(yǎng)基、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染劑 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JY92-IIDN超聲波破碎儀 寧波信智生物科技有限公司；PT 2500 E高速剪切機 瑞士Kinematica公司；KDC-120HR高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；FEI/Talos L120C透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM） 美國FEI公司；Axio Observer A1熒光倒置顯微鏡 德國Carl Zeiss公司；Zetasizer Nano-ZS 90激光粒度儀 英國Malvern公司；Synergy LX多功能酶標儀酶標儀 美國BioTek公司；KAAKE MARS流變儀 美國賽默飛世爾科技公司；動物活體可見光成像系統(tǒng)IVIS Lumina CT III成像設(shè)備 美國珀金埃爾默儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 NLC的制備

以MCT及蜂蠟為混合油相，固定脂質(zhì)相在乳液體系中質(zhì)量分數(shù)為30%，吐溫80質(zhì)量濃度為3 g/100 mL，調(diào)控蜂蠟在脂質(zhì)相中的質(zhì)量分數(shù)分別為0%、5%、10%，采用高速乳化-探頭超聲法制備NLC[12]，分別將樣品命名為NLC0、NLC5和NLC10。具體操作步驟如下：MCT和蜂蠟在75 ℃下混合并熔化，形成均一的混合油相，將模式活性物（姜黃素）按質(zhì)量比1∶60添加到混合油相中，磁力攪拌（轉(zhuǎn)速600 r/min，時間5 min）混合均勻。按比例逐滴加入質(zhì)量濃度為3 g/100 mL的吐溫80雙重蒸餾水溶液（75 ℃）。將水相均勻分散于脂相中并使用均質(zhì)器以10 000 r/min進行4 min均質(zhì)化以制備乳液。接著，采用超聲波探頭對制備好的乳液進行進一步處理，超聲功率65 W，總超聲時間為12 min，超聲程序采用工作時間4 s，間歇時間4 s，超聲完成后迅速置于冰浴中，保持24 h以獲得NLC。

1.3.2 TEM觀察

NLC樣品用雙重蒸餾水稀釋100 倍，放在200 目銅網(wǎng)格上，然后在室溫下風干，采用TEM觀察NLC的形貌特征[17]。

1.3.3 粒徑分布和Zeta電位測定

采用動態(tài)光散射（dynamic light scattering，DLS）分析NLC的粒徑分布和Zeta電位[18]。用雙重蒸餾水將NLC樣品稀釋10 倍，使用Zetasizer Nano-ZS 90激光粒度儀，在90°的固定散射角下進行DLS分析。材料和分散劑的折射率分別為1.450和1.330，溫度設(shè)置為25 ℃。將樣品置于室溫下（25 ℃），監(jiān)測NLC樣品在4 周內(nèi)的粒徑和Zeta電位，以此來評價其穩(wěn)定性。

1.3.4 負載率和包封率測定

精密配制不同質(zhì)量濃度（3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.01 g/mL）的姜黃素乙醇標準品溶液，以吸光度為縱坐標，姜黃素質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。將NLC以15 000 r/min離心30 min后取脂質(zhì)相上清液用無水乙醇按體積比1∶1進行萃取。使用酶標儀測定其在425 nm波長處的吸光度，根據(jù)標準曲線方程計算上清液中姜黃素的質(zhì)量濃度。姜黃素在NLC的負載率和包封率分別按公式（1）、（2）計算[12]。

式中：m姜黃素為負載姜黃素的NLC中姜黃素的質(zhì)量/g；mi為負載姜黃素的NLC干燥后的總質(zhì)量/g。

式中：m0是初始姜黃素的總質(zhì)量/g；m游離姜黃素是游離在外水相（上清液）中姜黃素的質(zhì)量/g。

1.3.5 黏度測定

采用流變儀測定樣品的剪切黏度特性[19]。在兩個平行板的幾何測量單元之間放置大約1 g的NLC樣品，并將間隙的高度設(shè)置為1 mm。樣品在25 ℃下保持2 min，在剪切速率為0～100 s－1的范圍內(nèi)測定樣品表觀黏度。

1.3.6 離體腸黏附滲透實驗

采用離體腸模型進行體外黏附滲透研究[20]。解剖SD大鼠獲取新鮮的小腸，剪成等面積的離體腸切片，將樣品（姜黃素懸液、負載姜黃素的NLC0、NLC5和NLC10，各組的姜黃素總量為0.8 mg）滴注于離體腸切片上，于37 ℃水浴箱中孵育30 min，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗離體腸，用4%福爾馬林固定，DAPI染色后使用IVIS成像設(shè)備成像，測定熒光強度。

1.3.7 體外消化實驗

負載姜黃素的NLC在模擬胃液和模擬腸液中的消化情況參照之前的研究[12]開展。NLC在模擬胃液（0.11 mmol/L脫氧膽酸鈉、34.2 mmol/L氯化鈉、2 mg/mL胃蛋白酶和5 mg/mL吐溫80，pH 2.0）中孵育1 h，然后在模擬腸液（3.90 mmol/L牛磺膽酸鈉、19.12 mmol/L馬來酸、10 mg/mL胰蛋白酶和5 mg/mL吐溫80，pH 7.2）中孵育2 h。采集樣品：NLC在上述模擬體外消化過程的預定時間點（胃模擬消化過程0、30、60 min；小腸模擬消化過程0、5、15、30、45、60、90、120 min）取2 mL消化液，并用等量相應的模擬液替換。將各時間點取出的消化液在11 180×g下離心30 min（4 ℃），通過膜過濾（0.22 μm濾膜過濾器）取上清液，并記錄該體積，按V（消化液）∶V（無水乙醇）＝1∶4混合，利用分光光度計測定425 nm波長處樣品吸光度，以不同質(zhì)量濃度姜黃素標準品繪制標準曲線，并根據(jù)標準曲線方程求出樣品中姜黃素的質(zhì)量濃度，從而計算得到在模擬消化過程中姜黃素的釋放量。

在模擬腸液中進行脂肪分解時，通過手動添加0.25 mol/L NaOH，使pH值保持在7.20±0.02。采用Excel軟件記錄隨時間消耗的NaOH體積，計算脂肪分解產(chǎn)生游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）的濃度。FFA的釋放量按公式（3）計算。

式中：VNaOH是中和產(chǎn)生FFA所需的氫氧化鈉體積/L；cNaOH是所使用的氫氧化鈉溶液的濃度/（mol/L）；mlipid是最初體系中三酰甘油的質(zhì)量/g；Mlipid是三酰甘油的摩爾質(zhì)量/（g/mol）。

采用Gompertz s模型評估模擬腸道消化前40 min內(nèi)FFA釋放的動力學。FFA的釋放動力學參數(shù)按公式（4）計算。

式中：K代表FFA在拐點的釋放速率/min－1；C代表FFA的最大釋放量/%；μ代表FFA釋放曲線中的滯后時間/min；t代表FFA釋放曲線中橫坐標的每個時間點/min。

1.3.8 RAW264.7小鼠巨噬細胞攝取實驗

RAW264.7小鼠巨噬細胞用高糖DMEM細胞培養(yǎng)基（體積分數(shù)10%的磷酸鹽緩沖溶液，100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素）培養(yǎng)[21]。放在37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。為了定量負載姜黃素NLC的攝取量，在24 孔板內(nèi)培養(yǎng)RAW264.7小鼠巨噬細胞（細胞密度為2×105個/孔）24 h后，將培養(yǎng)液換成pH 7.4的新鮮培養(yǎng)液后用NLC樣品孵育12 h。然后用PBS沖洗細胞5 次，用體積分數(shù)4%的福爾馬林溶液處理2 h，用DAPI染色后在熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，計算熒光強度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗均進行3 次重復操作，結(jié)果以3 個獨立實驗的平均值±標準差表示。采用GraphPad Prism 8.0軟件作圖，使用SPSS 22.0軟件中單因素方差分析（ANOVA）和Duncan多重范圍檢驗對P＜0.05的平均值進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂蠟含量對NLC的影響

采用TEM觀察NLC的形貌特征，NLC0、NLC5和NLC10均為近似球體的形貌，分布均一，無顯著團聚現(xiàn)象（圖1A～C）。采用DLS測定了NLC的粒徑分布，如圖1A～D所示，NLC0、NLC5和NLC10的平均粒徑分別為（170.67±2.08）、（207.33±2.52）nm和（256.00±2.00）nm；多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）分別為0.12±0.02、0.14±0.05、0.15±0.04，表明NLC粒徑隨著脂相中蜂蠟含量的增加而增加。這可能是由于當蜂蠟在脂相中的含量較高時，制備冷卻過程中脂質(zhì)相中形成的蜂蠟晶體尺寸較大[22]，導致乳液液滴粒徑增大。Zeta電位是表征NLC穩(wěn)定性的重要指標。由圖1E可知，所有NLC的Zeta電位均小于－30 mV，表明其具有良好穩(wěn)定性。隨著蜂蠟在總脂相中的比例增加，NLC的Zeta電位未發(fā)生顯著變化（P＞0.05），表明蜂蠟含量增加沒有顯著改變NLC的表面電荷屬性和數(shù)量。

圖1 蜂蠟含量對NLCs結(jié)構(gòu)特性的影響Fig. 1 Effects of beeswax contents on the structural characteristics of NLCs

NLC包封率和負載率是衡量其功能活性物遞送效率的重要指標之一[23]。以脂溶性活性物姜黃素為活性物模式物，探究蜂蠟在脂相中的比例對NLC包封率和負載率的影響。由圖1A～C、E可知，NLC0、NLC5和NLC10對姜黃素的包封率分別為（87.82±1.32）%、（92.36±1.02）%和（97.27±0.68）%，負載率分別為（1.45±0.01）%、（1.53±0.03）%和（1.61±0.02）%，表明NLC對姜黃素具有良好負載能力和包封效果，且隨著蜂蠟比例增加，其負載率、包封率均升高。這是由于NLC制備的冷卻過程中，蜂蠟再結(jié)晶并以α和β型晶體在MCT液體油中呈現(xiàn)無序分布狀態(tài)，這種不完美晶體結(jié)構(gòu)使NLC的脂質(zhì)相具有更大的空間容納活性物[24]，從而抑制姜黃素外排。此外，蜂蠟含量增大，晶體數(shù)量增大，晶體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)增強，使得NLC脂質(zhì)基剛性增強[8]，進一步阻止姜黃素滲漏，提高了姜黃素包封率和負載率。

2.2 蜂蠟含量對NLC儲存穩(wěn)定性的影響

良好的儲存穩(wěn)定性是NLC實現(xiàn)功能活性物質(zhì)遞送的前提[25]。本研究監(jiān)測了NLC在4 周常溫儲存過程中的粒徑、電位和包封率的變化規(guī)律，探究了蜂蠟在脂相中的比例對NLC儲存穩(wěn)定性的影響。由圖2可知，NLC0在前3 周常溫儲存過程中粒徑、Zeta電位和姜黃素包封率沒有發(fā)生顯著性變化（P＞0.05），但第4周其粒徑和姜黃素包封率顯著下降（P＜0.05）。值得注意的是，NLC5和NLC10在4 周常溫儲存過程中粒徑、電位和姜黃素包封率穩(wěn)定，表明和液體油組相比，添加固體脂質(zhì)（蜂蠟）可提高納米脂質(zhì)載體儲存穩(wěn)定性，這可能是蜂蠟的加入提高了乳液體系的剛性和黏度，脂質(zhì)相的無序晶型結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，液滴不易發(fā)生聚結(jié)[26]。相比于納米乳液（NLC0），蜂蠟基NLC在室溫儲存過程中物理穩(wěn)定性更強。

圖2 蜂蠟含量對NLCs在4周內(nèi)的儲存穩(wěn)定性影響Fig. 2 Effects of beeswax content on the storage stability of NLCs within four weeks

2.3 蜂蠟含量對NLC黏度的影響

表觀黏度是影響NLC穩(wěn)定性的關(guān)鍵參數(shù)[27]，因此本實驗在0～100 s－1的剪切速率變化范圍內(nèi)，監(jiān)測了NLC在剪切作用下表觀黏度的變化。由圖3A、B可知，在0～0.5 s－1剪切速率內(nèi)，NLC5和NLC10的表觀黏度隨著剪切速率的增加而降低，繼而緩慢下降，而后趨于穩(wěn)定，表明NLC5和NLC10呈現(xiàn)出剪切稀化行為。值得注意的是，在初始剪切速率（0.1 s－1）下NLC0、NLC5和NLC10的表觀黏度分別為（0.036±0.001）、（10.220±1.034）Pa·s和（21.490±1.987）Pa·s（圖3C），表明蜂蠟的添加顯著提高了納米脂質(zhì)載體的表觀黏度（P＜0.01，P＜0.001），這可能是由于脂質(zhì)相中的蜂蠟形成了晶體結(jié)構(gòu)，增加了NLC的流動阻力，從而提高了樣品的表觀黏度[24]。乳液黏度增大使得體系中液滴的運動速度減慢，有利于抑制液滴的絮凝或聚集[28]，這與2.2節(jié)中NLC儲存穩(wěn)定性的研究結(jié)果相印證。

圖3 蜂蠟含量對NLCs表觀黏度的影響Fig. 3 Effect of beeswax content on apparent viscosity of NLCs

2.4 蜂蠟含量對NLC小腸黏附滲透特性的影響

小腸是營養(yǎng)活性物的主要吸收場所，因此，探究NLC在腸道的黏附滲透特性非常必要。在本研究中，采用離體小鼠小腸模型[29]測定了游離姜黃素（CON空白對照組）、負載姜黃素的NLC0、NLC5和NLC10在小腸的黏附滲透效率。由圖4A可知，CON組小鼠小腸組織未檢測到姜黃素熒光信號，表明游離姜黃素在小腸黏膜的黏附和滲透效率很低。負載姜黃素的NLC0、NLC5和NLC10組小鼠小腸組織均檢測到強烈的姜黃素熒光信號，表明NLC的引入可顯著提高姜黃素在小腸黏膜的黏附和滲透效率，這是由于NLC粒徑小，不僅增強了姜黃素在胃腸液中的分散性和溶解性，且增大了比表面積，增強了納米載體在小腸黏膜的黏蛋白中的吸附效率[30-31]；同時在小腸環(huán)境中，NLC的脂解產(chǎn)物（FFA、表面活性劑和溶解的姜黃素）和膽鹽被組裝成混合膠束和囊泡，形成的膠束和囊泡更容易通過小腸上皮靜態(tài)水層滲透到黏液底層，從而提高姜黃素在小腸上皮細胞的吸收效率[32]。由圖4B可知，NLC0、NLC5和NLC10組的平均熒光信號強度分別為6.072×106、7.303×106和9.413×106，NLC5和NLC10組姜黃素在上皮組織細胞的熒光信號強度比NLC0組分別提高了20.27%和55.02%，表明隨著蜂蠟質(zhì)量分數(shù)從0%增加到10%，NLC在小腸的黏附和滲透能力顯著增強（P＜0.05，P＜0.01），這可能是由于蜂蠟含量增大有利于提高NLC的黏度，延長了NLC在黏液層的滯留時間，從而提高了可被小腸細胞吸收的姜黃素的濃度[33]。綜上，蜂蠟在脂相中的比例是調(diào)控姜黃素在小腸黏膜的黏附和滲透效率的關(guān)鍵因素，提高NLC脂質(zhì)相中的蜂蠟含量可提高其在小腸黏膜中的黏附效率，促進其運載的脂溶性活性物在小腸上皮組織的滲透和吸收。

圖4 蜂蠟含量對NLCs在小腸的黏附滲透特性的影響Fig. 4 Effect of beeswax content on the adhesion and penetration efficiency of NLCs in small intestine

2.5 蜂蠟含量對NLC消化釋放特性的影響

NLC在胃腸道中消化行為及其對活性物的控制性釋放是影響其遞送效率和功效發(fā)揮的關(guān)鍵因素[34]。NLC0、NLC5和NLC10在體外的釋放情況見圖5。在模擬胃消化結(jié)束后，3 組NLC制劑的姜黃素釋放量均小于7%（圖5A），表明NLC在胃模擬環(huán)境中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。相比NLC0（（6.39±0.22）%），NLC5和NLC10的姜黃素釋放量分別下降至（1.69±0.04）%和（1.58±0.03）%，表明脂質(zhì)相中蜂蠟含量增加有利于減少姜黃素在模擬胃液中的滲漏。在模擬小腸消化過程中，3 組NLC制劑的姜黃素釋放量均明顯增大，表明NLC的主要消化部位在小腸。隨著固體脂蜂蠟質(zhì)量分數(shù)從0增加至5%再增加至10%，姜黃素釋放總量由（99.93±0.09）%降低到（96.38±0.05）%再降低至（90.05±0.05）%，表明增加蜂蠟比例有利于降低疏水性活性物（姜黃素）的釋放總量。這可能是由于NLC蜂蠟含量增大，減少了中鏈甘油三酯與胰脂肪酶接觸面積[35]。

圖5 蜂蠟含量對模擬消化液中NLCs體外釋放行為的影響Fig. 5 Effect of beeswax content on the in vitro release profile of NLCs in simulated digestion fluid

為了進一步探究NLC在小腸環(huán)境中的脂解過程，監(jiān)測了小腸模擬消化過程中FFA的釋放情況。如圖5B所示，與姜黃素的釋放情況類似，在30 min內(nèi)NLC0組的FFA呈現(xiàn)出突然釋放行為，在15 min內(nèi)釋放量達到59.93%，在30 min內(nèi)釋放量大于80%。隨脂質(zhì)相蜂蠟比例的增加，NLC釋放速率減緩，30 min內(nèi)NLC5和NLC10的姜黃素釋放量僅為（61.20±2.95）%和（51.30±1.03）%。對FFA釋放過程的動態(tài)模擬可知，F(xiàn)FA釋放速率為KNLC0（0.13 min－1）＞KNLC5（0.08 min－1）＞KNLC10（0.06 min－1）（圖5C～E），進一步證實了增加蜂蠟比例可減緩FFA釋放速率，即降低NLC脂解效率，從而降低姜黃素的釋放量。

2.6 蜂蠟含量對NLC巨噬細胞攝取的影響

巨噬細胞是炎癥發(fā)生和腫瘤發(fā)生發(fā)展的主要參與者，是炎癥和腫瘤治療的重要靶點[36]。探究巨噬細胞對不同蜂蠟含量NLC攝取效率的影響，對NLC在抗炎方面的應用具有重要指導作用。如圖6A、B所示，游離姜黃素組（CON）顯示出的綠色熒光信號微弱，其平均熒光強度為0.98×106，表明RAW264.7小鼠巨噬細胞對游離的姜黃素攝取效率低。而當姜黃素裝載到NLC中時，細胞內(nèi)的綠色熒光強度提高了5.68～6.25 倍，表明NLC增強了小鼠巨噬細胞對姜黃素的吞噬效率。NLC粒徑小、比表面積大、在血清培養(yǎng)基中的分散性和溶解性高，生物相容性高，因而有利于其被巨噬細胞吞噬和攝取[37]。值得注意的是，NLC0、NLC5和NLC10組的平均熒光強度分別為6.548×106、6.723×106和7.102×106，各組間不存在顯著差異（P＞0.05），表明脂質(zhì)相中蜂蠟的比例不是影響巨噬細胞吞噬NLC的關(guān)鍵參數(shù)。綜上，NLC可促進姜黃素在巨噬細胞內(nèi)的富集，從而有利于其抗炎和抗腫瘤功效的發(fā)揮。

圖6 蜂蠟含量對NLCs巨噬細胞攝取的影響Fig. 6 Effect of beeswax content on macrophage uptake of NLCs

3 結(jié) 論

闡明脂質(zhì)相組成對NLC的消化釋放行為和巨噬細胞攝取的調(diào)控作用對于合理設(shè)計NLC以實現(xiàn)脂溶性活性物的健康效應最大化具有科學價值。脂質(zhì)相中蜂蠟的質(zhì)量比是調(diào)控NLCs粒徑、負載率、包封率、儲存穩(wěn)定性和剪切黏度的關(guān)鍵控制因素。蜂蠟基NLCs形貌近似球體，粒徑?。?70.67～256.00 nm），具有良好的姜黃素負載率（＞1.45%）和包封率（＞87.25%）。隨著蜂蠟含量增大，其粒徑增大，負載率、包封率均有所增加。蜂蠟基NLC乳液體系的剛性和黏度增強，儲存穩(wěn)定性提高。離體腸黏附滲透實驗結(jié)果表明，蜂蠟含量是調(diào)控姜黃素在小腸黏膜的黏附和滲透效率的關(guān)鍵因素，蜂蠟含量增加可提高姜黃素小腸黏膜黏附效率，促進姜黃素在小腸上皮組織的滲透吸收。此外，蜂蠟基NLC促進了姜黃素在巨噬細胞內(nèi)的富集（相比游離姜黃素組，NLCs組巨噬細胞對姜黃素的攝取效率提高了5.68～6.25 倍）。體外模擬消化釋放實驗表明，增加蜂蠟含量減緩了FFA釋放速率，繼而減少了姜黃素釋放量。綜上，本研究可為蜂蠟基NLCs在脂溶性活性物的消化控制性釋放、經(jīng)小腸黏膜增效吸收和在炎癥病灶處巨噬細胞吞噬效率的調(diào)控應用提供理論參考。