董 聰, 王 玥, 羅同陽, 高慶華, 王慶慶

(河北省微生物研究所有限公司,河北 保定 071051)

FAD依賴的葡萄糖脫氫酶(FAD-GDH)(EC1.1.99.10)是一類以FAD為輔基催化D-葡萄糖氧化生成葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯的氧化還原酶,廣泛應(yīng)用于血糖檢測、新型燃料電池[1]、植入式心臟起搏器[2]等領(lǐng)域,特別是在血糖檢測方面,由于FAD-GDH不利用氧作為電子受體,故不受血液氧分壓影響[3],適用于檢測靜脈血、動脈血和高海拔等氧含量不同的樣本[4]?；贔AD-GDH的血糖計(jì)不依賴于氧,對紅細(xì)胞壓積的干擾小,對麥芽糖、木糖等不敏感,避免了其他糖類干擾產(chǎn)生錯誤結(jié)果影響治療,近年來成為便攜式血糖監(jiān)測系統(tǒng)的研究熱點(diǎn)。畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)系統(tǒng)是目前使用最多和最廣泛的外源蛋白表達(dá)的工具之一[5-6],FAD-GDH在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中有過實(shí)現(xiàn)可溶表達(dá)的報(bào)道[7]。周利偉[8]、楊愈豐[9]、Yang等[10-11]、郭堅(jiān)等[12]將FAD-GDH在畢赤酵母中成功表達(dá)且進(jìn)行了結(jié)構(gòu)、酶學(xué)性質(zhì)等一系列研究。但是,上述研究在構(gòu)建重組表達(dá)菌株時(shí)轉(zhuǎn)入的都是含單拷貝基因的表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化畢赤酵母后表達(dá)FAD-GDH能力有限。諸多研究表明提高蛋白表達(dá)的方法有很多,提高基因拷貝數(shù)尤為重要[13-14]。Cámara等[15]為提高成熟肽mROL的表達(dá)量,利用同尾酶法成功構(gòu)建最高含15個目的基因拷貝數(shù)的畢赤酵母重組菌株。Teng等[16]為提高腐生子囊菌(Pseudoplectanianigrella)防御素(plectasin)的表達(dá)量,構(gòu)建了包含8拷貝表達(dá)盒的重組表達(dá)載體,其在畢赤酵母中的表達(dá)量是單拷貝表達(dá)量的1.63倍。呂星星等[17]構(gòu)建了鱖魚β-防御素2拷貝、4拷貝重組表達(dá)菌株,在畢赤酵母中提高了表達(dá)量。王義春等[18]構(gòu)建含1～6個玉米赤霉烯酮降解基因表達(dá)盒的表達(dá)質(zhì)粒,獲得ZEN降解酶重組菌株,4拷貝的轉(zhuǎn)化子表達(dá)水平最高,三角瓶發(fā)酵3 d,酶活達(dá)到10 U/mL。近年來,我們通過密碼子優(yōu)化等方法構(gòu)建了含單個表達(dá)盒的產(chǎn)FAD依賴的葡萄糖脫氫酶的重組畢赤酵母X33/pMD-GDH,在10 L發(fā)酵罐水平經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后,酶活為257.6 U/mL,且該酶具有良好的酶學(xué)性質(zhì)[19]。本研究旨在前期研究的基礎(chǔ)上,利用同尾酶法構(gòu)建基因的多拷貝表達(dá)盒載體策略,構(gòu)建基因多拷貝重組表達(dá)菌株;同時(shí)通過qRT-PCR分析確定各重組菌株基因中目的基因拷貝數(shù)[20],以考察研究不同拷貝數(shù)對酶活表達(dá)的影響,以期實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體 大腸埃希菌(Escherichiacoli)TOP10購自天根生化科技有限公司(北京);酵母表達(dá)菌株、畢赤酵母(Pichiapastoris)X33由中科院微生物研究所提供;質(zhì)粒pMD-GDH由河北省微生物研究所有限公司分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(本實(shí)驗(yàn)室)前期構(gòu)建,質(zhì)粒pPICZαA購自淼靈生物。

1.1.2 培養(yǎng)基及顯色液 ①大腸埃希菌LB 培養(yǎng)基、畢赤酵母YPD、YPDS 培養(yǎng)基見Invitrogen 公司畢赤酵母操作手冊。②YPCS發(fā)酵培養(yǎng)基:胰蛋白胨20 g,酵母提取物10 g,酪蛋白水解物5 g,山梨醇5 g,ddH2O 1 L,120 ℃滅菌20 min。③BMGY培養(yǎng)基:胰蛋白胨20 g/L,酵母提取物10 g/L,磷酸氫二鉀3 g/L,磷酸二氫鉀11.8 g/L,甘油10 mL,加水至895 mL,120 ℃滅菌20 min,溫度下降至60 ℃之后,超凈臺加入100 mL過濾除菌10×YNB(13.4 g/L),2 mL過濾除菌500×生物素(4×10-4g/L),甲醇5 mL。④BSM基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基:85%磷酸26.7 mL,硫酸鈣0.93 g/L,硫酸鉀18.2 g/L,硫酸鎂14.9 g/L,氫氧化鉀4.13 g/L,甘油40 g/L。⑤MD培養(yǎng)基:葡萄糖2 g,瓊脂粉2 g,ddH2O 90 mL,滅菌后加入10×YNB 10 mL和500×生物素0.2 mL。⑥MM培養(yǎng)基:瓊脂粉2 g,ddH2O 90 mL,滅菌后加入10×YNB 10 mL、500×生物素0.2 mL和0.5 mL甲醇。平板篩選顯色液:溶液Ⅰ:濃度為9×103mol/L的2,6-二氯靛酚鈉DCIP;溶液Ⅱ:10%葡萄糖(10 g葡萄糖溶于100 mL去離子水中);將10 mL的1%的瓊脂糖溶化后加入2 mL溶液Ⅱ、300 μL溶液Ⅰ即為顯色液(現(xiàn)用現(xiàn)配)。

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 Q5DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ、NotⅠ、BamHⅠ、BglⅡ、DpnⅠ)、蝦堿性磷酸酶rSAP和T4DNA連接酶等購自NEB公司;DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購自康為生物科技公司;qRT-PCR試劑SimpleChIP Uniwersal qPCR Master Mix 購自北京百靈克生物科技有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒購自全式金生物科技公司;酵母DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司(北京);博來霉素(Zeocin)購自索萊寶生物科技有限公司;YNB(分子級)購自酷來搏生物科技有限公司;生物素購自博奧拓達(dá)生物有限公司;DCIP購自BBL Life Sciences;其余試劑為分析純。引物合成和測序由北京中科希林生物科技有限公司完成。電泳儀(PP-1150,北京凱元信瑞儀器有限公司);PCR擴(kuò)增儀(ETC811,北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司);紫外凝膠成像儀(Tanon-52 OOMulti,北京原平皓生物科技有限公司);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Thermofisher QuantStutio 1,美國Thermo Fisher Scientific 公司);電擊轉(zhuǎn)化儀(Bio-rad micropulser,美國BIO-RAD公司);紫外分光光度儀(L3S,上海儀電儀器);恒溫振蕩搖床(ZWY-240,上海智誠公司);10 L發(fā)酵罐(TGFB300,上海洋格設(shè)備公司)。

1.2 方法

1.2.1 重組表達(dá)載體pPICZαA-GDH的構(gòu)建 將本實(shí)驗(yàn)室保藏的重組質(zhì)粒pMD-GDH和pPICZαA分別進(jìn)行EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切,膠回收目的片段,酶切產(chǎn)物利用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化到E.coliTop10。酶切鑒定陽性克隆,并送至中科希林生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.2.2 PCR點(diǎn)突變 由于FAD-GDH基因序列有BglⅡ酶切位點(diǎn),不利于后期同尾酶法構(gòu)建基因多拷貝菌株,所以需要設(shè)計(jì)引物將1 404位點(diǎn)由A突變?yōu)镚。引物序列為A-G:F(ATCAGAAGGTCTTTCGAGTCTTACCCTTTG);A-G:R(GAAA-GACCTTCTGATGTACTTAGCAACAGCA)。用Q5連接酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增,程序:98 ℃,5 min;98 ℃,30 s,退火溫度分別設(shè)為58、60、62 ℃,60 s,72 ℃,延伸10 min,20個循環(huán);72 ℃,延伸20 min;16 ℃保存。模板用之前構(gòu)建的pPICZαA-GDH質(zhì)粒。PCR結(jié)果用DpnⅠ酶消解,熱激轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài),分別涂布于LB+Zeocin平板上,37 ℃過夜培養(yǎng)。分別挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),提取質(zhì)粒,進(jìn)行BglⅡ和BamHⅠ雙酶切驗(yàn)證,酶切正確的送通用生物(安徽)股份有限公司測序,進(jìn)一步驗(yàn)證確認(rèn)。

1.2.3 FAD依賴的葡萄糖脫氫酶基因的多拷貝表達(dá)載體的構(gòu)建 多表達(dá)盒載體的構(gòu)建如圖1所示。具體如下:質(zhì)粒pPICZαA-GDH經(jīng)BglⅡ、BamHⅠ雙酶切,回收表達(dá)框,與經(jīng)BamHⅠ單酶切、rSAP去磷酸化回收質(zhì)粒酶連,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌感受態(tài)Top10中,篩選陽性克隆子后進(jìn)行試劑盒提質(zhì)粒,即得到FAD依賴的葡萄糖脫氫酶兩拷貝重組表達(dá)載體pPICZαA-2GDH。將兩拷貝重組表達(dá)載體pPICZαA-2GDH分別進(jìn)行BglⅡ、BamHⅠ雙酶切和BamHⅠ單酶切、rSAP去磷酸化,然后分別將酶切產(chǎn)物切膠回收,將表達(dá)框片段和線性化的重組表達(dá)載體片段用 T4 DNA 連接酶連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌感受態(tài)中,篩選陽性克隆子,即得到4拷貝的重組表達(dá)載體pPICZαA-4GDH。兩拷貝載體單切線性化與單拷貝的表達(dá)框連接得到3拷貝的重組表達(dá)載體pPICZαA-3GDH。

圖1 2拷貝載體構(gòu)建Fig.1 Vector construction of 2-copy

1.2.4 多拷貝酵母表達(dá)菌株的構(gòu)建及驗(yàn)證 將構(gòu)建成功的不同拷貝數(shù)重組載體質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ線性化后分別電轉(zhuǎn)表達(dá)宿主PichiapastorisX33感受態(tài),構(gòu)建重組菌株,電轉(zhuǎn)條件:2 kV,4～5 ms,快速加入1 mL 預(yù)冷的YPDS液體培養(yǎng)基,然后置于30 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)2～6 h, 4 000 r/min離心5 min,棄上清,用1 mL生理鹽水洗3次,然后將菌液涂布在100 μg/mL Zeocin的YPD平板上,30 ℃培養(yǎng)2～3 d,獲得轉(zhuǎn)化子。首先采用平板褪色篩選方法對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行初篩。用無菌牙簽將YPD平板上長出來的轉(zhuǎn)化子,復(fù)制到具有相同編號的MM和MD平板上,將平板置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),24 h后取出,將顯色液傾倒于MM平板上,室溫10～15 min即可發(fā)生褪色反應(yīng),陽性菌株在平板上可以將DCIP的藍(lán)色退去,出現(xiàn)褪色圈,據(jù)此確定陽性率,根據(jù)褪色圈大小初步定性確定酶活大小。根據(jù)褪色反應(yīng)篩選出陽性克隆,每種菌株隨機(jī)挑選3個轉(zhuǎn)化子,提取基因組DNA,利用實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)的方法檢測各轉(zhuǎn)化子中目的基因的拷貝數(shù)[21-22]。qPCR所用引物見表1。選擇GAPDH為內(nèi)參基因。

表1 qPCR所用引物 Table 1 The primers used in this study

1.2.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及相關(guān)分析 隨后對平板初篩得到的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá),測定酶活,具體如下:從MD平板上挑取相應(yīng)單菌落接種于5 mL 添加100 μg/mL Zeocin的YPCS試管培養(yǎng)基中,14～18 h后加 1%(體積分?jǐn)?shù))甲醇,之后24 h和48 h后均各加 1%(體積分?jǐn)?shù))甲醇誘導(dǎo),72 h收菌,8 000 r/min離心5 min收集上清,測定酶活。至少重復(fù)3次。FAD依賴葡萄糖脫氫酶的酶活測定,使用DCIP 作為電子受體,30 ℃反應(yīng)180 s,測定520 nm的吸光值變化[6]。分析比較不同基因拷貝數(shù)重組菌株的酶活。

1.2.6 10 L發(fā)酵罐放大表達(dá)FAD-GDH 選擇酶活高且穩(wěn)定的1拷貝菌株和4拷貝菌株進(jìn)行10 L罐擴(kuò)大培養(yǎng),分別挑單菌落接種于YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)10～14 h,按3%(體積分?jǐn)?shù))接種量轉(zhuǎn)接于100 mL BMGY培養(yǎng)基至OD600=6～8 ,以10%(體積分?jǐn)?shù))發(fā)酵體積接種于已滅菌的4.5 L BSM培養(yǎng)基中開始發(fā)酵培養(yǎng)。甲醇誘導(dǎo)期間每隔24 h加VC水溶液(終濃度0.45 μmol/L),30 ℃培養(yǎng),每12 h 取樣測定發(fā)酵液酶活;甲醇誘導(dǎo)72 h后外源添加VB2(終濃度0.5 mmol/L),測定上清液酶活,比較FAD-GDH蛋白質(zhì)的表達(dá)。發(fā)酵具體方法參照文獻(xiàn)[23-24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單拷貝重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

重組質(zhì)粒pMD-GDH和購買的載體pPICZαA經(jīng)過EcoRⅠ 和NotⅠ 雙酶切結(jié)果如圖2所示,酶切完全,大小正確。

圖2 pPICZαA(A)和pMD-GDH(B)雙酶切結(jié)果Fig.2 Double digestion results of pPICZαA(A) and pMD-GDH(B) M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1:經(jīng)EcoRⅠ 和NotⅠ 雙酶切后的pPICZαA;2:經(jīng)EcoRⅠ 和NotⅠ 雙酶切后的pMD-GDHM:DNA ladder;1: pPICZαA digested with EcoRⅠ and Not I; 2:pMD-GDH digested with EcoRⅠ and NotⅠ

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliTop10,并在含Zeocin的低鹽LB平板上篩選陽性菌落。提取陽性菌落質(zhì)粒,經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切驗(yàn)證,得到1.7 kb和3.6 kb兩個片段,亦與預(yù)期大小相符(圖3),說明構(gòu)建成功。以驗(yàn)證正確的質(zhì)粒為模板進(jìn)行點(diǎn)突變,經(jīng)測序和BglⅡ和BamHⅠ 雙酶切驗(yàn)證(圖3),獲得突變正確的pPICZαA-GDH表達(dá)載體,用于后期多拷貝載體構(gòu)建。

圖3 重組質(zhì)粒pPICZαA-GDH酶切驗(yàn)證結(jié)果Fig.3 Enzyme cleavage results of pPICZαA-GDHM:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1:經(jīng)EcoRⅠ 和NotⅠ 雙酶切后的pPICZαA-GDH;2:經(jīng)BamHⅠ單酶切后的pPICZαA-GDH;3:經(jīng)BglⅡ 和 BamHⅠ雙酶切后的pPICZαA-GDHM:DNA ladder; 1:pPICZαA-GDH digested with EcoR I and NotⅠ; 2:pPICZαA-GDH digested with BamHI; 3:pPICZαA-GDH digested with BamH Ⅰ and BglⅡ

2.2 多拷貝重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

首先,將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒 pPICZαA-GDH分別用BamHⅠ單酶切、rSAP去磷酸化,BglⅡ和BamHⅠ雙酶切得到單拷貝的表達(dá)盒GDH,通過膠回收獲取兩段目的片段,進(jìn)行T4連接酶連接,然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞中,對獲得的轉(zhuǎn)化子使用BglⅡ和BamHⅠ做酶切驗(yàn)證,通過篩選獲得2拷貝陽性克隆子pPICZαA-2GDH。再將2拷貝表達(dá)載體用BglⅡ和BamHⅠ雙酶切,回收2拷貝表達(dá)框,與2拷貝表達(dá)載體單酶切骨架酶連,得到4拷貝表達(dá)載體pPICZαA-4GDH。再將1拷貝表達(dá)框與2拷貝表達(dá)載體單酶切骨架酶連,得到3拷貝表達(dá)載體pPICZαA-3GDH。不同拷貝數(shù)載體BglⅡ和BamHⅠ雙酶切結(jié)果如圖4所示,1、2、3、4拷貝質(zhì)粒分別產(chǎn)生3.4、6.7、10、10.3 kb的片段,表明多拷貝表達(dá)盒表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖4 多拷貝表達(dá)載體酶切電泳分析圖Fig.4 Analysis of constructed plasmids with restriction endonucleases, digested with BglⅡ and BamHⅠM:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1～4:經(jīng)BglⅡ 和 BamHⅠ雙酶切后的pPICZαA-GDHn(n=1,2,3或4)M:DNA ladder;1-4: pPICZαA-GDHn(n=1,2,3 or 4) digested with BamHⅠ and BglⅡ

2.3 多拷貝酵母表達(dá)菌株的構(gòu)建及驗(yàn)證

將驗(yàn)證正確的不同基因拷貝數(shù)表達(dá)載體pPICZαA-GDH、pPICZαA-2GDH、pPICZαA-3GDH和pPICZαA-4GDH用BamH Ⅰ線性化,電擊轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主PichiapastorisX33,然后再涂布于抗性平板上得到酵母轉(zhuǎn)化子。

通過顯色法快速初步篩選陽性轉(zhuǎn)化子,加入顯色液5、10、15 min的顯色結(jié)果如圖5所示,剛加入顯色液時(shí)平板呈現(xiàn)藍(lán)色,菌株周圍開始有褪色圈,但不明顯;10 min后平板呈現(xiàn)紫紅色,陽性菌株周圍的褪色圈變大,15 min后褪色更明顯。其中非陽性轉(zhuǎn)化子沒有褪色反應(yīng)(圖5中箭頭所指菌株)。

圖5 顯色法篩選結(jié)果Fig.5 Chromogenic screening results

然后挑取陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行試管誘導(dǎo)發(fā)酵,用1%甲醇誘導(dǎo)72 h,測定上清液FAD依賴葡萄糖脫氫酶活,并以此來篩選高酶活菌株。通過qRT-PCR檢測了陽性轉(zhuǎn)化子中的基因拷貝數(shù),結(jié)果表明重組質(zhì)粒都成功整合到畢赤酵母的基因組上,目的基因拷貝數(shù)符合預(yù)期(表2)。

表2 酵母轉(zhuǎn)化子的拷貝數(shù)分析 Table 2 The copy number analysis of the yeast transformants

從所有保存菌株中挑選1、2、3和4拷貝各3株,重復(fù)誘導(dǎo)3次,并對1、2、3和4拷貝的重組酵母菌株進(jìn)行表達(dá)水平的比較。結(jié)果表明,在試管水平,單拷貝平均酶活11.953 U/mL,2拷貝平均酶活27.99 U/mL,3拷貝平均酶活44.792 U/mL,4拷貝平均酶活57.027 U/mL;分別比單拷貝提高2.34、3.75、4.78倍(圖6)。由此可見,多拷貝表達(dá)載體的構(gòu)建可以提高FAD依賴的葡萄糖脫氫酶的表達(dá)水平。

圖6 試管水平不同基因拷貝數(shù)重組菌株酶活比較Fig.6 Comparison of enzyme activities of recombinant strains with different gene copy numbers at test tube level

2.4 10 L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)

選擇酶活高且穩(wěn)定的1拷貝菌株和4拷貝菌株進(jìn)行10 L罐擴(kuò)大培養(yǎng),結(jié)果如圖7所示。1拷貝菌株誘導(dǎo)108 h酶活達(dá)到最高697.125 U/mL(圖7A),4拷貝菌株誘導(dǎo)132 h酶活達(dá)到最高1 063.279 U/mL(圖7B);OD600和濕重均隨著誘導(dǎo)時(shí)間逐步增加。

圖7 10 L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)結(jié)果Fig.7 Culture results of 10 L Fermentation A:X33/pPICZαA-GDH菌株酶活生長曲線;B:X33/pPICZαA-4GDH菌株酶活生長曲線A:Growth curve of X33/pPICZαA-GDH; B:Growth curve of X33/pPICZαA-4GDH

從圖8可以看出,甲醇誘導(dǎo)前60 h二者酶活差異不大,60 h以后4拷貝菌株酶活一直比1拷貝菌株酶活高。4拷貝菌株在誘導(dǎo)72 h后酶活617.3 U/mL,是原試管水平發(fā)酵72 h(57.027 U/mL)時(shí)的10.82倍。

圖8 10 L發(fā)酵罐上清液酶活比較Fig.8 Comparison of enzyme activity of 10 L Fermentation

3 討 論

FAD依賴的葡萄糖脫氫酶作為血糖檢測用酶有廣闊的應(yīng)用前景,但其在天然宿主菌中表達(dá)量很低,在大腸埃希菌進(jìn)行重組表達(dá)時(shí)易形成包涵體,不易分離[25]。目前主要依賴進(jìn)口,還沒有實(shí)現(xiàn)國產(chǎn)化。前期研究構(gòu)建的含單拷貝表達(dá)盒載體的重組畢赤酵母菌株X33/pMD-GDH產(chǎn)量還不能滿足生產(chǎn)需求,亟需利用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。近年來,有很多通過同尾酶法構(gòu)建基因多拷貝表達(dá)盒載體提高外源基因在畢赤酵母中表達(dá)量的報(bào)道。表達(dá)盒是獨(dú)立的順式作用元件,多個表達(dá)盒可以同向連接在同一載體中,轉(zhuǎn)化宿主后實(shí)現(xiàn)多個基因的共表達(dá)[26]。所以,本研究擬通過同尾酶法構(gòu)建含不同拷貝表達(dá)盒載體pPICZαA-nGDH的重組菌株,使每一個表達(dá)盒都可以獨(dú)立表達(dá)目的蛋白,以提高GDH的表達(dá)量。通過qRT-PCR證明,重組菌株所含載體的表達(dá)盒數(shù)與GDH基因的拷貝數(shù)之間存在正相關(guān)關(guān)系。

近年來有研究發(fā)現(xiàn),基因拷貝數(shù)的增加與外源重組蛋白的表達(dá)量并不總是正相關(guān)關(guān)系,有時(shí)候基因拷貝數(shù)對外源蛋白的表達(dá)會起負(fù)效應(yīng)。這與外源蛋白表達(dá)受很多因素影響有關(guān),例如不同啟動子、畢赤酵母的不同表型、不同分泌信號和表達(dá)機(jī)制等[27]。Cos等[28]為提高根霉脂肪酶表達(dá)量構(gòu)建了Muts和Mut+型重組表達(dá)畢赤酵母多拷貝菌株,發(fā)現(xiàn)二者產(chǎn)量相對于單拷貝的產(chǎn)量都有所下降,分別降低了5%和30%。Song等[29]構(gòu)建了不同拷貝谷氨酰轉(zhuǎn)胺酶基因mtg的表達(dá)菌株,發(fā)現(xiàn)基因拷貝數(shù)從1增加到3時(shí),表達(dá)量增加,但是拷貝數(shù)再增加后菌株的酶活明顯下降。Hohenblum等[30]在pGAP啟動子調(diào)控下將胰島素酶基因拷貝數(shù)從1增加到3,但是其表達(dá)量沒有變化。

同時(shí),通過同尾酶法增加拷貝數(shù)也受到其他因素的限制。比如,表達(dá)盒插入方向隨機(jī)、載體自連、載體長度逐漸增加等因素均會降低構(gòu)建多拷貝表達(dá)載體的效率。綜上,本研究只構(gòu)建了1～4拷貝表達(dá)盒載體。焦梁成[31]用同尾酶法最高成功構(gòu)建4拷貝米根脂肪酶ROL重組載體,而用改進(jìn)的生物磚法較容易構(gòu)建獲得含8拷貝表達(dá)盒重組載體。因此,進(jìn)一步研究將探索更多的方法提高表達(dá)量。

本研究用按照畢赤酵母偏好性進(jìn)行優(yōu)化的FAD依賴的葡萄糖脫氫酶基因序列與pPICZαA質(zhì)粒通過同尾酶法構(gòu)建了含1～4拷貝表達(dá)盒表達(dá)載體,將其電擊轉(zhuǎn)入PichiapastorisX33,獲得FAD依賴的葡萄糖脫氫酶高效分泌表達(dá)重組菌株。qRT-PCR測定結(jié)果表明重組菌株所含載體的表達(dá)盒數(shù)與FAD-GDH基因的拷貝數(shù)之間存在正相關(guān)關(guān)系。試管水平,重組菌誘導(dǎo)發(fā)酵72 h,酶活達(dá)到最高,其中4拷貝的轉(zhuǎn)化子表達(dá)水平最高;選擇1拷貝和4拷貝轉(zhuǎn)化子進(jìn)行10 L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng),1拷貝菌株誘導(dǎo)108 h,酶活達(dá)到最高697.125 U/mL,4拷貝菌株誘導(dǎo)132 h,酶活達(dá)到最高1 063.279 U/mL,比1拷貝酶活提高52.52%。結(jié)果表明通過增加目的基因拷貝數(shù)策略有助于提高FAD-GDH的表達(dá)量,為其進(jìn)一步擴(kuò)大生產(chǎn)奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ),使其能夠更好地應(yīng)用于血糖檢測等方面。