楊立軍，花嬌嬌，崔晨旭，賈艷嬌，陳 瓊，赫丁軒*

（信陽農(nóng)林學院 制藥工程學院，河南 信陽 464000）

生物活性多糖因其治療特性和相對較低的副作用而被廣泛研究和用于食品和藥品行業(yè)。多糖的抗腫瘤[1]、免疫調(diào)節(jié)[2]和抗菌[3]活性已在生化和醫(yī)學領(lǐng)域得到充分研究和應(yīng)用，植物和藻類作為人類多糖的重要來源，需求壓力越來越大，這使得生物聚合物的全球市場價格被推高，同時過度依賴地球上的水生和陸地綠植來滿足人類的經(jīng)濟、能源、食品與醫(yī)學等需求是全球變暖和氣候變化挑戰(zhàn)的直接原因[4]。因此，尋找到無需進行耕地或光合生產(chǎn)的替代品至關(guān)重要[5]。

植物內(nèi)生菌種類繁多，廣泛分布在植物的根莖葉中，而且在與宿主植物長期共存中，產(chǎn)生了一系列有活性的次生代謝產(chǎn)物，如抗菌物質(zhì)、抗腫瘤物質(zhì)、抗病蟲害物質(zhì)等，是天然藥物的重要來源。半夏（Pinellia ternata）含有豐富的內(nèi)生菌菌種資源，且多株菌具有代謝抑菌活性物質(zhì)的特性，在獲取天然藥用生物活性成分方面存在很大潛能。劉建玲等[6]從半夏的根莖葉中分離出多株內(nèi)生真菌，證明了半夏內(nèi)生真菌的多樣性與分布差異性。黃筱鈞等[7]對分離得到的半夏內(nèi)生菌進行初步鑒定，對研究制備半夏益生菌制劑提供了重要的理論依據(jù)。

胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）作為與適應(yīng)、存活和功能相關(guān)生物體（植物，動物，藻類，細菌和真菌）的細胞外代謝物，具有短時間內(nèi)可大量生產(chǎn)、易于分離和純化等優(yōu)點[8]，屬于無毒天然產(chǎn)物，是生物活性多糖替代品的首選。此外，這些多糖還具有抗氧化、降血糖、抗腫瘤等[9-11]多種藥理活性，并且含有不同的反應(yīng)基團，如羥基、羧基等可進行化學修飾[12]，在生物材料和制藥工業(yè)方面潛力巨大，是合成聚合物的綠色替代品[13-14]。EPS在結(jié)構(gòu)、性能和生產(chǎn)方面的優(yōu)勢使其受到廣泛關(guān)注，成為目前研究和應(yīng)用較多的一類微生物多糖。目前，對EPS的研究主要集中在乳酸菌與細菌上，對于從藥用植物中分離得到的內(nèi)生真菌產(chǎn)生的胞外多糖的研究僅有些許報道，且主要集中于對胞外多糖的生物活性進行研究。如黑板樹內(nèi)生真菌鐮刀菌SD5的胞外多糖對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）表現(xiàn)出顯著的清除活性[15]；紅樹林內(nèi)生真菌胞外多糖具有良好的抗氧化活性[16]。但對于從藥用植物中分離得到的內(nèi)生真菌產(chǎn)生的胞外多糖的研究僅有些許報道，藥用植物內(nèi)生菌作為一種新型的微生物資源，具有重大的研究意義和潛在的應(yīng)用價值。

因此，本研究從本實驗室分離的藥用植物半夏內(nèi)生真菌中篩選出高產(chǎn)胞外多糖的菌株，通過形態(tài)學觀察與分子生物學技術(shù)進行菌種鑒定；以EPS產(chǎn)量為評價指標，采用單因素與正交試驗對菌株的發(fā)酵條件進行優(yōu)化；并通過掃描電鏡以及抗氧化與降血糖試驗對EPS的結(jié)構(gòu)與活性進行研究，以期為開發(fā)新型活性多糖、藥物和功能性食品提供新的菌株來源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

半夏內(nèi)生真菌：42株，實驗室分離并保藏；氯仿、正丁醇、苯酚、濃硫酸、無水乙醇、α-葡萄糖苷酶、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline）-6-sulfonic acid，ABTS）：合肥千盛生物科技有限公司；所有試劑均為分析純。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL；馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基內(nèi)不添加瓊脂，高壓蒸汽滅菌121 ℃、20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800-DS2紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；WT-3003型電子天平：杭州萬特衡器有限公司；RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海榮亞生化儀器廠；S-3400N掃描電子顯微鏡：日本日立有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粗胞外多糖的制備與提取

將菌株接種在PDA培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)5 d后得活化菌株。挑取菌絲體于PDB培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)5 d得種子液。將種子液按4%的接種量接種于PDB培養(yǎng)基中，同等條件下培養(yǎng)7 d得發(fā)酵液。參照YUAN P等[9]的方法進行粗胞外多糖的提取，采用苯酚-硫酸法[17]測定多糖產(chǎn)量，以葡萄糖含量（x）為橫坐標，以波長490 nm條件下的吸光度值（y）為縱坐標，建立葡萄糖標準曲線回歸方程：y=23.749x+4.107 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 1。

1.3.2 高產(chǎn)胞外多糖菌株的篩選

高產(chǎn)胞外多糖菌株的初篩與復(fù)篩參考陸娟等[18]的方法。首先以菌落周圍是否有粘稠分泌物為標準進行初篩，然后采用1.3.1所述的粗胞外多糖的提取方法制備初篩菌株的粗胞外多糖，通過苯酚-硫酸法測定菌株胞外多糖產(chǎn)量，選取胞外多糖產(chǎn)量最高的菌株進行后續(xù)鑒定與分析。

1.3.3 高產(chǎn)胞外多糖菌株的鑒定

形態(tài)學觀察：采用插片法[19]培養(yǎng)菌株，28 ℃倒置培養(yǎng)96 h，每隔24 h觀察并記錄菌落的形態(tài)變化。將插片經(jīng)草酸銨結(jié)晶紫染色后，置于載玻片上，然后在顯微鏡下觀察并記錄菌絲與孢子的形態(tài)特征。

分子生物學鑒定：菌株的分子生物學鑒定參考段鴻斌等[20]的方法。

1.3.4 高產(chǎn)胞外多糖菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

（1）單因素試驗

為提高胞外多糖產(chǎn)量，在原發(fā)酵條件為28 ℃、發(fā)酵時間120 h、接種量4%、轉(zhuǎn)速120 r/min的基礎(chǔ)上，選擇發(fā)酵溫度，發(fā)酵時間與接種量3個因素進行單因素試驗，每個因素水平設(shè)置條件如下：發(fā)酵溫度為25 ℃、28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃；發(fā)酵時間為100 h、110 h、120 h、130 h、140 h；接種量為4%、6%、8%、10%、12%。

（2）正交試驗

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，分別選取發(fā)酵溫度（A），發(fā)酵時間（B）與接種量（C）為評價因素進行3因素3水平的正交試驗，試驗因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

1.3.5 抗氧化能力測定

DPPH自由基清除能力測定：參考莫宏輝等[21]的方法；ABTS自由基清除能力測定：采用ABTS自由基清除法[22]；羥基自由基清除能力測定：參考劉娜等[23]的方法。

1.3.6 抑制α-葡萄糖苷酶活性測定

采用對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenylα-D-galactopyranoside，PNPG）法[24-25]進行測定。以阿卡波糖作為陽性對照，將粗胞外多糖和阿卡波糖分別配制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL的樣品溶液。向96孔酶標板中加入80 μL磷酸緩沖液（pH6.8），16 μL樣液和16 μLα-葡萄糖苷酶溶液（0.2 U/mL），37 ℃反應(yīng)15 min；加入16 μL濃度為2.5 mmol/L的PNPG溶液，37 ℃反應(yīng)30 min；最后加入100 μL濃度為1.0 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，用酶標儀測定波長405 nm處的吸光度值。按下式計算α-葡萄糖苷酶抑制率。

式中：A0為磷酸緩沖溶液代替樣品吸光度值；Ai為樣品吸光度值；Aj為磷酸緩沖溶液代替α-葡萄糖苷酶溶液的吸光度值。

1.3.7 表面形態(tài)觀察

將樣品固定在導(dǎo)電膠上，鍍金后，利用掃描電鏡（scanning electron microscopy，SEM）在電壓為10 kV，放大倍數(shù)為×5 000和×10 000條件下，觀察EPS的表面結(jié)構(gòu)。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

每組試驗重復(fù)3次，分別使用SPSS 26.0、Origin2018進行數(shù)據(jù)分析與繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)胞外多糖菌株篩選

對42株內(nèi)生真菌進行初篩，得到7株粘稠拉絲的菌株，表明其可能分泌粘性多糖，測定7株菌株的EPS產(chǎn)量，結(jié)果見圖1。由圖1可知，菌株BX-2產(chǎn)胞外多糖產(chǎn)量最高，為6.14 mg/mL，明顯高于其他菌株。因此，選擇菌株BX-2進行后續(xù)試驗。

圖1 復(fù)篩菌株的胞外多糖產(chǎn)量Fig.1 Exopolysaccharides production of re-screened strains

2.2 菌株BX-2的鑒定

2.2.1 形態(tài)學觀察

菌株BX-2的菌落形態(tài)與孢子形態(tài)見圖2。由圖2可知，其菌絲發(fā)達，邊緣偏乳白色，內(nèi)部呈黃色，且有淡黃色色素沉積，可能是內(nèi)生菌分泌的次級代謝產(chǎn)物。光學顯微鏡下，菌株BX-2的孢子呈長橢狀，簇生或單生，排列較為規(guī)整，大小為（7.5～12.1）×（2.8～4.7）μm。根據(jù)菌落形態(tài)與顯微觀察，并結(jié)合《真菌鑒定手冊》進行比對，初步判斷該菌株是曲霉屬（Aspergillussp.）真菌。

圖2 菌株BX-2的菌落形態(tài)（A）與孢子形態(tài)（B）Fig.2 Colony morphology(A)and spore morphology(A)of strain BX-2

2.2.2 分子生物學鑒定

對來自菌株BX-2的16S rDNA基因片段進行測序，并存放在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnologyinformation，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中。在MEGA 5.0軟件中使用具有1 000個自舉重復(fù)的鄰居連接方法構(gòu)建了具有該序列的系統(tǒng)發(fā)育樹[26]，結(jié)果見圖3。由圖3可知，菌株BX-2序列與土曲霉（Aspergillus terreus）MT558939.1序列之間的遺傳距離值較小，同源性＞99%，親緣關(guān)系最近。結(jié)合其形態(tài)觀察和分子生物學鑒定結(jié)果，最終鑒定菌株BX-2為土曲霉（Aspergillus terreus）。

圖3 基于16S rDNA基因序列菌株BX-2的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain BX-2 based on 16S rDNA gene sequence

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗結(jié)果與分析

2.3.1 發(fā)酵溫度對菌株BX-2胞外多糖產(chǎn)量的影響

真菌細胞內(nèi)的酶活力受溫度的影響，進而影響體內(nèi)的生長與代謝，在一定溫度范圍內(nèi)，酶活力隨著溫度的升高先增加后降低[27]，結(jié)果見圖4。

圖4 發(fā)酵溫度對菌株BX-2胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on exopolysaccharides production of strain BX-2

由圖4可知，在發(fā)酵溫度25～31 ℃時，EPS產(chǎn)量隨著發(fā)酵溫度的上升而增加，在發(fā)酵溫度31 ℃時達到最高水平，為6.18 mg/mL，當發(fā)酵溫度超過31 ℃時，EPS產(chǎn)量急劇下降，可能是因為酶活力降低導(dǎo)致胞外多糖產(chǎn)量下降。綜上，選取發(fā)酵溫度28 ℃、31 ℃、34 ℃進行正交試驗。

2.3.2 發(fā)酵時間對菌株BX-2胞外多糖產(chǎn)量的影響

不同發(fā)酵時間對菌株BX-2胞外多糖產(chǎn)量的影響見圖5。

圖5 發(fā)酵時間對菌株BX-2胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of fermentation time on exopolysaccharides production of strain BX-2

由圖5可知，當發(fā)酵時間為110 h時，EPS產(chǎn)量最高，隨著發(fā)酵時間的延長，EPS產(chǎn)量呈階梯狀減少，可能是由于發(fā)酵后期營養(yǎng)物質(zhì)消耗和菌體產(chǎn)生降解多糖的酶[28]，這與IBRAHIM S等[29]的研究結(jié)果相一致。綜上，選取發(fā)酵時間100 h、110 h、120 h進行正交試驗。

2.3.3 接種量對菌株BX-2胞外多糖產(chǎn)量的影響

接種量對菌株BX-2胞外多糖產(chǎn)量的影響見圖6。

圖6 接種量對菌株BX-2胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of inoculum on exopolysaccharides production of strain BX-2

由圖6可知，其對菌株BX-2的胞外多糖產(chǎn)量影響較大。EPS產(chǎn)量在接種量為4%～8%內(nèi)穩(wěn)步增加，在8%達到最高水平，為6.27 mg/mL，然后逐漸下降，當接種量為12%時，EPS產(chǎn)量最低，僅為3.59 mg/mL。可能是由于接種量過少時，菌種數(shù)量太少，EPS產(chǎn)量被限制；而接種量的增加又會使碳源過早被消耗，無法維持菌株豐富的營養(yǎng)，菌體過早進入衰亡期，發(fā)酵能力下降，從而影響菌株的EPS產(chǎn)量[30]。綜上，選取接種量6%、8%、10%進行正交試驗。

2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析

以發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時間（B）、接種量（C）為評價因素，以菌株的EPS產(chǎn)量為評價指標，進行正交試驗，所得正交試驗設(shè)計及結(jié)果，試驗結(jié)果及方差分析見表2和表3。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2和表3可知，影響EPS產(chǎn)量的主次因素為：發(fā)酵時間（B）＞發(fā)酵溫度（A）＞接種量（C），其中發(fā)酵時間對結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。高產(chǎn)胞外多糖菌株BX-2產(chǎn)EPS的最佳發(fā)酵條件為A2B2C2，即發(fā)酵溫度31 ℃、發(fā)酵時間110 h、接種量8%。按上述發(fā)酵條件進行3次重復(fù)驗證試驗，最終EPS產(chǎn)量為7.38 mg/mL，相較于優(yōu)化前提高了63.64%。

2.5 抗氧化試驗結(jié)果與分析

不同質(zhì)量濃度菌株BX-2胞外多糖與維生素C對3種自由基的清除率測定結(jié)果見圖7。

圖7 菌株BX-2胞外多糖的抗氧化能力Fig.7 Antioxidant capacity of exopolysaccharides of strain BX-2

由圖7可知，雖然總體而言菌株BX-2胞外多糖的清除率遠小于VC，但均具有一定的清除能力，其清除作用均隨著質(zhì)量濃度的增加而逐漸增強。當菌株BX-2胞外多糖質(zhì)量濃度＜0.4 mg/mL時，其對3種自由基的清除作用相差較小，隨著質(zhì)量濃度不斷上升，它對DPPH、ABTS自由基的清除作用隨之急劇上升，而對于羥基自由基的清除作用的增長則相對緩慢。其中，菌株BX-2胞外多糖對DPPH自由基的清除作用最強，對ABTS自由基的清除作用次之，羥基自由基最弱；當菌株BX-2胞外多糖質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時，其對DPPH、ABTS、羥基自由基的清除率分別為82.43%、62.71%、48.63%，相較于葉兆偉等[31]所測DPPH和羥基自由基清除率數(shù)據(jù)更高，這可能與環(huán)境等因素有關(guān)。BX-2胞外多糖對DPPH、ABTS、羥基3種自由基清除作用的IC50分別為0.565 mg/mL、0.895 mg/mL、1.677 mg/mL，它對DPPH與ABTS兩種自由基具有一定的清除能力。

2.6 抑制α-葡萄糖苷酶活性結(jié)果與分析

不同質(zhì)量濃度菌株BX-2胞外多糖與阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率結(jié)果見圖8。

圖8 菌株BX-2胞外多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.8 Inhibition rate of α-glucosidase by exopolysaccharides of strain BX-2

由圖8可知，在0.2～1.2 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，菌株BX-2胞外多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率與濃度呈正相關(guān)。當菌株BX-2胞外多糖的質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時，其抑制率達到86.96%，此時阿卡波糖的抑制率為96.84%，二者相差小于10%；菌株BX-2胞外多糖抑制α-葡萄糖苷酶的IC50為0.553 mg/mL，這說明菌株BX-2產(chǎn)的胞外多糖具有良好的體外降血糖能力。

2.7 掃描電鏡結(jié)果

對菌株BX-2胞外多糖進行表面微觀形貌觀察的電鏡圖見圖9。由圖9a可以觀察到BX-2胞外多糖表面存在明顯的斷裂；掃描電鏡的原理是電子成像，亮的區(qū)域高，暗的區(qū)域低，圖9b中所呈樣品圖像亮度相差不大，說明BX-2胞外多糖的厚度相對均一。

圖9 菌株BX-2胞外多糖的掃描電鏡觀察結(jié)果Fig.9 Scanning electron microscope observation results of exopolysaccharides of strain BX-2

3 結(jié)論

本研究從42株半夏內(nèi)生真菌中篩選出1株高產(chǎn)胞外多糖菌株BX-2?；谛螒B(tài)學觀察與分子生物學鑒定其為土曲霉（Aspergillus terreus）。由單因素試驗與正交試驗得到菌株BX-2的最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度31 ℃、發(fā)酵時間110 h、接種量8%。此條件下菌株BX-2的EPS產(chǎn)量為7.38 mg/mL，相較于優(yōu)化前提高了63.64%。體外抗氧化與降血糖試驗表明，菌株BX-2胞外多糖具有良好的抗氧化與體外降血糖能力。本研究豐富了產(chǎn)胞外多糖內(nèi)生菌的來源，為利用菌株BX-2生產(chǎn)胞外多糖作為天然抗氧化劑、降血糖劑提供了試驗基礎(chǔ)。