馬 龍，林一心，尉軍強，燕 偉，趙新民，岳祥亮，路 瑞，祁曉東，唐 云*

（甘肅金徽酒股份有限公司，甘肅 隴南 742308）

然而，自然形成的優(yōu)質(zhì)窖泥的量與行業(yè)發(fā)展的需求不均衡，且人工窖泥在濃香型白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用非常廣泛[8-10]。人工窖泥通常以接種培養(yǎng)為主，將富含大量微生物的優(yōu)質(zhì)老窖泥或者從老窖泥中分離出的復(fù)合菌液與新鮮土壤、水進行混合，在厭氧容器中發(fā)酵結(jié)束后取出使用[11]。發(fā)酵完成的人工窖泥被用于新窖的發(fā)酵，可以在短時間內(nèi)成功培養(yǎng)出生產(chǎn)濃香型白酒的有益微生物群落，從而提高濃香型白酒的質(zhì)量[12]。但人工窖泥在使用過程中會老化，老化人工窖泥最明顯的特點是形成大量由結(jié)晶乳酸鈣和乳酸亞鐵組成的白色團聚體[12-13]。目前，大多數(shù)白酒企業(yè)對人工窖泥的需求都非常大，因此大量的研究主要聚焦于優(yōu)質(zhì)人工窖泥的培養(yǎng)方法上[14-15]，但對人工窖泥中微生物群落變化的研究卻鮮有報道。

利用傳統(tǒng)的分離法研究窖泥微生物局限性較大，少數(shù)研究采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）-變性梯度凝膠電泳和定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測相結(jié)合的方法研究窖泥中微生物群落的差異[16]。但高通量測序技術(shù)是目前研究窖泥微生物使用最廣泛的方法，它能夠同時對大量的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）樣品進行分析，具有高通量、高準(zhǔn)確性等特點，還可以全面的揭示窖泥微生物群落的變化信息[17-18]。

金徽酒股份有限公司位于甘肅省隴南徽縣境內(nèi)，氣候溫暖濕潤，地處北亞熱帶濕潤氣候向北暖溫帶過渡區(qū)，這種獨特的氣候環(huán)境使得大量微生物可以被富集[19]，且其傳承400多年低溫入窖、低溫發(fā)酵、低溫蒸餾的獨特工藝，年份悠久的窖泥擁有豐富的微生物[20-21]，其窖池有著“西北濃香第一窖”之稱，但對于人工窖泥的研究起步較晚。因此，本研究基于高通量測序技術(shù)對金徽酒股份有限公司培養(yǎng)的成熟人工窖泥進行了詳細的微生物菌群分析，通過與優(yōu)質(zhì)老窖泥微生物菌群進行對比，揭示人工窖泥和老窖泥微生物菌群差異，探究窖泥快速老熟機制。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 窖泥樣品

以五點取樣法采集甘肅省金徽酒廠窖齡30年以上的優(yōu)質(zhì)老窖泥以及成熟人工窖泥。將樣品置于密封袋中，取樣完成后快速將所取樣品保存在-20 ℃冰箱中備用。將優(yōu)質(zhì)老窖泥樣品標(biāo)記為JH01、JH02、JH03和JH04，人工窖泥樣品標(biāo)記為APM1、APM2、APM3和APM4。

1.1.2 試劑

PowerSoil DNA分離試劑盒：美國MoBio實驗室；BIOWEST西班牙瓊脂糖：上海聯(lián)碩寶為生物科技有限公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit試劑盒：美國Axygen Biosciences公司；NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit建庫試劑盒：美國Bioo Scientific公司；MiSeq Reagent Kit測序試劑盒v3：美國llumina公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5424R高溫臺式冷凍離心機：德國Eppendorf公司；TL-48R粉碎研磨儀：上海萬柏生物科技有限公司；QL-901旋渦混合器：海門其林貝爾儀器制造有限公司；NanoDrop2000超微量分光光度計：美國Thermo Fisher Scientific公司；QuantusTMFluorometer微型熒光計：美國Promega公司；DYY-6C電泳儀：北京市六一儀器廠；GeneAmpR9700型PCR儀：美國ABI公司。

司大愣子媳婦對我說：“秀容川，你不能再跟別呦呦來往了！你才十四歲，壞了名聲，看日后哪個女的敢嫁給你。”

1.3 方法

1.3.1 DNA提取和PCR擴增

根據(jù)PowerSoil DNA分離試劑盒說明書進行窖泥樣品微生物群落總DNA提取，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量，使用超微量分光光度計測定DNA 濃度和純度；使用引物對357F和806R對16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增[22-23]。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性3 min，27個循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在4 ℃進行保存。PCR擴增體系為：5×TransStart FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol/L 脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphates，dNTPs）2 μL，上游引物（5 μmol/L）0.8 μL，下游引物（5 μmol/L）0.8 μL，TransStart FastPfuDNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，雙蒸水（ddH2O）補足至20 μL。

1.3.2 Illumina Miseq測序

將同一窖泥樣品的PCR產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit試劑盒進行回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用微型熒光計對回收產(chǎn)物進行檢測定量。使用建庫試劑盒進行建庫。利用Illumina公司的Miseq PE250平臺交由蘇州態(tài)和生物科技有限公司進行測序。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

測序得到的PE reads首先根據(jù)barcode區(qū)分每個樣本，而后對序列質(zhì)量進行質(zhì)控和過濾，再根據(jù)overlap關(guān)系進行拼接，拼接后的序列再次進行質(zhì)控和過濾，最后得到優(yōu)化序列。優(yōu)化序列進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析和物種分類學(xué)分析，基于OTU聚類分析結(jié)果，對窖泥樣品的OTU進行Alpha多樣性指數(shù)分析，使用SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)差異性分析，并使用R軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果統(tǒng)計

通過Illumina MiSeq PE250測序平臺對收集到的窖泥樣品進行測序，分析人工窖泥和優(yōu)質(zhì)老窖泥中的細菌群落，結(jié)果見表1。

表1 窖泥樣品測序序列信息統(tǒng)計Table 1 Statistics of sequencing information of pit mud samples

由表1可知，8個窖泥樣品共獲得447 717個有效序列；基于16S rRNA序列97%的同源性對優(yōu)化序列進行分組，共獲得385 249個有效序列；每個窖泥樣品包含31 138～65 528條序列數(shù)，序列平均長度為410 bp；各個窖泥樣品的優(yōu)化序列長度分布在222～449 bp；共得到4 453個OTU，各樣本的OTU分布介于357～901之間。每個樣品的測序深度指數(shù)均大于99%，表明測序深度基本覆蓋到每個窖泥樣品中的所有物種，即測序序列可以代表每個窖泥樣品的微生物菌群組成。

2.2 老窖泥和人工窖泥細菌菌群Alpha多樣性分析

Alpha多樣性是目前微生物多樣性研究中的主流分析方法，其主要用來分析局域生境下物種的多樣性程度[24]。比較不同樣本的α多樣性指數(shù)可以看出不同樣本的多樣性差異[25]。Alpha多樣性指數(shù)主要包括：Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)等。其中，Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)代表群落中物種的數(shù)量，而不考慮群落中每個物種的豐度情況；其指數(shù)值越大，表明樣品中豐富度越高。而Shannon指數(shù)以及Simpson指數(shù)反映群落的多樣性，在相同物種豐富度的情況下，群落中物種均勻度越大，其多樣性越高。Shannon指數(shù)越大、Simpson指數(shù)越小，表明樣品中微生物群落多樣性高[26]。本研究選擇Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)作為多樣性指標(biāo)，比較人工窖泥和優(yōu)質(zhì)老窖泥細菌群落多樣性之間的差異，結(jié)果見圖1。

圖1 人工窖泥和老窖泥細菌菌群Alpha多樣性指數(shù)比較Fig.1 Comparison of bacterial community Alpha diversity indexes between artificial and old pit muds

由圖1可知，老窖泥Chao1指數(shù)為743.97±259.14，高于人工窖泥（702.59±136.93），但差異不顯著（P＞0.05）；老窖泥ACE指數(shù)為737.14±277.01，高于人工窖泥（707.78±129.82），無顯著差異（P＞0.05）；說明人工窖泥和老窖泥之間豐富度相同。通過比較人工窖泥和老窖泥Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)發(fā)現(xiàn)，老窖泥的Shannon指數(shù)為3.58±0.55，高于人工窖泥（2.06±0.09），兩者之間差異顯著（P＜0.05）；而老窖泥的Simpson指數(shù)為0.13±0.09，低于人工窖泥（0.31±0.08），兩者之間同樣差異顯著（P＜0.05）；表明老窖泥中細菌群落多樣性高于人工窖泥。

2.3 老窖泥和人工窖泥細菌菌群β多樣性分析

2.3.1 老窖泥和人工窖泥門水平細菌組成和豐度差異

根據(jù)OTU統(tǒng)計分析，8個窖泥樣品共統(tǒng)計出15個細菌門，老窖泥中檢測出15個細菌門，而人工窖泥中檢測出14個細菌門。由圖2可知，人工窖泥樣品中的細菌主要來自厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），在人工窖泥中的細菌豐度達到92.03%和5.59%；而老窖泥中的細菌主要來自厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形菌門（Proteobacteria），其在老窖泥中的細菌豐度分別達到70.59%、17.13%、5.84%。大多厚壁菌門的細菌可以產(chǎn)生芽孢，而芽孢可以抵抗脫水和其他極端環(huán)境[27]，這種特性能夠讓窖泥在窖池環(huán)境中生存。而變形菌門中存在很多可以進行固氮的細菌，大多數(shù)可以進行厭氧生存[28]。擬桿菌門被認為是促進窖泥老熟特征的關(guān)鍵微生物群，它能夠?qū)⒔涯嘀械腇e3+轉(zhuǎn)化成Fe2+，從而使得窖泥的顏色出現(xiàn)老熟特征（由紅黃棕色轉(zhuǎn)變?yōu)榛野浊嗌28]。變形菌門通常被認為是新窖窖泥的優(yōu)勢菌門[29]，在研究中，新窖窖泥和老窖泥中變形菌門的相對豐度并無顯著差異（P＞0.05）。但由于每個釀酒企業(yè)所屬的地理環(huán)境、氣候的差異，這可能會導(dǎo)致窖泥微生物種類上的差異。

根據(jù)得到的群落豐度數(shù)據(jù)，采用組間差異分析方法比較了人工窖泥和老窖泥在細菌門水平上優(yōu)勢門的群落豐度差異，選擇的優(yōu)勢門包括厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門，結(jié)果見圖3。由圖3可知，人工窖泥在厚壁菌門的相對豐度顯著高于老窖泥（P＜0.05），其變化程度高于老窖泥，說明人工窖泥的厚壁菌門細菌群落豐度相比于老窖泥較高，且其群落豐度變化較大。而在變形菌門中，人工窖泥和老窖泥的群落相對豐度并無顯著差異（P＞0.05），但人工窖泥的變化程度顯著低于老窖泥。在擬桿菌門中，人工窖泥的群落豐度顯著低于老窖泥（P＞0.05），其變化程度也顯著低于老窖泥（P＜0.05）。人工窖泥在門水平上的細菌群落結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，且擬桿菌門和厚壁菌門的相對豐度差異可能是人工窖泥與老窖泥在細菌門水平上的主要差異。擬桿菌門作為促進窖泥老熟的重要微生物菌群[30]，在窖泥微生物生態(tài)中主導(dǎo)碳循環(huán)的過程中有著非常關(guān)鍵的作用[28]。金徽酒人工窖泥中缺乏擬桿菌門的微生物群，對其促進人工窖泥老熟有著不利的影響。因此在后續(xù)的人工窖泥培養(yǎng)中，應(yīng)注重擬桿菌門微生物菌群的培養(yǎng)。其次，微生物相對豐度的變化程度也可能是人工窖泥與老窖泥之間的主要區(qū)別，老窖泥微生物在門水平上的相對豐度的彈性遠遠大于人工窖泥，說明老窖泥中的微生物群落在幾十年的長期馴化中已經(jīng)形成了內(nèi)部的穩(wěn)態(tài)，可以面對各種復(fù)雜的外部環(huán)境作出調(diào)整，而人工窖泥在短期內(nèi)可能達不到相應(yīng)的指標(biāo)，這可能也是人工窖泥和老窖泥在門水平上微生物差異的另一個重要原因。

圖3 人工窖泥與老窖泥細菌門水平關(guān)鍵微生物豐度差異Fig.3 Differences in abundance of key microorganisms between old pit mud and artificial pit mud at the phylum level

2.3.2 老窖泥和人工窖泥屬水平細菌組成和豐度差異

由于16S rDNA在V3-V4可變區(qū)測得的物種分類數(shù)據(jù)在屬水平上最為準(zhǔn)確，因此分析了老窖泥和人工窖泥在屬水平上的細菌組成和豐度差異，結(jié)果見圖4。由圖4可知，在所有的窖泥樣品中共檢測出了87個屬，其中人工窖泥檢測出細菌84屬，老窖泥檢測出細菌86屬，人工窖泥和老窖泥在屬水平組成上基本相似。然后將平均相對豐度＞1%的屬定義為優(yōu)勢微生物屬，提取出14個優(yōu)勢菌屬（包括一個未分類屬和其他屬），這14個優(yōu)勢屬在人工窖泥和老窖泥中都存在。其中，Tepidanaerobacter，厭氧桿菌屬（Anaerosalibacter），Caldicoprobacter是人工窖泥中的主要優(yōu)勢菌屬，它們的相對豐度分別為44.44%，17.44%和13.14%。這與相鄰的四川某酒廠培育的人工窖泥微生物菌屬的差異較大[6]，四川與西北地區(qū)的氣候、環(huán)境差異較大，從而導(dǎo)致在培養(yǎng)人工窖泥時富集的微生物菌群不一致。其次，人工窖泥培養(yǎng)方式的差異也可能會導(dǎo)致微生物菌群的差異，比如人工窖泥在室外發(fā)酵，其菌種的分布隨發(fā)酵層次的變化而變化。當(dāng)投入到生產(chǎn)之后，人工窖泥中的厭氧優(yōu)勢菌群（如己酸菌等）會快速富集，從而生產(chǎn)高質(zhì)量的濃香型白酒[6]。而老窖泥中的主要優(yōu)勢菌屬為產(chǎn)己酸菌屬（Caproiciproducens），乳桿菌屬（Lactobacillus）和嗜蛋白菌屬（Proteiniphilum），其相對豐度分別為18.55%，12.91%和7.62%。這與四川宜賓地區(qū)[6-7]、安徽[31-33]、河南[34]等地區(qū)的老窖泥微生物菌屬的組成相一致，但同時窖泥微生物群落也具有明顯的地域和企業(yè)特征。如TAO Y等[29]利用454擴增子測序技術(shù)揭示出綿竹地區(qū)某知名酒廠窖泥以理研菌屬（Petrimonas）等屬為優(yōu)勢類群。趙東等[35]采用Illumina 擴增子測序解析五糧液窖泥原核微生物群落多樣性時發(fā)現(xiàn)糞球菌屬（Coprococcus）和Soehngenia等是優(yōu)勢類群。以上結(jié)果均與本研究中檢測出的窖泥微生物群落存在顯著差異。復(fù)雜的地理氣候環(huán)境以及釀酒原料和工藝之間的差異，是造成窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)具有地域和企業(yè)特征的主要原因。

圖4 老窖泥和人工窖泥屬水平細菌組成差異Fig.4 Differences in bacterial composition between old and artificial pit muds at the genus level

為了進一步探究濃香型白酒老窖泥和人工窖泥樣品中潛在的關(guān)鍵微生物菌種，比較了6個相對豐度較大的微生物優(yōu)勢菌屬在人工窖泥和老窖泥之間的平均相對豐度差異，探究人工窖泥和老窖泥之間的關(guān)鍵微生物差異，結(jié)果見表2。

表2 老窖泥和人工窖泥屬水平關(guān)鍵微生物豐度差異Table 2 Differences in the abundance of key microorganisms between old and artificial pit muds at the genus level

由表2可知，在6個主要的微生物優(yōu)勢菌屬中，其相對豐度有顯著差異的主要有3種：包括Tepidanaerobacter、產(chǎn)己酸菌屬（Caproiciproducen）和厭氧桿菌屬（Anaerosalibacters）。其中人工窖泥樣品中的Tepidanaerobacter和厭氧桿菌屬（Anaerosalibacters）的相對豐度含量顯著高于老窖泥樣品（P＜0.05）；而老窖泥中產(chǎn)己酸菌屬的相對豐度含量顯著高于人工窖泥（P＜0.05）。產(chǎn)己酸菌屬是濃香型白酒窖泥中能夠影響白酒風(fēng)味的重要微生物，由產(chǎn)己酸菌產(chǎn)生的己酸和乙醇相互作用生成的己酸乙酯是濃香型白酒的主要香氣成分。老窖泥中己酸菌的相對豐度較高，可以使得生產(chǎn)的白酒香味更濃，質(zhì)量更好[31-33]。而人工窖泥中的己酸菌相對豐度僅有0.3%，顯著低于老窖泥。一方面由于人工窖泥是在窖外大批量進行發(fā)酵，其環(huán)境并不能達到完全厭氧條件，因此產(chǎn)己酸的厭氧菌群不能快速的富集起來，從而導(dǎo)致人工窖泥中己酸菌的含量低于老窖泥；另一方面在人工窖泥發(fā)酵過程中菌種分布不均勻，這也可能是老窖泥中優(yōu)勢微生物屬存在差異的原因之一。

3 結(jié)論

本研究從Alpha多樣性和細菌群落結(jié)構(gòu)的分布特點闡述人工窖泥和老窖泥的差異。從豐富度指數(shù)來看，人工窖泥和老窖泥的指數(shù)并無顯著性差異（P＞0.05），但其群落多樣性之間存在顯著差異（P＜0.05），老窖泥細菌群落多樣性高于人工窖泥。從群落組成上看，人工窖泥中擬桿菌門的相對豐度顯著低于老窖泥（P＜0.05），且人工窖泥中的產(chǎn)己酸菌屬同樣顯著低于老窖泥，而Tepidanaerobacter和Anaerosalibacters顯著高于老窖泥（P＜0.05）。本研究只考慮了人工窖泥和老窖泥之間的細菌群落結(jié)構(gòu)差異，并未研究成熟的人工窖泥在入窖后微生物的群落動態(tài)變化。因此，未來還需要探究人工窖泥在窖池環(huán)境中的變化，才能更好的闡述人工窖泥和老窖泥之間的細菌群落差異。