朱 荻，陳莎男，梅曉宏，岳 慶，常茹欣，李 星，劉 斌，張華磊，韓小龍，李 媛,*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，食品膠體與營養(yǎng)遞送研究中心，北京 100083；2.山東中科嘉億生物工程有限公司，山東 濰坊 262500）

世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）對益生菌的定義是“通過定植在宿主腸道內(nèi)，調(diào)節(jié)宿主腸道菌群平衡或黏膜免疫并賦予宿主健康益處的一類活的微生物”[1]。研究報道益生菌具有緩解便秘、改善腹瀉、緩解結(jié)腸炎、調(diào)控糖脂代謝等生理功能[2-5]。然而，體外加工和貯藏過程中的溫度、濕度和氧氣都會影響益生菌活性，降低其存活率。并且益生菌在口服后會受到消化道胃酸和膽鹽的脅迫導致存活率降低，研究表明胃酸中H＋會引起益生菌的表面膜電位變化，使益生菌表面通透性改變，從而導致其死亡[6]。并且，益生菌在腸道的黏附定植對其存活率和發(fā)揮健康功效也至關(guān)重要。益生菌作為外來菌與腸黏液的相互作用通常比較弱，并且宿主腸道內(nèi)的土著微生物也會與新攝入益生菌發(fā)生競爭，從而抵抗外來益生菌的定植，加上消化道蠕動和消化液沖刷，益生菌黏附和定植效果不佳則容易被排出體外，難以發(fā)揮益生作用[7-9]。因此，如何最大限度地保持益生菌在貯藏加工過程的體外穩(wěn)定性和口服后的體內(nèi)腸道存活率是目前益生菌制劑生產(chǎn)中面臨的巨大挑戰(zhàn)。

近年來，遞送載體在保護益生菌耐加工貯藏穩(wěn)定性和體內(nèi)存活率方面具有較大優(yōu)勢，是解決益生菌存活率低的有效策略。載體對益生菌進行包埋，可屏蔽高溫、高濕和氧氣等不良環(huán)境影響，并能夠在胃液低pH值環(huán)境中形成保護屏障，保護益生菌免受胃酸侵蝕，有效減少益生菌在胃部的損失，增強益生菌活性[10-11]；到達腸道后載體通過響應(yīng)性釋放出益生菌；且壁材大分子與黏蛋白之間存在較強相互作用，可以提高益生菌在腸道的黏附和定植能力[12]。常用的益生菌口服遞送系統(tǒng)包括微膠囊[13]、微凝膠[14]、納米載體[15]、乳液[16]、水凝膠[17]和油凝膠[18]等，已被證實能夠有效保護益生菌免受外界環(huán)境的侵害、促進益生菌腸道靶向遞送和黏附定植、進一步提高益生菌的生理活性。益生菌遞送技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于酸奶、奶酪、冰激凌、肉制品和固體飲料等產(chǎn)品中，有效保護了益生菌活性。未來隨著益生菌遞送系統(tǒng)的發(fā)展和完善，將會運用于越來越多的產(chǎn)品中。本文概述了益生菌制劑中常用的益生菌種類及其特點，分析了體內(nèi)外環(huán)境對益生菌活性的影響，重點比較了提高益生菌耐加工貯藏穩(wěn)定性和體內(nèi)存活率的遞送系統(tǒng)，并總結(jié)了其在食品中的應(yīng)用。

1 益生菌的種類和功能

傳統(tǒng)的益生菌是從腸道、母乳和發(fā)酵食品中分離出來的。多數(shù)益生菌為革蘭氏陽性菌，其中乳桿菌屬（Lactobacillusspp.）、雙歧桿菌屬（Bifidobacteriumspp.）和芽孢桿菌屬（Bacillusspp.）應(yīng)用最為廣泛[19]。

益生菌可以通過競爭抑制減少腸道內(nèi)致病菌的生長繁殖，從而調(diào)節(jié)人體免疫功能、改善腸道健康[3]。益生菌作用于人體的機制有以下3 種：1）直接作用于宿主：益生菌的代謝產(chǎn)物和細胞壁成分可以通過免疫反應(yīng)機制與宿主胃腸道上皮和樹突狀細胞等相互作用，增強胃腸道黏液屏障功能，從而調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，預防或治療疾病[20]；2）對其他微生物產(chǎn)生影響：益生菌能夠促進其共生菌的生長，通過空間位阻阻止致病菌的附著，從而調(diào)節(jié)宿主腸道微生物的穩(wěn)態(tài)；3）與腸道代謝產(chǎn)物作用：益生菌能夠與其他微生物分泌的毒素等產(chǎn)物結(jié)合，從而消除宿主體內(nèi)毒素[20-21]。

表1中列出了益生菌制劑中常用的益生菌種類、特征、穩(wěn)定性及其功能。

表1 益生菌制劑中常用的益生菌種類、特征、穩(wěn)定性及其功能Table 1 Types, features, stability and functions of probiotics commonly used in probiotic products

總體而言，益生菌的功能主要是調(diào)節(jié)免疫、改善腸道健康、改善腹瀉、降低膽固醇等，然而這些功能必須在一定的益生菌活性基礎(chǔ)上才能實現(xiàn)。我國衛(wèi)計委明確規(guī)定：“活性益生菌保健食品在其保質(zhì)期內(nèi)活菌數(shù)不得低于106CFU/mL（CFU/g）”。2022年中國營養(yǎng)保健食品協(xié)會發(fā)布《益生菌食品活菌率分級規(guī)范》，對益生菌產(chǎn)品的益生菌活菌率進行分級，其中只有活菌率大于等于50%才能滿足1級標準，說明益生菌活菌率對于益生菌產(chǎn)品至關(guān)重要。然而，益生菌的穩(wěn)定性較差，在經(jīng)過菌種冷凍保藏、加工、貯藏和體內(nèi)消化等環(huán)節(jié)之后，活菌數(shù)量會急劇下降，可能難以達到106CFU/mL（CFU/g），從而難以在人體內(nèi)發(fā)揮預期的有益作用。

2 影響益生菌活性的因素

益生菌在菌種保藏、加工貯藏和口服的過程中，會受到濕度、溫度、pH值、氧氣、胃酸、膽鹽、土著微生物等各種不利條件的影響，導致活菌數(shù)量下降，限制益生菌的有益作用[31]。表2列出了影響益生菌活性的體外和體內(nèi)因素。

表2 影響益生菌活性的因素Table 2 Factors affecting the viability of probiotics

2.1 菌種冷凍保藏過程對益生菌存活率的影響

菌種保藏是制備益生菌產(chǎn)品的基礎(chǔ)，冷凍保藏和冷凍干燥保藏是最常用的菌種保藏方法[32]。冷凍保藏是將微生物存放在－80 ℃或－196 ℃的冷庫中長期貯藏的方法[33]，常加入甘油作為細菌冷凍保藏的保護劑，延緩益生菌冷凍過程中的滲透性收縮[34]。冷凍干燥保藏的益生菌具有良好的貯藏穩(wěn)定性，但如果操作工藝不當，活菌數(shù)會大幅度下降。這是因為過低的溫度會導致細胞內(nèi)形成冰晶，破壞微生物的細胞結(jié)構(gòu)，同時形成冰晶后益生菌內(nèi)部溶質(zhì)濃度升高，滲透壓升高，使益生菌受損[35]。例如，副干酪乳桿菌和長雙歧桿菌發(fā)酵劑菌株在冷凍保藏過程中活菌數(shù)下降了4（lg（CFU/g）），一定程度上影響了后續(xù)干酪制品的制備[36]。為最大限度保持菌種活性，常在冷凍過程中添加麥芽糊精、菊粉、脫脂牛乳等冷凍保護劑[37]。在嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌凍干過程中添加低聚果糖保護劑可有效緩解菌種活力的降低（活菌數(shù)僅下降約1.00（lg（CFU/g）），而未添加保護劑的益生菌凍干后活菌數(shù)分別下降2.03（lg（CFU/g））和1.63（lg（CFU/g））[38]。

2.2 加工和貯藏過程中環(huán)境因素對益生菌存活率的影響

益生菌在加工貯藏過程中會受到濕度、溫度、pH值、氧氣、食物組分等因素的影響，導致活性降低。

2.2.1 濕度

相對濕度（relative humidity，RH）和水分活度會影響益生菌的存活率。較高水分活度有利于益生菌存活與生長繁殖，而對于加工而成的益生菌粉末產(chǎn)品，相對濕度越低越有利于其長期保存。相對濕度越大，益生菌粉末越易吸潮，粉末黏度降低，流動性增加，更易導致乳糖結(jié)晶、美拉德反應(yīng)和結(jié)塊等現(xiàn)象的發(fā)生[39]，使產(chǎn)品性狀發(fā)生改變。同時，相對濕度越高，益生菌水分吸收量相應(yīng)增加，導致新陳代謝重新被激活，分解消耗營養(yǎng)物質(zhì)[40]；脂肪被分解，微膠囊壁材結(jié)構(gòu)被破壞，氧氣擴散進入微膠囊，加速益生菌死亡，從而降低貯藏穩(wěn)定性[41]。在海藻酸鈉和低聚半乳糖中包封羅伊氏乳桿菌，并采用噴霧干燥生產(chǎn)益生菌粉末，在不同水分活度下貯藏，60 d內(nèi)羅伊氏乳桿菌活性均下降，在較低水分活度（0.11）下，活性損失較低（活菌數(shù)下降1.78（lg（CFU/g））），而隨著水分活度增加，益生菌活性逐步下降，在較高水分活度（0.52）下活菌數(shù)下降6.24（lg（CFU/g））[42]。因此，益生菌粉長期貯藏期間水分活度應(yīng)低于0.25[43]。

2.2.2 溫度

高溫對益生菌活性的影響極為顯著。低于45 ℃的加工溫度通常對益生菌無害，而超過65 ℃的高溫會使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆變性，從而降低益生菌的活性[44-45]。噴霧干燥過程中的高溫會對益生菌活性造成破壞，冷凍干燥后魚明膠和麥芽糊精微膠囊化的鼠李糖乳桿菌的存活率高達81%，而噴霧干燥后的存活率僅為10%[5]。但過低的溫度也會對益生菌的活性造成影響，當環(huán)境溫度驟降時，益生菌細胞膜的流動性會降低、DNA超螺旋水平發(fā)生變化，會影響DNA的復制、轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)的形成，形成的冰晶也會對細胞造成機械損傷[45]，使益生菌生長緩慢。例如，含有植物乳桿菌的酸奶在－49 ℃下冷凍干燥24 h，凍干后植物乳桿菌存活率下降了33%[46]；糞腸球菌去離子水菌液在－40～－30 ℃下冷凍干燥24 h，凍干后糞腸球菌存活率下降了85%～90%[47]。不同類型的益生菌產(chǎn)品在不同貯藏溫度下存活率也存在差異。例如，采用嗜酸乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌生產(chǎn)的葡萄汁在4 ℃下冷藏21 d后仍具有較好的益生菌活性（均超過7（lg（CFU/mL））[48]，而益生菌凍干粉在室溫下可以貯藏更長的時間（60 d仍保持7（lg（CFU/g）））[49]。

2.2.3 pH值

加工過程中pH值對益生菌的活性也會產(chǎn)生影響。不同種類益生菌的最適pH值范圍不同。例如，嗜酸乳桿菌在pH 3和pH 4下至少可以存活2 h，而在pH 2下細胞數(shù)量迅速減少，45 min后幾乎完全死亡[50]；保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌在pH 1.5下孵育2 h后，活菌數(shù)均下降了6（lg（CFU/mL））[51]?，F(xiàn)有的多數(shù)益生菌產(chǎn)品為發(fā)酵乳制品，絕大多數(shù)呈酸性[44]，發(fā)酵過程中產(chǎn)品酸堿度的變化會對益生菌的活性產(chǎn)生影響。酸奶發(fā)酵是一個典型的例子，采用混合益生菌發(fā)酵生產(chǎn)益生菌酸奶的過程中，在43 ℃下，4.5 h內(nèi)酸奶的pH值從6.2下降至4.6，相應(yīng)的活菌數(shù)略微上升（增加量少于1（lg（CFU/mL））），而隨著益生菌持續(xù)發(fā)酵產(chǎn)酸，酸奶pH值持續(xù)下降，3 周內(nèi)下降至pH 3.7左右，此時嗜熱鏈球菌因酸性過高停止生長，而乳酸桿菌和雙歧桿菌仍然生長并產(chǎn)生氨基酸，又會引起pH值升高[52]。

2.2.4 氧氣

氧含量也會對益生菌活性產(chǎn)生較大影響。多數(shù)益生菌為厭氧微生物或兼性厭氧微生物，因此，過高的氧氣含量會導致其活性降低[7]。氧氣以兩種形式影響益生菌的活性，第一種是細胞毒性，部分益生菌對氧氣非常敏感，在接觸氧氣后會在細胞體內(nèi)產(chǎn)生ROS，ROS對細胞表面的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)有很強的氧化作用[53]，會導致益生菌直接死亡；第二種是在培養(yǎng)過程中，部分益生菌會吸收氧氣，排出ROS，從而抑制自身活性[44]。例如，大于5 mmol/L的過氧化氫和大于10 mmol/L的甲萘醌環(huán)境可以強烈抑制植物乳桿菌的生長[54]。

2.2.5 食物組分

食物組分是影響益生菌以活體形式到達腸道的重要因素之一。食品中的糖和鹽改變了益生菌生長環(huán)境的滲透壓，在高滲環(huán)境中細胞失水，益生菌收縮導致質(zhì)壁分離，細胞生長受到抑制甚至死亡；在等滲環(huán)境中益生菌可以正常生長繁殖；在低滲環(huán)境中，益生菌吸水膨脹，甚至破裂死亡。但在食品組分中適當添加糖類對于保護各種益生菌十分有效，糖類中的羥基可以穩(wěn)定益生菌的細胞膜脂質(zhì)和蛋白質(zhì)[55]。益生元例如菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖、乳鐵蛋白等也是益生菌口服遞送過程中十分重要的食物組分。益生元可以為益生菌提供生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，刺激益生菌生長，部分益生元還可以抵抗、分解病原體和毒素[56]，保護益生菌不受侵害。研究發(fā)現(xiàn)低聚半乳糖可以促進鼠李糖乳桿菌的生長[57]，阿拉伯木聚糖可以促進短雙歧桿菌和羅伊氏乳桿菌的生長[58]。此外，食品中的其他組分可以伴隨益生菌一同進入胃部稀釋胃液[59]，從而保護益生菌免受極端pH值的侵害。

2.3 消化道環(huán)境對益生菌存活率的影響

食品從口腔進入人體，經(jīng)過口腔咀嚼、胃部消化、小腸進一步消化吸收，進入大腸最終變成糞便從肛門排出[12]。上消化道包括口腔、咽、食道、胃和十二指腸[60]，益生菌制劑在上消化道中所要克服的障礙主要來自口腔和胃部。下消化道包括空腸、回腸和大腸，益生菌在這里需要與土著微生物競爭有限的資源，并在腸道定植，從而持續(xù)穩(wěn)定地在人體內(nèi)發(fā)揮有益作用。

2.3.1 口腔

口腔條件一般為中性，pH 7.4左右?？谇煌僖褐泻械矸勖?，負責分解口腔中的物質(zhì)，同時也可能對益生菌制劑的成分和結(jié)構(gòu)造成一定影響。食物在口腔中混合著淀粉酶和礦物質(zhì)離子被吞下[61]。相較于胃部，由于口腔條件較為溫和，并且食物在口腔中停留時間較短，因此對益生菌活性影響較小。

2.3.2 胃

胃部環(huán)境非常不利于益生菌生存，這主要是因為胃液中的胃酸和消化酶（圖1）。胃酸中的H＋會導致益生菌膜Zeta電位改變，進而改變細胞膜的通透性，導致細胞死亡；此外，高酸性環(huán)境導致益生菌ATP合成酶活性降低，使益生菌合成ATP的能力下降。胃中的胃蛋白酶和胃脂肪酶將益生菌細胞膜中的蛋白質(zhì)分解為小肽片段和氨基酸，磷脂分解成脂肪酸，從而破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，抑制細胞的物質(zhì)交換，降低益生菌活性。

圖1 胃部環(huán)境Fig. 1 Schematic diagram of stomach environment

空腹時胃酸的pH值為1.5左右，進食期間pH值增加到3.0～5.0，這樣的環(huán)境非常不利于益生菌生存[62]。胃酸中的H＋可能會導致益生菌細胞膜的Zeta電位發(fā)生改變，進而改變細胞膜的通透性[6]，導致細胞進入胃部之后死亡。此外，高酸性環(huán)境還會導致益生菌ATP合成酶的活性降低，使益生菌合成ATP的能力下降[62]，從而降低益生菌在胃部的生存能力。鼠李糖乳桿菌在益生菌中具有相對較強的耐酸性，其中ATP合成酶和應(yīng)激蛋白是其耐酸性的主要影響因素，在酸性條件下鼠李糖乳桿菌的clpC、clpE、atpA和dnaK基因表達上調(diào)，一方面導致ATP合成酶mRNA水平增加，質(zhì)子從細胞質(zhì)泵入外膜，維持細胞質(zhì)pH值中性；另一方面應(yīng)激蛋白表達上調(diào)，協(xié)助受損蛋白重新折疊[63]，使得鼠李糖乳桿菌能夠在胃部環(huán)境中長期生存。

胃中的消化酶也會對益生菌活性產(chǎn)生影響。胃中的消化酶主要是胃蛋白酶和胃脂肪酶[64]，胃蛋白酶可以將益生菌細胞膜中的蛋白質(zhì)分解為小肽片段和氨基酸，胃脂肪酶可以將益生菌細胞膜中的磷脂分解成脂肪酸，從而破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，抑制細胞的物質(zhì)交換，降低益生菌活性。

2.3.3 小腸

小腸中含有脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶等消化酶，以及膽鹽、碳酸氫鹽等物質(zhì)，是營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的主要部位[65]。與結(jié)腸相比，小腸的酸性更強，氧氣、抗菌物質(zhì)含量和離子濃度也更高，因此小腸中的微生物以快速生長的兼性厭氧菌為主，同時食物在小腸中的消化時間更短，所以益生菌在小腸中需要克服的生存障礙主要是消化酶、膽鹽和腸黏液[7]。

小腸中的脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶會分解益生菌細胞的磷脂、氨基酸肽鏈和糖原等，破壞益生菌的細胞結(jié)構(gòu)，影響益生菌與外界環(huán)境的物質(zhì)交換，從而影響其生理活動。膽鹽由于其表面活性劑的特性，會破壞細胞膜的磷脂雙分子層，導致細胞膜完整性下降[53]。除了膽鹽對益生菌口服遞送的阻礙以外，腸黏液也會影響益生菌的定植。腸黏液會阻擋有害物質(zhì)，但允許低分子質(zhì)量的營養(yǎng)物質(zhì)和藥物等有益成分滲透到達小腸上皮，最終被人體吸收[9]，所以益生菌需要與腸道上皮細胞和樹突狀細胞接觸，與模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）特異性識別[21]，從而完成定植，持續(xù)地對人體產(chǎn)生有益的作用。

2.3.4 結(jié)腸

結(jié)腸是益生菌定植的主要部位。相較于小腸，結(jié)腸中氧氣含量較低，抗菌物質(zhì)濃度較低，食物消化速度較慢，有利于厭氧菌的生長[7]。在益生菌到達結(jié)腸后，必須與已經(jīng)定植在結(jié)腸中的微生物競爭。土著微生物會通過競爭抑制阻礙外來微生物在腸道內(nèi)定植，它們會與益生菌競爭定植位點和結(jié)腸中的營養(yǎng)物質(zhì)，或者分泌毒性物質(zhì)降低益生菌活性。部分攝入的益生菌難以定植，必須長期服用才會有顯著的生理效果。但部分益生菌具有顯著的抗菌特性，這主要是因為它們可以和土著微生物競爭結(jié)腸內(nèi)有限的營養(yǎng)物質(zhì)，或者可以分泌出抑制性化合物（如過氧化氫、有機酸等）[66]，通過改變結(jié)腸內(nèi)部分區(qū)域的pH值和產(chǎn)生ROS，抑制土著微生物的生理活動，從而促進自身腸道定植和生長繁殖。例如，植物乳桿菌可以通過分泌乳酸、過氧化氫、競爭性黏附受體等抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌定植[67]。

3 提高益生菌存活率的方法

3.1 益生菌菌種篩選

從人體腸道或糞便中分離益生菌菌株是一種簡單直接的篩選方法，得到的益生菌也有較高的腸道存活可能性。此外，可以通過體外篩選測定益生菌的穩(wěn)定性和功能特性[68]。體內(nèi)實驗?zāi)Ｐ涂梢杂行гu估益生菌在腸道中的存活能力和功能特性，但相比之下，體外篩選成本低、耗時短，可以同時測定多種菌株的特性，是獲取能在人類胃腸道中生存的益生菌的最常用途徑。

益生菌體外篩選的項目主要包括胃酸耐受性、膽鹽耐受性和腸道黏附定植能力。常將微生物加入模擬胃液和模擬腸液中，孵育一定時間，模擬胃腸道消化[69]，從而評估益生菌的胃腸道生存能力。益生菌膽鹽耐受性也可選用膽鹽水解酶（bile salt hydrolase，BSH）作為篩選的標準，能否分泌BSH是益生菌自身抵抗膽鹽的關(guān)鍵，因為BSH可以水解膽鹽，從而提高益生菌的膽鹽穩(wěn)定性[70]。而益生菌的黏附能力可通過使用烴類甲苯[71]等碳氫化合物進行細胞表面疏水性測試，從而探究細菌對胃腸道黏液的黏附性。

3.2 基因工程

可以采用基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學、代謝組學、功能基因組學等分析鑒定微生物的基因組結(jié)構(gòu)[72]，采用DNA-DNA雜交和編碼16S rRNA的DNA測序進行菌株鑒定[73]，從而確定菌株的基因序列，有助于后續(xù)采用基因工程構(gòu)建出適合于口服的益生菌。例如，雙歧桿菌PRL2010的基因組學、蛋白質(zhì)組學和轉(zhuǎn)錄組學分析結(jié)果顯示其基因組中含有能夠代謝黏蛋白和降解宿主黏蛋白中多糖的轉(zhuǎn)錄位點[74]，從而提升雙歧桿菌PRL2010自身的腸道定植和生存能力?；蚬こ桃呀?jīng)被應(yīng)用在口服的益生菌生產(chǎn)過程。Danino等[75]開發(fā)了一種用于口服遞送的基因工程大腸桿菌，改性后的大腸桿菌可以特異性定植腫瘤組織并表達β-半乳糖苷酶產(chǎn)生熒光，從而檢測腫瘤。Song Wenfang等[76]采用二苯并環(huán)辛炔，通過原位正交偶聯(lián)改性丁酸梭菌，體內(nèi)和體外實驗證明改性益生菌口服后可以在腸道中高效定植，并治療腸道炎癥。

3.3 益生菌遞送系統(tǒng)

將益生菌封裝到具有保護和靶向遞送作用的載體中[77]，能夠提高益生菌對外界和消化道內(nèi)極端環(huán)境的耐受性[10]。益生菌封裝的兩個關(guān)鍵因素是封裝壁材和封裝方法。

用于封裝益生菌的壁材對益生菌產(chǎn)品的穩(wěn)定性和功能性有很大影響[11]，許多食品大分子已被用于封裝益生菌，包括多糖（海藻酸鹽、果膠、殼聚糖等）、蛋白質(zhì)（乳清蛋白、酪蛋白等）和脂質(zhì)體等[78]。這些天然的食品大分子具有生物相容性好、生物可降解、成本低和安全等優(yōu)點[79]。在選擇封裝壁材的時候，還需要考慮壁材大分子對益生菌的互作性、能否在腸道中降解為具有促進益生菌生長作用的益生元、能否促進益生菌在腸道的黏附定植、是否會對人體健康產(chǎn)生促進作用。

益生菌的封裝方法應(yīng)足夠溫和，盡量減少對益生菌活性的破壞。常用的益生菌封裝方法包括噴霧干燥、冷凍干燥、乳化和擠出等[78]。其中，噴霧干燥是食品工業(yè)中最常用的益生菌封裝技術(shù)[80]。噴霧干燥可以同時進行霧化、加熱和真空干燥，快速形成干燥的粉末顆粒[81]，是一種高效經(jīng)濟的生產(chǎn)封裝益生菌產(chǎn)品的技術(shù)。冷凍干燥也是封裝益生菌的常用方法，相較于噴霧干燥，冷凍干燥過程中的加工溫度更低，對益生菌的破壞更小。Obradovic等[80]發(fā)現(xiàn)乳清溶液、乳清蛋白濃縮物和海藻酸鈉經(jīng)噴霧干燥制成的益生菌粉末顆粒形狀更加規(guī)則，而通過冷凍干燥制得的益生菌粉末具有更好的封裝效率、生物活性和貯藏穩(wěn)定性。此外，3D打印技術(shù)已經(jīng)被用于生產(chǎn)多種益生菌口服遞送載體[82]，打印出的載體具有良好的穩(wěn)定性。

目前用于實現(xiàn)益生菌腸道靶向輸送的口服遞送系統(tǒng)包括微膠囊、水凝膠、油凝膠、納米涂層、乳液、納米纖維、孢子、生物膜等[61]（圖2）。以下就每種類型進行具體敘述。

圖2 益生菌遞送系統(tǒng)Fig. 2 Probiotic delivery systems

3.3.1 微膠囊

微膠囊是由食品大分子通過噴霧干燥法制備的具有核殼結(jié)構(gòu)的保護載體，可以將益生菌和外界環(huán)境隔絕，實現(xiàn)益生菌的控制釋放[83]等。制備微膠囊的常用壁材包括海藻酸鹽、殼聚糖、明膠和果膠等[84]。幾乎所有的益生菌微膠囊化技術(shù)都包含干燥的過程，常采用噴霧干燥、冷凍干燥、電噴霧、乳化等方法制備益生菌微膠囊[85]。噴霧干燥是一種快速且相對便宜的制備微膠囊的方法，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可以通過形成二硫鍵增強蛋白質(zhì)機械強度，從而在噴霧干燥過程中保護益生菌免受高溫損傷[86]。乳清分離蛋白也可以在噴霧干燥過程中起到保護益生菌的作用，研究發(fā)現(xiàn)乳清分離蛋白可以與鼠李糖乳桿菌菌毛上的蛋白質(zhì)特異性結(jié)合，在菌體表面形成蛋白質(zhì)層，提高益生菌耐熱性和抗氧化性[87]。

3.3.2 水凝膠

水凝膠是由親水食品大分子通過物理或化學交聯(lián)而形成的具有吸水膨脹性的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，廣泛應(yīng)用于益生菌/功能因子遞送、藥物遞送、3D細胞培養(yǎng)支架和組織工程等領(lǐng)域。益生菌可以封裝在水凝膠微球的內(nèi)部或接種在微球表面[17]。海藻酸鹽是最常用的水凝膠封裝材料之一，它可以與Ca2＋結(jié)合，形成水凝膠交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[88]。通過海藻酸鹽、果膠和明膠的生物復合水凝膠封裝植物乳桿菌，可以顯著提高植物乳桿菌的胃酸耐受性，孵育6 h后，模擬胃液中的植物乳桿菌存活率比游離植物乳桿菌高26%，并且貯藏4 周后，包埋的益生菌具有更高的氧化穩(wěn)定性[89]。然而，傳統(tǒng)的合成水凝膠在被稀釋后機械強度會降低，表現(xiàn)出溶脹弱化的現(xiàn)象，不利于益生菌封裝系統(tǒng)的穩(wěn)定。Wu Feng等[90]開發(fā)了一種溶脹強化水凝膠，將脂質(zhì)體膜納米屏障共嵌入水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，溶脹過程中水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)拉伸，導致脂質(zhì)體膜納米屏障變形，封裝物質(zhì)跨膜擴散，形成新的網(wǎng)絡(luò)，這種雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)增強了機械強度。

微米尺度的水凝膠稱為微凝膠。用于制造微凝膠的材料通常是生物聚合物，例如淀粉、海藻酸鹽、角叉菜膠等[61]，它們是具有多孔聚合物分子網(wǎng)絡(luò)的生物聚合物顆粒，多數(shù)是全天然無毒材料，可以保護封裝的益生菌不受損傷[11]。益生菌（例如雙歧桿菌）需要在胃中穩(wěn)定，在腸道釋放，并且需要在腸黏液層定植才能發(fā)揮生理作用。腸黏液層是由富含半胱氨酸巰基的糖蛋白構(gòu)成的疏水凝膠網(wǎng)絡(luò)。為了同時解決益生菌時空釋放和黏附定植的問題，有研究人員使用半胱氨酸修飾氧化魔芋多糖，獲得了同時具有巰基和羧基的巰基化氧化魔芋多糖，和鐵離子可以形成二硫鍵—S—S—和—COO—Fe3＋—COO—共存的雙交聯(lián)水凝膠（圖3），該水凝膠在胃環(huán)境中穩(wěn)定，能夠保護益生菌不受胃酸脅迫，在腸pH值下響應(yīng)性釋放益生菌，釋放后益生菌表面纏結(jié)的巰基化魔芋多糖作為橋梁和富含巰基的黏蛋白發(fā)生巰基化交換反應(yīng)并生成新的二硫鍵，將益生菌牢固地黏附在黏液層上，有效提高了雙歧桿菌的腸道活菌數(shù)和菌群豐度，使益生元魔芋多糖和益生菌協(xié)同調(diào)控腸道菌群平衡，發(fā)揮益生作用[91]。

圖3 益生菌腸道黏附口服載體[91]Fig. 3 Mucoadhesive oral carriers for probiotics[91]

3.3.3 油凝膠

油凝膠是液態(tài)油通過添加凝膠劑，自組裝為網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)或液態(tài)油結(jié)晶，進而形成包含非極性液相的黏彈性三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)材料[92-93]。常用的凝膠劑有甘油單酯、卵磷脂、蠟等[94]。油凝膠具有疏水性和乳化性[95]，相較于水凝膠，其物理屏障可以更好地隔離水分[92]，提高益生菌存活率。例如，基于大豆卵磷脂的油凝膠可以提高嗜酸乳桿菌和乳酸雙歧桿菌的存活率[18]。此外，油凝膠只能被腸道中的脂肪酶消化，實現(xiàn)益生菌的腸道靶向遞送[95]。常采用油凝膠與水凝膠結(jié)合形成的雙凝膠，其同時具有親脂性和親水性雙重特性，可以進一步提高益生菌的存活率[96]。采用大豆卵磷脂-硬脂酸油凝膠乳液和乳清蛋白水凝膠混合包封嗜酸乳桿菌和乳雙歧桿菌，3 周和5 周后在酸奶中的活菌數(shù)明顯高于游離菌，并且與純油凝膠相比，混合凝膠中的乳清蛋白可以使乳雙歧桿菌的活菌數(shù)提高5.2（lg（CFU/mL））[97]。

3.3.4 納米涂層

納米涂層是一種包封單個益生菌的方法，由于其制備簡單的特點，已成為益生菌納米包封領(lǐng)域的焦點[31]?？梢酝ㄟ^氫鍵、π-π堆積、邁克爾加成反應(yīng)和席夫堿反應(yīng)形成聚多巴胺納米涂層，封裝單個活細胞，顯著提高益生菌的生物利用率（未封裝微生物的30 倍以上）[98]。例如有研究人員采用藥用蠶絲蛋白自組裝在大腸桿菌Nissle 1917（EcN）表面形成納米涂層[99]，通過體外實驗證明封裝后的EcN在模擬胃液中的存活率提高52 倍，腸道定植能力提高5.8 倍，同時藥用蠶絲蛋白天然的抗炎功能進一步提升了EcN的腸炎治療能力，起到協(xié)同治療的效果（圖4）。此外，層層組裝技術(shù)（layer-by-layer，LbL）是制備多層涂層材料的常用方法，已經(jīng)被應(yīng)用于益生菌遞送載體[100]。相關(guān)學者采用殼聚糖/藻酸鹽納米涂層包封凝結(jié)芽孢桿菌，顯著提高了益生菌對胃酸和膽鹽的耐受性以及對腸黏液黏附能力，黏附性比未封裝的益生菌高出1.5 倍[101]。

圖4 益生菌納米涂層[99]Fig. 4 Probiotic nanocoating[99]

3.3.5 乳液

目前用于封裝益生菌的乳液包括水包油（O/W）乳液[12]、油包水（W/O）乳液、水包水（W/W）乳液[69]和混合型（O/W/O或W/O/W）乳液[102-103]。采用乳液作為口服遞送系統(tǒng)操作簡單，適于大規(guī)模生產(chǎn)；對熱穩(wěn)定，可使益生菌產(chǎn)品保存較長時間[11]。納米乳液通常是透明的，因為乳液液滴非常小，不會強烈散射光波[12]，所以非常適用于生產(chǎn)透明的食品。其中，皮克林乳液的凝膠結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可以減少益生菌與胃腸道產(chǎn)物（胃酸、膽鹽等）的接觸，大大提高了益生菌在口服遞送中的穩(wěn)定性[82]。研究表明，在采用乳液封裝益生菌的過程中，益生菌可以在高負載力下封裝進含果膠的O/W高內(nèi)相皮克林乳液中，65 ℃、30 min后未封裝的乳雙歧桿菌幾乎全部死亡，而封裝的益生菌活菌數(shù)為5.31（lg（CFU/mL））[104]。

3.3.6 納米纖維

納米纖維具有高比表面積，易通過高壓均質(zhì)、酶水解、超聲處理等技術(shù)改性[105]，非常適于益生菌的口服遞送。高壓電場靜電紡絲技術(shù)生產(chǎn)效率高、生產(chǎn)條件溫和，可以快速獲得直徑小、比表面積大、透氣率高的纖維材料，適于封裝對溫度敏感的益生菌，是納米纖維封裝益生菌的常用方法[106]。研究表明，采用靜電紡絲技術(shù)制備的阿拉伯膠和普魯蘭多糖雜化納米纖維包封乳酸菌，具有較高封裝穩(wěn)定性，封裝后的乳酸桿菌存活率達到85.4%～97.8%，而冷凍干燥后的存活率為80.9%～89.8%，此外采用靜電紡絲技術(shù)制備的封裝乳酸菌具有更好的貯藏穩(wěn)定性，4 ℃貯藏28 d后，存活率仍在70%以上[107]。

3.3.7 孢子

孢子是細菌的休眠形式，具有多層疏水蛋白質(zhì)外殼[108]，可以保護細菌免受胃酸侵害，并且在腸道中發(fā)芽釋放[109]，非常適合于益生菌的口服遞送。孢子在益生菌遞送中的應(yīng)用分為兩種，一種是將益生菌轉(zhuǎn)化為孢子形式封裝，但天然孢子具有難以控制體內(nèi)發(fā)芽效率的缺點[65]，目前已經(jīng)開發(fā)出人工孢子：通過β-環(huán)糊精和金剛烷介導的主客體相互作用，將葡聚糖包裹在丁酸梭菌孢子外形成人工孢子，該人工孢子在厭氧的腸道環(huán)境中會復活，分解葡聚糖并特異性地富集在腫瘤組織周圍，產(chǎn)生抗癌短鏈脂肪酸，抑制腫瘤生長[110]。另一種是提取孢子殼中的有效成分并用其封裝益生菌，孢子殼納米材料具有極強的極端環(huán)境（強酸、強堿、模擬胃腸液）耐受性，并且可以降低腸道ROS水平，極大程度抵抗惡劣環(huán)境，保護益生菌（圖5）[111]。

圖5 孢子殼納米材料封裝益生菌[111]Fig. 5 Spore coat nanomaterial encapsulation of probiotics[111]

3.3.8 生物膜

生物膜可以提高益生菌的附著能力，隔絕抗生素等外界環(huán)境的侵擾[112]。通過枯草芽孢桿菌分泌的胞外多糖和蛋白質(zhì)形成固體生物膜封裝枯草芽孢桿菌，可顯著提高枯草芽孢桿菌的胃腸道耐受性（模擬胃液中孵育0.5 h，存活率仍在70%以上，而未封裝的益生菌完全死亡；在膽汁酸中孵育1 h后存活率約為未封裝的20 倍）、生物利用度（是未封裝益生菌的125 倍）和腸道定植能力（是未封裝益生菌的17 倍）[112]。研究報道在磷酸鈣緩沖溶液中通過二油酰磷脂酸和膽固醇制備脂質(zhì)膜封裝EcN[113]，封裝后的EcN顯示出極高的強酸、強堿、模擬胃腸液、抗生素和乙醇抗性，胃部存活率比未包封的EcN高出近3 倍。

4 益生菌遞送系統(tǒng)在食品中的應(yīng)用

商業(yè)化益生菌遞送系統(tǒng)通常采用乳清蛋白、海藻酸鈉和低聚果糖等益生元壁材，通過噴霧干燥和冷凍干燥等工藝提高益生菌活菌數(shù)，目前已在乳制品、益生菌補充劑、益生菌堅果或水果[103]中實現(xiàn)了應(yīng)用。常見的益生菌產(chǎn)品如表3所示。

表3 常見的益生菌產(chǎn)品Table 3 Common probiotic products

4.1 乳制品

傳統(tǒng)的益生菌產(chǎn)品是乳制品，包括酸奶、干酪、乳清基飲料等，目前出現(xiàn)了越來越多采用微膠囊化益生菌生產(chǎn)乳制品的例子。沙棘漿果具有較高的營養(yǎng)價值和抗氧化活性，可以作為益生菌產(chǎn)品的增強底物，Terpou等[114]開發(fā)了一種用于強化功能性冷凍酸奶的干酪乳桿菌微膠囊，以乳清為封裝材料，將沙棘漿果與干酪乳桿菌共封裝，采用干酪乳桿菌微膠囊生產(chǎn)的冷凍酸奶在－18 ℃下貯藏90 d仍能保持較高活性（益生菌存活率超過97%），并通過體外實驗證明微膠囊化的干酪乳桿菌在人體胃腸道內(nèi)具有更好的生存能力。

4.2 益生菌補充劑

目前，市場上最常見的益生菌產(chǎn)品是益生菌補充劑[126]，大多采用干燥技術(shù)制成粉末狀益生菌口服遞送產(chǎn)品。Sornsenee等[49]采用脫脂牛奶中的乳清蛋白和香蕉粉封裝副干酪乳桿菌，開發(fā)了一款具有較高的益生菌存活率和膽鹽耐受性的香蕉粉固體飲料。另外，采用多層包埋技術(shù)可以進一步提高益生菌的穩(wěn)定性，貝斯迪、希爾安等品牌采用全脂乳粉、低聚果糖等多種益生元多層包埋復合益生菌，增強了復合益生菌的胃酸和膽鹽耐受性，提高了益生菌的活性和定植能力。此外，益生菌滴劑也是較為常見的益生菌補充劑。常采用葵花籽油、甘油三酯等液態(tài)油脂制成油膜用于封裝益生菌，制成的益生菌滴劑可以隔絕水和空氣，使益生菌具有更好的氧化穩(wěn)定性。例如，拜奧（BioGaia公司旗下品牌）將羅伊氏乳桿菌凍干粉添加進葵花籽油中，制成益生菌滴劑，可以有效隔絕空氣和水分，確保益生菌活性。

4.3 其他

益生菌堅果和益生菌水果是添加了封裝益生菌的產(chǎn)品，它們是由益生菌補充劑進一步加工而成的食品。通常先采用麥芽糊精、酪蛋白酸鈉、乳粉、低聚果糖等封裝益生菌，再用活性益生菌粉包裹堅果、水果等制成益生菌堅果和水果，提高堅果和水果的營養(yǎng)附加值。采用益生菌微膠囊粉末涂裹的鮮果通常具有更好的保鮮特性，短時間內(nèi)可以減少水分損失、色度變化和腐敗菌數(shù)量[124]。益生菌微膠囊涂層還可以在制備果干的過程中保護水果的品質(zhì)（色澤、感官）和營養(yǎng)成分（花青素、VC）[125]，進一步提高水果制品的營養(yǎng)和品質(zhì)。

5 結(jié) 語

本綜述總結(jié)了益生菌口服遞送過程中的困難與挑戰(zhàn)，分析比較了不同益生菌口服遞送系統(tǒng)的特點和研究進展，有助于推動未來益生菌口服遞送系統(tǒng)的進一步開發(fā)和應(yīng)用。益生菌具有免疫調(diào)節(jié)、改善胃腸道健康、降低膽固醇等功效，但胃酸、膽鹽、消化酶等的脅迫作用使其難以大量活著到達腸道并定植。益生菌遞送系統(tǒng)在提高益生菌耐加工貯藏穩(wěn)定性和體內(nèi)存活率方面展現(xiàn)出優(yōu)異的應(yīng)用潛力。目前報道的常見益生菌遞送系統(tǒng)包括微膠囊、水凝膠、油凝膠、納米涂層、乳液、納米纖維、孢子、生物膜等，均已證明能夠有效提高益生菌的體外和體內(nèi)存活率。其中一些遞送系統(tǒng)已經(jīng)在乳制品、益生菌補充劑、益生菌堅果等食品中應(yīng)用。雖然已經(jīng)開發(fā)了多種益生菌封裝材料、封裝菌種、封裝方法和產(chǎn)品，但是益生菌口服遞送系統(tǒng)仍然面臨著許多挑戰(zhàn)：1）成本和產(chǎn)業(yè)化路徑：多數(shù)益生菌口服遞送系統(tǒng)的成本高和產(chǎn)業(yè)化路徑不明確等限制了其應(yīng)用；2）顆粒大?。盒枰刂七f送系統(tǒng)的顆粒大小，使其在提高存活率的同時不影響產(chǎn)品穩(wěn)定性和感官品質(zhì)；3）智能化：未來需要采用智能化封裝技術(shù)，使益生菌能夠靶向腸道遞送，提高腸道定植能力，精準作用于人體；4）共封裝：需要探究更多種類益生元、益生菌與合生元的共封裝，進一步提高益生菌的存活率和功能特性；5）人群實驗：現(xiàn)階段多數(shù)益生菌口服遞送系統(tǒng)的研究仍然停留在體外實驗和動物實驗階段，人體內(nèi)的微環(huán)境是動態(tài)變化的，體外實驗無法準確預測益生菌菌株在體內(nèi)的潛在用途和功能，需要進行更多的人群實驗來驗證遞送載體的實際效果?？傮w而言，益生菌遞送系統(tǒng)是一項提高益生菌存活率和健康效應(yīng)的極具潛力的關(guān)鍵技術(shù)，值得學術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界的進一步研究、完善，并共同提高高活性益生菌制劑和產(chǎn)品的國際市場競爭力。