向長港 童勝蘭 徐曙玲 高媚媚 孫 曼 劉本德

湖北省武漢市江夏區(qū)第一人民醫(yī)院 430200

結(jié)核病為結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染導致的一類疾病,有著較高的致死率,通常多出現(xiàn)在肺部,也能出現(xiàn)在其他的器官或者組織,例如骨結(jié)核以及腦結(jié)核等[1]。我國屬于結(jié)核病感染較為嚴重的國家,掌握疾病傳播規(guī)律是開展結(jié)核病防控工作的關(guān)鍵[2]。因此,對當?shù)亻_展結(jié)核病傳染流行病學分析,掌握近期傳播率意義重大。另一方面伴隨臨床上抗結(jié)核藥物廣泛以及不合理應(yīng)用,使得MTB產(chǎn)生耐藥性,其危害會嚴重威脅人們的健康以及生命安全[3]。雖人們已對耐藥結(jié)核進行了較多研究,包含耐藥結(jié)核病診斷、結(jié)核分枝桿菌耐藥機制和耐藥結(jié)核病防治等方面,但目前臨床依舊無治愈疾病的有效方法。精準醫(yī)療是一類將個人基因、環(huán)境和生活習慣差異等考慮在內(nèi)的疾病預防和處置的新方法,是當下疾病醫(yī)學治療的前沿探索。近些年來,伴隨高通量測序有關(guān)技術(shù)迅速發(fā)展及測序成本驟減,全基因組測序逐漸被使用到各類疾病致病機制和藥物治療等方面[4]?；诖?采取基因組測序測定MTB開展分子流行病學研究,和患者具體信息結(jié)合監(jiān)測當?shù)氐慕Y(jié)核病近期傳播情況,對分析結(jié)核病疫情、擬定有效干預措施以控制疾病流行有著重要意義。本文現(xiàn)對2020年1—12月本地區(qū)98例結(jié)核病患者的98株MTB和2021年1—12月本地區(qū)100例結(jié)核病患者的100株MTB進行研究,分析精準醫(yī)療下基于MTB基因分型的結(jié)核病傳染情況,具體內(nèi)容如下。

*基金項目:湖北省衛(wèi)生健康委員會科研項目(WJ2021M042)。通信作者:劉本德

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2020年1—12月本地區(qū)98例結(jié)核病患者的98株MTB和2021年1—12月本地區(qū)100例結(jié)核病患者的100株MTB進行研究,鑒定結(jié)果均是MTB,并選擇標準菌株H37Rv當作對照,由中國疾病預防控制中心國家結(jié)核病參比實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑:結(jié)核分枝桿菌藥敏和菌種鑒定培養(yǎng)基為珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供;2倍PCR預混液、D2000 DNA marker以及瓊脂糖由北京永興生科科技有限公司提供,引物是北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 菌株培養(yǎng):將每100ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)加入1ml配制稀釋過的抗結(jié)核藥物,充分混勻,無菌分裝成為7ml/管,在85℃環(huán)境內(nèi)進行50min凝固處理,對制作而成培養(yǎng)基37℃開展無菌試驗之后放到4℃環(huán)境下避光保存,有效期是1個月。

1.2.3 藥敏試驗:采取比例法,嚴格依據(jù)有關(guān)標準程序開展操作,所用的藥物主要包含異煙肼、利福平、鏈霉素、吡嗪酰胺、乙胺丁醇等,終濃度依次是0.2μg/L、40.0μg/L、2.0μg/L、30.0μg/L、4.0μg/L。當耐藥百分比不低于1%時,說明受試菌對于該藥存在耐藥現(xiàn)象;相反,則代表受試菌對于該藥敏感。

1.2.4 MTB有關(guān)DNA提取:刮取培養(yǎng)基斜面中生長較好的結(jié)核分枝桿菌1標準環(huán),在400μl的TE緩沖液(酸堿度值為8.3)內(nèi)懸菌,在85℃環(huán)境下開展30min滅活處理,在100℃環(huán)境下進行10min煮沸,以12 000r/min速度進行10min離心處理,后選擇上清液為DNA模板,放到-20℃的環(huán)境內(nèi)保存待測。

1.2.5 全基因組測序方法:由北京諾禾致源生物科技股份有限公司進行檢測,選擇高通量的二代Illumina測序平臺,開展DNA片段有關(guān)文庫構(gòu)建,予以雙端測序,PE150,深度≥200×,各樣品的總測序深度有關(guān)數(shù)據(jù)量不低于1G Clean Data。測序的原始數(shù)據(jù)分別是Scythe、Sickle兩個軟件開展濾過,低質(zhì)量堿基(即質(zhì)量不超過38)、N堿基比例超過10bp、和Adapter之間overlap超出15bp與可能源自宿主reads,獲得的Clean Data被應(yīng)用到后續(xù)分析中。將H37Rv菌株有關(guān)全基因組序列當作參考模板,采取BioEdit軟件開展對比獲取單株菌株單核苷酸多態(tài)性(SNP)。后將SNP數(shù)據(jù)和已經(jīng)報道的MTB耐藥基因突變數(shù)據(jù)庫開展比較,得到每株菌株對于一線類抗結(jié)核藥物耐藥突變基因類型。菌株分型是每株菌株SNP和H37Rv開展比較,得到每株菌株基因型。

1.2.6 治療方法:2020年患者采取常規(guī)治療措施,即2HRZE/4HR化療方案,異煙肼片(上海信誼藥廠有限公司,100mg×100片,國藥準字H31020495)0.3g/d;利福平膠囊(上海衡山藥業(yè)有限公司,0.15g×100片,國藥準字H31021101)0.45g/d;吡嗪酰胺片(上海信宜藥廠有限公司,0.25g×100片,國藥準字H31020800)1.5g/d;鹽酸乙胺丁醇片(廣東臺城制藥股份有限公司,0.25g×100片,國藥準字H44023635)0.75g/d。以上4類藥物口服2個月,后繼續(xù)口服4個月的異煙肼片和利福平膠囊。2021年患者采取精準治療方案,即結(jié)合患者的MTB藥敏試驗、基因測序分型情況,并和其年齡、性別、居住地及日常作息等方面予以個體化治療,并與臨床醫(yī)師直接溝通,對患者信息進行持續(xù)追蹤,合理調(diào)整治療方案。

1.3 觀察指標 比較2年內(nèi)MTB耐藥率、成簇率以及近期傳播率變化,并統(tǒng)計MTB耐藥基因分布情況。耐藥率=耐藥數(shù)/總數(shù)×100%;結(jié)合基因型是否相同評定菌株為成簇或者獨立,其中完全相同VNTR基因型菌株不低于2個為成簇[5];近期傳播率按照(nc-c)/n的公式計算,其中nc為成簇菌株,c是菌株成簇數(shù),n是所有菌株樣本[6]。此外,比較2年內(nèi)患者的療效差異,包含治愈率和再傳染率兩項指標,將治療后患者連續(xù)3次痰涂片轉(zhuǎn)陰評定成治愈,治愈率=治愈數(shù)/總數(shù)×100%;再傳染率=未治愈人數(shù)/總數(shù)×100%[7]。

2 結(jié)果

2.1 2年內(nèi)MTB耐藥率變化情況相比 和2020年相比,2021年MTB耐藥率和耐多藥率有一定升高(P<0.05),見表1。

表1 2年內(nèi)MTB耐藥率變化情況比較

2.2 2年內(nèi)MTB成簇率以及近期傳播率變化比較 和2020年相比,2021年MTB成簇率和近期傳播率有一定升高(P<0.05),見表2。

表2 2年內(nèi)MTB成簇率以及近期傳播率變化比較

2.3 198株MTB耐藥基因分布情況 對幾類藥物耐藥基因的分布情況開展統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn),占比最高的基因是katG基因,

為17.68%;其次是rpoB基因,為13.13%。幾類藥物中吡嗪酰胺耐藥基因占比總體處在較低水平,見表3。

表3 198株MTB耐藥基因分布情況

2.4 2年內(nèi)療效比較 2021年患者的治愈率高于2020年患者,再傳染率低于2020年患者(P<0.05),見表4。

表4 2年內(nèi)療效比較[n(%)]

3 討論

肺結(jié)核屬于一類常見呼吸道傳染病,是MTB感染所致,當前已經(jīng)成為備受關(guān)注的一個重要公共衛(wèi)生問題。據(jù)有關(guān)資料顯示[8],全球范圍內(nèi)每日有約5 000人因結(jié)核病而死亡,在以往200年中共有10億人因結(jié)核病死亡。MTB基因分型屬于一類分子流行病學有關(guān)研究方法,其將基因分型技術(shù)和流行病學資料結(jié)合,對來源不同的MTB開展基因特性對比,以揭示結(jié)核病流行和傳播規(guī)律,是結(jié)核病監(jiān)測中的有效措施。同時這項技術(shù)從分子水平方面對傳染源追蹤與溯源、劃分外源性感染和內(nèi)源性復燃等具備重要價值,當前已被廣泛使用到流行病學中[9]。本次研究發(fā)現(xiàn):對198株MTB耐藥基因突變情況開展檢測,得出占比最高的基因是katG基因,為17.68%;其次是rpoB基因,為13.13%;幾類藥物中吡嗪酰胺耐藥基因占比總體處在較低水平。該結(jié)果一定程度反映出本地區(qū)的吡嗪酰胺耐藥水平,提示一線抗結(jié)核藥吡嗪酰胺于本地區(qū)依舊具備較高應(yīng)用價值。

和2020年相比,2021年MTB耐藥率、耐多藥率以及MTB成簇率、近期傳播率有一定升高(P<0.05),說明本地區(qū)的結(jié)核病耐藥現(xiàn)象正不斷加重,疾病的防控形勢依然較為嚴峻?？紤]原因可能是近年來部分結(jié)核病患者于綜合醫(yī)院內(nèi)接受治療,無法確保完成全程治療,而不規(guī)則的抗結(jié)核治療屬于生成耐藥菌的主要因素;患者治療期間的依從性不佳,癥狀略微改善就盡早停止用藥,也會引起結(jié)核菌耐藥現(xiàn)象,導致病情進一步傳播[10-12]。因此,需要提高對結(jié)核病患者治療工作的重視程度。精準醫(yī)療理念的提出使得結(jié)核病防治進入了精準醫(yī)學時代,對提升結(jié)核病治療水平、阻斷疾病在人群內(nèi)的傳播有著重要意義[13]。本文研究顯示:2021年患者的治愈率高于2020年患者,再傳染率低于2020年患者(P<0.05),說明對結(jié)核病患者開展精準治療能提升其治愈率,降低疾病再傳染率。分析原因是精準治療和患者的實際情況更符合,能使各項治療措施的效果最優(yōu)化,進而提升對疾病的防治效果。

總而言之,MTB耐藥率、成簇率以及近期傳播率近年來呈現(xiàn)升高趨勢,且吡嗪酰胺的耐藥基因占比相對較低,臨床需提高對結(jié)核病傳播以及治療工作的重視程度,結(jié)合患者具體情況開展精準醫(yī)療,以提升患者療效,控制疾病傳播。但本文依舊有不足之處,如納入的樣本數(shù)量不多,樣本全部源自同一家醫(yī)院,且未對患者的遠期隨訪結(jié)果進行統(tǒng)計,得到的結(jié)果有局限性,這些均需在日后加以完善,獲得更為全面的結(jié)果,更好地指導臨床實踐。