畢靜瑩，盧麗娟*

（1.寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生命科技學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

臍橙（Citrus sinensisOsb.），蕓香科柑橘屬，因其富含維生素、黃酮類化合物、檸檬苦素類似物和類胡蘿卜素等生物活性物質(zhì)，具有分解脂肪、清火養(yǎng)顏、減少有色金屬和放射性元素在人體內(nèi)積累、防癌抗癌等功效而備受大眾青睞。近幾十年來(lái)，我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展穩(wěn)步增長(zhǎng)，柑橘產(chǎn)量呈明顯上升趨勢(shì)，已從2017年的3 816.78萬(wàn)t增長(zhǎng)到2021年的5 595.61萬(wàn)t，產(chǎn)量穩(wěn)居世界第一[1]。同時(shí)，隨著人民美好生活需要日益廣泛，健康的生活方式引導(dǎo)酒類生產(chǎn)由糧食酒向果酒發(fā)生轉(zhuǎn)型[2]。柑橘酒的研發(fā)和生產(chǎn)，順應(yīng)了新形勢(shì)，增加了柑橘的附加值，也解決了季節(jié)性過(guò)剩和不易儲(chǔ)存等產(chǎn)業(yè)問(wèn)題。

目前的柑橘酒生產(chǎn)企業(yè)，多選擇葡萄酒活性干酵母進(jìn)行柑橘酒的釀制，雖然工藝可控、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，但是所釀柑橘酒同質(zhì)化嚴(yán)重，且無(wú)法展示原料帶給酒體特有的理化特性、風(fēng)味和口感，以至于喪失其在果酒市場(chǎng)上本應(yīng)具有的優(yōu)勢(shì)和競(jìng)爭(zhēng)力。因此，適宜于柑橘果酒本土釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的篩選工作，就顯得尤為重要。羅佳麗等[3]以甜橙果皮和甜橙果園土壤為分離源，共分離得到138株酵母菌，其中酵母菌S017和F076適合釀造甜橙果酒，經(jīng)鑒定均為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）；劉瑞等[4]從柑橘園土壤、柑橘果皮和自然發(fā)酵的柑橘汁中分離到160株酵母菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)方法將其歸為10個(gè)酵母菌種；熊元林等[5]從橙汁發(fā)酵醪液中分離出4株酵母菌，鑒定為酵母屬的綺麗酵母，是適合作為橙汁低純果酒的釀造酵母；游見(jiàn)明[6]從腐爛桔子中分離得到35株釀酒酵母，其中3株發(fā)酵性能較優(yōu)良，F(xiàn)16菌株可作為桔子酒發(fā)酵用菌種或桔子酒專用菌種選育的出發(fā)菌株；陳清嬋等[7]從橘子果肉中分離篩選出4株酵母菌，均具有典型圓形酵母屬特征，其中菌株JZ-1所釀橘子酒具有較好橘子果酒的典型性。以上分離純化所得柑橘酒釀酒酵母，主要以發(fā)酵力及所釀橘子酒香氣、色澤、風(fēng)味等感官指標(biāo)及維生素C（vitamin C，VC）含量、產(chǎn)酒精能力、降糖是否徹底等指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[7]。

本研究以四川渠縣柑橘園土壤、果樹(shù)枝葉和果實(shí)外果皮為分離源，通過(guò)富集培養(yǎng)、純化、分子生物學(xué)鑒定、耐受性及釀酒性能等試驗(yàn)篩選出適宜釀造臍橙果酒的本土專屬釀酒酵母，以期為臍橙果酒綜合品質(zhì)的提升提供應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

釀造原料臍橙：2020年12月底采自四川渠縣柑橘園（可溶性固形物含量11.76%，總糖（以葡萄糖計(jì)）59.12 g/L，總酸（以檸檬酸計(jì)）7.29 g/L，pH 3.66，出汁率48.72%）。

果園土壤（S）、果樹(shù)枝葉（T）和臍橙果實(shí)外果皮（F）：來(lái)自四川渠縣柑橘園；商業(yè)釀酒酵母BV818：安琪酵母股份有限公司；釀酒酵母F5：法國(guó)LAFFORT公司。

1.1.2 試劑

100.00 mg/L氯霉素：生工生物工程（上海）股份有限公司；瓊脂（生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；WLN營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：海博生物技術(shù)有限公司；Biggy Agar培養(yǎng)基：上海冠導(dǎo)生物工程有限公司；富集培養(yǎng)基：YEPD液體培養(yǎng)基+100.00 mg/L氯霉素；鑒定培養(yǎng)基：WLN營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基+100.00 mg/L氯霉素。

2,3,5-氯化三苯四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chlo ride，TTC）培養(yǎng)基[8]：由上層培養(yǎng)基與下層培養(yǎng)基組成。其中TTC上層培養(yǎng)基：TTC 0.5 g/L、葡萄糖5 g/L、瓊脂15 g/L、現(xiàn)配現(xiàn)用；TTC下層培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L、蛋白胨2 g/L、酵母膏1.5 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L、硫酸鎂0.4 g/L、檸檬酸0.3 g/L、瓊脂30 g/L。

產(chǎn)酯固體培養(yǎng)基[9]：溴甲酚紫0.04 g/L，三丁酸甘油脂15 mL/L，酵母浸粉10.00 g/L，蛋白胨20.00 g/L，葡萄糖20.00 g/L，瓊脂20.00 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基（模擬柑橘汁）[10]：蔗糖5.20 g/100 mL、葡萄糖2.15 g/100 mL、果糖2.50 g/100 mL、檸檬酸0.75 g/100 mL、蘋(píng)果酸0.25 g/100 mL，使用6 mol/L食品級(jí)NaOH將pH調(diào)節(jié)至3.90。

以上培養(yǎng)基均在121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

HVE-50高壓蒸汽滅菌鍋：日本HIRAYAMA公司；SWCJ-IF型潔凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DH6000B電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；HT-211B型培養(yǎng)搖床：上海赫田科學(xué)儀器有限公司；Mulstiskan GO酶標(biāo)儀：美國(guó)Thermo Electron公司；UVmini-1280紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；WD-9402B/D非醫(yī)用基因擴(kuò)增儀：北京六一生物科技有限公司；Gel Doc XR+凝膠成像儀、Sub-Cell GT電泳儀：美國(guó)Bio-Rad公司；TRACE DSQ氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯(lián)用儀：美國(guó)Thermo Finnigan公司；DB-Wax色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）：美國(guó)J&W pharmlab公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌的分離、純化和WLN鑒定

分別稱取5.00 g果園土壤、果樹(shù)枝葉和臍橙果實(shí)外果皮，裝有100 mL富集培養(yǎng)基的錐形瓶中，28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)24～48 h。分別取富集后的母液1.0 mL，用無(wú)菌水按10倍梯度稀釋至10-8。選擇適當(dāng)梯度樣液，均勻涂布于鑒定培養(yǎng)基平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)5 d。分別挑選不同形態(tài)單菌落，通過(guò)劃線稀釋法在鑒定培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，于28 ℃倒置培養(yǎng)10 d。根據(jù)WLN平板上酵母菌落特征（菌落的顏色和形態(tài)，表面及邊緣特征），對(duì)各菌落進(jìn)行WLN培養(yǎng)類型分類。

1.3.2 酵母菌的分子生物學(xué)鑒定與分型

釀酒酵母菌株基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的提取及檢測(cè)：采用楊慧敏等[11]的方法提取DNA，微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度和濃度。

26S核糖體核糖核酸（ribosomal ribonucleic acid，rRNA）基因D1/D2區(qū)測(cè)序鑒定：WLN培養(yǎng)類型為釀酒酵母的52株菌中，隨機(jī)選取20株。使用通用引物NL1（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAAG-3'）和NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）對(duì)其進(jìn)行26S rRNA D1/D2區(qū)基因序列擴(kuò)增，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物送往上海生工技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）搜索比對(duì)。

Interdelta分型：經(jīng)26S rRNA基因D1/D2區(qū)測(cè)序鑒定的20株釀酒酵母菌種進(jìn)行Interdelta 指紋圖譜分析，使用引物delta12（5'-TCAACAATGGAATCCCAAC-3'）和delta21（5'-CATCTTAACACCGTATATGA-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)所得電泳圖進(jìn)行對(duì)比，找出相同的分型進(jìn)行匯總[12-13]。

1.3.3 釀酒酵母菌株釀造學(xué)特性的測(cè)定

（1）釀酒酵母菌株發(fā)酵力的測(cè)定

將1.3.2所得釀酒酵母菌株接入放有倒置杜氏管的YEPD液體培養(yǎng)基試管中，28 ℃培養(yǎng)，每隔12 h觀察其產(chǎn)氣情況，記錄杜氏管內(nèi)氣體體積[14]。

（2）釀酒酵母菌株凝聚性測(cè)定

對(duì)1.3.2所得釀酒酵母菌株，采用本斯值測(cè)定其凝聚性[15]，該值大于2 mL為凝聚性強(qiáng)，小于0.5 mL為凝聚性弱。凝聚性是果酒酵母篩選的一項(xiàng)重要指標(biāo)，強(qiáng)凝聚性酵母不僅有利于生產(chǎn)工藝的優(yōu)化，而且有利于改善果酒風(fēng)味。

（3）釀酒酵母菌株耐受性的測(cè)定

對(duì)以上實(shí)驗(yàn)所得起酵速度快，產(chǎn)氣量大、強(qiáng)凝聚性的酵母菌株，進(jìn)行耐乙醇、耐SO2和高糖耐受性能試驗(yàn)。將YEPD液體培養(yǎng)基分裝于試管中，再放入倒置、管內(nèi)不含空氣的杜氏管。121 ℃滅菌20 min，冷卻至室溫（25 ℃），按照（a～c）條件分別調(diào)整培養(yǎng)基。

（a）不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（10%、12%、14%、16%、18%）；（b）不同SO2質(zhì)量濃度（60mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、300 mg/L）；（c）不同糖含量（20%、30%、40%、50%、60%）。（a）和（b）先121 ℃滅菌20 min后調(diào)整，（c）先調(diào)整后滅菌。待測(cè)釀酒酵母菌株接種2%，每個(gè)處理平行3次，28 ℃培養(yǎng)1～3 d，觀察產(chǎn)氣狀況，以判斷耐受性。

（4）釀酒酵母菌株產(chǎn)乙醇能力的測(cè)定

通過(guò)TTC顯色法，將篩選所得酵母菌株劃線接種到TTC下層培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)1～3 d后，在菌落上覆蓋一層TTC上層培養(yǎng)基，28 ℃遮光培養(yǎng)。菌落呈現(xiàn)的顏色越深，表明菌株產(chǎn)酒精能力越強(qiáng)[8]。

（5）釀酒酵母菌株產(chǎn)H2S能力的測(cè)定

采用Biggy Agar培養(yǎng)基顯色法，將高產(chǎn)酒精酵母菌株點(diǎn)種到Biggy Agar培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)1～3 d，菌株菌落顏色越深，代表菌株產(chǎn)H2S的量越多[16]。

（6）釀酒酵母菌株產(chǎn)酯能力的測(cè)定

采用產(chǎn)酯培養(yǎng)基顯色法，將低產(chǎn)H2S的酵母菌株劃線接種到產(chǎn)酯培養(yǎng)基上，菌落黃色越濃，表明菌株的產(chǎn)酯量越多[17]。

1.3.4 優(yōu)良釀酒酵母菌株釀造臍橙果酒及感官評(píng)價(jià)

將1.3.3篩選所得酵母菌株分別接種到Y(jié)EPD液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、100 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)24 h后，以107CFU/mL的接種量接入含有4 L臍橙果汁的5 L廣口瓶中[18]，參照畢靜瑩等[19]的方法進(jìn)行臍橙果酒的釀造。以商業(yè)菌株BV818和F5及空白試驗(yàn)作為對(duì)照，對(duì)臍橙果酒的理化指標(biāo)、揮發(fā)性香氣成分及感官品質(zhì)進(jìn)行分析。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2016、SPSS Statistics 24.0軟件對(duì)理化參數(shù)、揮發(fā)性化合物等進(jìn)行分析，釀酒酵母進(jìn)化樹(shù)利用MEGA11（11.0.13）分析繪制，揮發(fā)性物質(zhì)熱圖使用邁維代謝云平臺(tái)（https：//cloud.metware.cn）進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的WLN培養(yǎng)鑒定

本研究共分離純化得到90株酵母菌株，將其在WLN培養(yǎng)基培養(yǎng)后，根據(jù)菌落形態(tài)初步將菌株分成8個(gè)WLN培養(yǎng)類型。根據(jù)PALLMANN C L等[20]的描述及其他研究者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[21-23]，用CT表示不同類型的菌株，判定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 酵母菌在WLN培養(yǎng)基上的形態(tài)分型結(jié)果Table 1 Morphological typing results of yeasts on WLN nutrient medium

由表1可知，初步鑒別CT1和CT2可能為釀酒酵母屬（Saccharomyces），占總數(shù)的57.78%；CT3、CT4和CT5可能為有孢漢遜屬酵母屬（Hanseniaspora），占總數(shù)的32.22%；CT6、CT7可能為隱球酵母屬（Cryptococcus），占總數(shù)的3.33%；CT8可能為畢赤酵母屬（Pichia），占總數(shù)的6.67%。

2.2 酵母分子生物學(xué)鑒定與釀酒酵母基因分型

將鑒定為釀酒酵母的菌株進(jìn)行Interdelta指紋圖譜分型，共獲得3種不同的電泳圖譜，即該20株菌株分屬于3種基因型，代表菌株的電泳圖譜結(jié)果見(jiàn)圖1。從WLN培養(yǎng)菌株類型CT1和CT2組中，將初步鑒定為釀酒酵母的菌株隨機(jī)挑選20株進(jìn)行26S rRNA分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，20株菌株均為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

圖1 四川渠縣本土野生釀酒酵母Interdelta分析結(jié)果Fig.1 Interdelta analysis results of native wild Saccharomyces cerevisiae in Quxian county, Sichuan province

圖2 基于26S rRNA基因序列四川渠縣本土野生菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of native wild strains from Quxian county,Sichuan province based on 26S rRNA gene sequences

2.3 釀酒酵母菌株的發(fā)酵力

通常認(rèn)為基因型一樣的菌株，其釀造學(xué)特性基本一致，因此只需要從不同基因型菌株中，隨機(jī)挑取2～4個(gè)菌株開(kāi)展后續(xù)試驗(yàn)[11]；隨后，從3個(gè)不同基因型中隨機(jī)挑選4個(gè)菌株，共計(jì)12個(gè)菌株，進(jìn)行菌株釀造學(xué)評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 代表釀酒酵母菌株的發(fā)酵力Table 2 Fermentation power of representative Saccharomyces cerevisiae strains

由表2可知，菌株S02、S15、S26、T11、F12、F25和F38凝聚性能最好；菌株S02、S15、S26、T11、F12、F25和F38產(chǎn)氣最早，在培養(yǎng)4 h即開(kāi)始產(chǎn)氣；菌株S02、S13、S15、S26、T11、F25和F38的發(fā)酵高峰持續(xù)時(shí)間最久，達(dá)72 h左右；菌株S02、S15、S26、T11、F25和F38發(fā)酵最為迅速，杜氏小管滿氣時(shí)間為16 h。綜合以上結(jié)果，選取菌株S02、S15、S26、T11、F25和F38進(jìn)行后續(xù)耐受性測(cè)試。

2.4 釀酒酵母菌株的耐受性

2.4.1 乙醇耐受性

釀酒酵母菌對(duì)乙醇耐受力的強(qiáng)弱，可以充分判斷果酒釀造過(guò)程中酒精發(fā)酵是否徹底。以商業(yè)釀酒酵母BV818作為對(duì)照菌株，對(duì)2.3篩選獲得的6株釀酒酵母菌株的乙醇耐受性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 篩選菌株乙醇耐受性測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of ethanol-tolerance of screened strains

由表3可知，7株酵母菌均能在乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%和12%的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)、產(chǎn)氣；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為14%時(shí)，所有菌株發(fā)酵產(chǎn)氣均明顯減弱，菌株S26和F38尤其明顯；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為16%時(shí)，僅菌株S02、S15、T11、F25和BV818還有輕微發(fā)酵及少量產(chǎn)氣；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增加到18%時(shí)，僅菌株S02、T11和BV818在超過(guò)48 h后才有少量產(chǎn)氣外，其余菌株均停止發(fā)酵產(chǎn)氣，菌體濃度急劇減少基本未檢測(cè)到?？梢?jiàn)，野生釀酒酵母乙醇耐受性較低，與吳啟鳳等[24]研究結(jié)果相一致。若要釀造酒精度較高的臍橙果酒，還需對(duì)分離得到的野生酵母菌株做進(jìn)一步馴化和培育。

2.4.2 SO2耐受性

果酒釀造過(guò)程中，一定量的SO2能夠起到殺菌、抗氧化和增加酸度等作用，因此優(yōu)良釀酒酵母需要具有較高的耐受SO2能力。選取具有較強(qiáng)乙醇耐受性的菌株S02、S15、T11、F25和BV818進(jìn)行SO2耐受性測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，菌株S15、T11、F25和BV818對(duì)SO2均有較高的耐受性，在SO2含量為300 mg/L的培養(yǎng)基中，仍能保持微弱發(fā)酵和生長(zhǎng)，而菌株S02對(duì)SO2非常敏感，在SO2質(zhì)量濃度為100 mg/L時(shí)便無(wú)法生長(zhǎng)。

表4 篩選菌株的SO2耐受性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 SO2 tolerance test results of screened strains

2.4.3 糖耐受性

選取具有較強(qiáng)SO2耐受性的S15、T11、F25和BV818進(jìn)行糖耐受性測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，所有菌株在糖含量20%的培養(yǎng)基中均能正常發(fā)酵和生長(zhǎng)，菌體數(shù)量增長(zhǎng)明顯；在糖含量30%時(shí)，S15菌體生長(zhǎng)量最低；在40%糖含量時(shí)，各菌株發(fā)酵產(chǎn)氣迅速下降；當(dāng)糖含量達(dá)到60%時(shí)，只有菌株T11、F25和BV818能夠進(jìn)行微弱發(fā)酵產(chǎn)氣，菌體數(shù)量無(wú)明顯變化。結(jié)果表明，菌株T11、F25和商業(yè)釀酒酵母BV818具有較高的糖耐受性。

2.5 釀酒酵母菌株的顯色篩選結(jié)果

以商業(yè)釀酒酵母BV818、F5和空白組為對(duì)照，對(duì)菌株T11和F25進(jìn)行產(chǎn)乙醇、產(chǎn)H2S和產(chǎn)酯能力顯色檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，四株菌的TTC顯色均呈現(xiàn)深紅色，Biggy Agar培養(yǎng)基均呈現(xiàn)淺棕褐色，產(chǎn)酯培養(yǎng)基均呈現(xiàn)深黃色。說(shuō)明菌株T11、F25和對(duì)照商業(yè)釀酒酵母菌株BV818、F5相似，屬于具有較強(qiáng)產(chǎn)乙醇、產(chǎn)酯且低產(chǎn)H2S的菌株，符合生產(chǎn)對(duì)釀酒酵母的基本要求。

表6 篩選菌株在TTC、Biggy Agar和產(chǎn)酯培養(yǎng)基上的顯色結(jié)果Table 6 Chromogenic results of screened strains on TTC, Biggy Agar and ester-producing medium

2.6 酵母菌株釀造臍橙果酒

2.6.1 酵母菌株釀酒性能的測(cè)定

將T11、F25和商業(yè)酵母BV818、F5分別應(yīng)用于臍橙果酒的釀造，按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》對(duì)所釀臍橙果酒進(jìn)行色度、還原糖、總酸、揮發(fā)酸、酒精度、pH和總酚等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 篩選菌株釀酒性能的對(duì)比Table 7 Comparison of brewing performance of screened strains

由表7可知，菌株T11和F25所釀臍橙果酒均符合GB 15037—2006《葡萄酒》要求，并且其還原糖、總酸、揮發(fā)酸、酒精度和總酚等指標(biāo)均接近商業(yè)酵母。

2.6.2 臍橙果酒揮發(fā)性香氣成分分析

利用頂空固相微萃取結(jié)合GC-MS技術(shù)對(duì)菌株T11、F25和商業(yè)菌株BV818、F5所釀造的臍橙果酒揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行檢測(cè)，揮發(fā)性成分差異分析熱圖見(jiàn)圖3。由圖3可知，不同酵母釀造的臍橙原酒樣品可以聚為3類：兩株商業(yè)酵母菌株BV818和F5釀造酒樣聚為一類，T11和F25釀造酒樣分別單獨(dú)聚為一類。在臍橙果酒中共檢測(cè)到37種揮發(fā)性風(fēng)味成分，包括酯類18種，醇類3種，酸類7種，醛、酮類3種，萜烯類和降異戊二烯類6種。

圖3 不同酵母所釀臍橙果酒揮發(fā)性成分差異分析熱圖Fig.3 Differences analysis heatmap of volatile components of navel orange wine brewed by different yeast strains

不同酵母釀造臍橙果酒揮發(fā)性風(fēng)味成分含量對(duì)比結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，不同酵母釀造臍橙果酒揮發(fā)性風(fēng)味成分含量不同，其中，酯類BV818＞F5＞F25＞T11，醇類T11＞F25＞F5＞BV818，酸類F5＞BV818＞T11＞F25，醛酮類F25＞F5＞BV818＞T11，萜烯類和降異戊二烯類F25＞T11＞F5＞BV818。相較商業(yè)酵母，T11釀造酒樣的醇類揮發(fā)性成分含量最高，醇類物質(zhì)含量也最高，為2 226.65 mg/L，F(xiàn)25酒樣的醛酮類、萜烯類和降異戊二烯類含量較高，醛酮類物質(zhì)含量達(dá)1 196.07 mg/L，酯類種類雖然最多，但是其含量卻低于對(duì)照兩株商業(yè)酵母。

圖4 不同酵母釀造臍橙果酒揮發(fā)性風(fēng)味成分含量對(duì)比Fig.4 Comparison of volatile flavor components in navel orange wine brewed by different yeasts

F25釀造酒樣的20種香氣成分含量較高，分別是棕櫚酸、香葉基丙酮、對(duì)羥基苯乙醇、D-香茅醇、苯乙醇、反式-橙花叔醇、肉豆蔻酸、（-）-4-萜品醇、庚酸乙酯、乙酸苯乙酯、辛酸丙酯、圓柚酮、丁二酸二乙酯、肉桂酸乙酯、辛酸甲酯、苯乙酸乙酯、苯甲酸乙酯、里那醇、月桂酸乙酯和乙酸乙酯；T11釀造酒樣的乙酸異戊酯、棕櫚酸乙酯和異戊醇含量較高。F25釀造酒樣因?yàn)楠?dú)有的香氣成分辛酸甲酯、辛酸丙酯、苯乙酸乙酯和肉桂酸乙酯，使其表現(xiàn)出甜美的花香和果香；F25和T11酒樣較商業(yè)酵母BV818和F5釀造酒樣，因?yàn)閷?duì)羥基苯乙醇、肉豆蔻酸、里那醇、（-）-4-萜品醇和D-香茅醇等成分的存在，萜烯類和降異戊二烯類物質(zhì)所特有花的清香會(huì)更濃一些。通過(guò)與商業(yè)酵母酒樣揮發(fā)性成分的對(duì)比可知，菌株F25和T11酒樣在花香、果香呈現(xiàn)上，均具有一定的優(yōu)勢(shì)。

2.6.3 臍橙果酒感官評(píng)價(jià)分析

不同酵母釀造臍橙果酒感官評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 不同酵母釀造臍橙果酒感官評(píng)價(jià)結(jié)果Fig.5 Sensory evaluation results of navel orange wine brewed by different yeasts

由圖5可知，4株酵母菌發(fā)酵釀造臍橙果酒，感官整體可接受度得分依次為：F25＞T11＞BV818＞F5。F25所釀臍橙果酒香氣評(píng)價(jià)總體優(yōu)于T11和兩株商業(yè)酵母。F25酒樣的果香、花香等感官得分均最高，與GC-MS測(cè)定結(jié)果中F25的苯乙酸乙酯、肉桂酸乙酯、里那醇、（-）-4-萜品醇、D-香茅醇和香葉基丙酮等含量相對(duì)較高相對(duì)應(yīng)，這與ESCUDERO A等[25-26]研究發(fā)現(xiàn)酯類和烯萜類化合物可增強(qiáng)發(fā)酵果酒中果香、花香相一致。同時(shí)，F(xiàn)25含有較高的正戊醇和對(duì)羥基苯乙醇，有助于提升臍橙果酒的香氣質(zhì)量、純正度和濃郁度，這與STYGER G等[27]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵酒中風(fēng)味強(qiáng)度與醇類化合物種類、質(zhì)量濃度關(guān)系密切相符合。菌株F25與T11兩株對(duì)照商業(yè)酵母菌株相比，釀造果酒的香氣評(píng)價(jià)更好，其中F25釀造臍橙果酒具有更大優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié)論

本研究以四川渠縣臍橙園土壤、果樹(shù)枝葉和臍橙果實(shí)外果皮為分離源，分離篩選出兩株性能優(yōu)良的釀酒酵母菌F25和T11。該兩株釀酒酵母菌具有發(fā)酵啟動(dòng)早、產(chǎn)氣速度快、發(fā)酵高峰持續(xù)時(shí)間久和良好凝聚性等優(yōu)良特性。兩株菌對(duì)乙醇、SO2和糖均具有較強(qiáng)耐受性，均能在體積分?jǐn)?shù)16%乙醇、300 mg/L SO2及60%糖含量的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，且均表現(xiàn)出較強(qiáng)的產(chǎn)乙醇、產(chǎn)酯能力和低產(chǎn)H2S能力。同時(shí)，菌株F25和T11均具有優(yōu)良的臍橙果酒釀酒性能，其中F25釀造的臍橙果酒在香氣成分及感官品鑒方面明顯優(yōu)于兩株商業(yè)酵母菌。本研究的結(jié)果顯示，本土釀酒酵母F25和T11具有應(yīng)用于臍橙果酒工業(yè)生產(chǎn)的潛力和價(jià)值。